Nghiên cứu khả năng sinh histamine của một số vi sinh vật chủ yếu phân lập từ chượp cá cơm trong quá trình sản xuất nước mắm cá cơm truyền thống

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ĐÀO THỊ NGÀ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH HISTAMINE CỦA MỘT SỐ VI SINH VẬT CHỦ YẾU PHÂN LẬP TỪ CHƯỢP CÁ CƠM TRONG QÚA TRÌNH SẢN XUẤT NƯỚC MẮM CÁ CƠM TRUYỀN THỐNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHÁNH HÒA - 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ĐÀO THỊ NGÀ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH HISTAMINE CỦA MỘT SỐ VI SINH VẬT CHỦ YẾU PHÂN LẬP TỪ CHƯỢP CÁ CƠM TRONG QÚA TRÌNH SẢN XUẤT NƯỚC MẮM CÁ CƠM TRUYỀN THỐNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành: Mã số: Quyết định giao đề tài: Quyết định thành lập HĐ: Ngày bảo vệ: Người hướng dẫn khoa học: TS VŨ NGỌC BỘI TS ĐỖ VĂN NINH Chủ tịch Hội đồng: Công nghệ sau thu hoạch 60540104 1694/QĐ-ĐHNT ngày 20/12/2013 226/QĐ-ĐHNT ngày 17/03/2016 16/05/2016 Khoa sau đại học: KHÁNH HÒA - 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết đề tài công trình nghiên cứu cá nhân chưa công bố công trình khoa học khác thời điểm Khánh Hòa, Ngày 26 tháng 04 năm 2016 Tác giả luận văn Đào Thị Ngà iii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành Luận văn này, Trước hết, xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Thực phẩm Khoa Sau đại học kính trọng, niềm tự hào học tập nghiên cứu Trường năm qua Sự biết ơn sâu sắc xin dành cho thầy: TS Vũ Ngọc Bội - Trưởng khoa Công nghệ Thực phẩm TS Đỗ Văn Ninh - Phó Hiệu trưởng Trường Đại học Thái Bình Dương, tận tình hướng dẫn suốt trình thực luận văn Xin chân thành cảm ơn NCS ThS Phạm Văn Đạt hỗ trợ kinh phí giúp đỡ suốt trình thực đề tài để đề tài nghiên cứu thực với chất lượng cao Xin ghi nhận tình cảm giúp đỡ học viên Trần Hoàng Cẩm Tú, Thầy Cô giáo Khoa Công nghệ Thực phẩm tập thể cán Các phòng thí nghiệm: Công nghệ Thực phẩm, Công nghệ Sinh học, Chế biến Thủy sản - Trung tâm Thí nghiệm Thực hành - Trường Đại học Nha Trang nhiệt tình tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình thực luận văn Cuối xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình tất bạn bè giúp đỡ, động viên suốt trình học tập thực đề tài Khánh Hòa, ngày 26 tháng 04 năm 2016 Tác giả luận văn Đào Thị Ngà iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN iii LỜI CẢM ƠN iv MỤC LỤC .v DANH MỤC KÝ HIỆU vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii DANH MỤC BẢNG BIỂU ix DANH MỤC HÌNH VẼ x TRÍCH YẾU LUẬN VĂN xi MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN CHUNG VỀ NƯỚC MẮM 1.1.1.Giới thiệu chung nước mắm 1.1.2.Quy trình sản xuất nước mắm gài nén Nam Trung Bộ 1.1.3.Tổng quan giá trị dinh dưỡng 1.1.4.Nguyên liệu sản xuất nước mắm vai trò ảnh hưởng chúng trình sản xuất nước mắm 1.1.5.Quá trình hình thành nước mắm 14 1.2 TỔNG QUAN VỀ HISTAMINE VÀ NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ VI SINH VẬT SINH HISTAMINE TRONG SẢN XUẤT NƯỚC MẮM CÁ CƠM TRUYỀN THỐNG 18 1.2.1.Tổng quan chung histamne 18 1.2.2.Một số nghiên cứu loại vi khuẩn sinh histamine sản xuất nước mắm cá cơm truyền thống 24 1.2.3.Tổng quan tài liệu phân lập hệ vi sinh vật sinh histamine 29 CHƯƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .33 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 33 2.2 MÔI TRƯỜNG HÓA CHẤT VÀ THUỐC THỬ 33 2.3 THIẾT BỊ, DỤNG CỤ SỬ DỤNG 36 2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37 2.4.1.Phương pháp phân tích hóa học 37 2.4.1.1 Xác định hàm lượng Histamine 37 v 2.4.2.Phương pháp phân tích vi sinh vật 37 2.4.3.Phương pháp xử lý số liệu 37 2.4.4.Phương pháp bố trí thí nghiệm 37 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 42 3.1 ĐÁNH GIÁ SỰ THAY ĐỔI MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG DỊCH CHƯỢP MẮM THEO THỜI GIAN SẢN XUẤT 42 3.1.1.Sự thay đổi chất lượng cảm quan dịch chượp theo thời gian sản xuất 42 3.1.2.Sự thay đổi số thành phần hóa học hàm lượng histamine dịch chượp theo thời gian sản xuất 45 3.2 PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT (VSV) SINH HISTAMINE HIỆN DIỆN TRONG CHƯỢP 52 3.2.1.Phân lập tuyển chọn vi sinh vật sinh histamine 52 3.2.2.Định danh vi khuẩn phương pháp giải trình tự gen 16S 59 3.3 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SẢN SINH HISTAMINE CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT ĐÃ PHÂN LẬP 62 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ .64 4.1 KẾT LUẬN 64 4.2 KHUYẾN NGHỊ 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 PHỤ LỤC vi DANH MỤC KÝ HIỆU A : Số ml AgNO3 0,1N tiêu tốn chuẩn độ; F : Hệ số pha loãng; V : Số ml mẫu đem thí nghiệm; v1, v2 : Số ml H2SO4 0,1N dùng chuẩn độ mẫu thí nghiệm mẫu trắng v1, v2 : Số ml NaOH dùng chuẩn độ mẫu thí nghiệm mẫu trắng : Thể tích mẫu nguyên v v H SO : Số ml H2SO4 dùng chuẩn độ mẫu thí nghiệm d : Nồng độ pha loãng vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT CDC : Centers for Disease Control and Prevention (Trung tâm kiểm soát phòng ngừa dịch bệnh Mỹ) CFU : Colony forming Unit (Đơn vị khuẩn lạc) HBI : Brain Heart Infusion (Môi trường dinh dưỡng HBI) HPLC: High-performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu cao) NL : Nguyên liệu ng : ngày NM : Nước mắm TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam th : tháng TNHH: Trách nhiệm hữu hạn TT-BNNPTNT: Thông tư-Bộ Nông Nghiệp Phát Triển Nông Thôn TSAH : Trypticase Soy Agar Histidine (Môi trường dinh dưỡng canh đậu nành có bổ sung Histamine) TSBH : Trypticase Soy Broth Histidine (Môi trường dinh dưỡng canh đậu nành có bổ sung Histamine) VSV : Vi sinh vật viii DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Phương pháp loại cá sử dụng chế biến nước mắm số quốc gia .3 Bảng 1.2 Hàm lượng axít amin nước mắm (mg/ml) Bảng 1.3 Thành phần chất bay nước mắm Bảng 1.4 Thành phần chất vô vitamin có nước mắm 15 -200 đạm (g N/l) Bảng 1.5 Thành phần dinh dưỡng cá cơm 11 Bảng 1.6 Thành phần hoá học phân loại muối (số gam 100 g muối) 13 Bảng 1.7 Một số loài cá phổ biến liên quan đến ngộ độc cá scombroid 21 Bảng 3.1 Đánh giá cảm quan mẫu dịch chượp mắm theo thời gian sản xuất 44 Bảng 3.2 Kết phân lập vi sinh vật sau ủ kỵ khí 370C, thời gian 10 ngày, nồng độ pha loãng mẫu từ 10-1 53 Bảng 3.3 Mức độ tương đồng trình tự nucleotide Genbank chương trình BLAST SEARCH 62 Bảng 3.4 Kết phân tích hàm lượng histamine phương pháp sắc ký 63 ix DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1 Quy trình sản xuất nước mắm truyền thống gài nén Việt Nam .5 Hình 1.2 Cá cơm nguyên liệu 10 Hình 2.1 Hình ảnh cá cơm thường (Stolephorus commersonii) 33 Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 38 Hình 2.3 Sơ đồ phân tích hàm lượng histamine 39 Hình 2.4 Sơ đồ phân tích tiêu hóa học Hình 2.5 Sơ đồ phân lập định danh vi khuẩn 41 Hình 3.1 Hình ảnh dịch chượp mắm theo thời gian sản xuất 42 Hình 3.2 Sự thay đổi pH dịch chượp theo thời gian sản xuất 46 Hình 3.3 Nồng độ muối dịch chượp mắm theo thời gian sản xuất .47 Hình 3.4 Độ acid dịch chượp mắm theo thời gian sản xuất 47 Hình 3.5 Hàm lượng đạm tổng dịch chượp mắm theo thời gian sản xuất 48 Hình 3.6 Hàm lượng đạm thối (NH3) dịch chượp mắm theo thời gian .49 Hình 3.7 Sự thay đổi hàm lượng đạm acid amin dịch chượp mắm theo thời gian sản xuất 50 Hình 3.8 Kết phân tích hàm lượng histamine mẫu dịch chượp mắm qua thời gian sản xuất GC .51 Hình 3.9 Hình thái khuẩn lạc tế bào vi khuẩn nồng độ 10 % NaCl 56 Hình 3.10 Hình thái khuẩn lạc tế bào vi khuẩn nồng độ 12 % NaCl 57 Hình 3.11 Khả sinh catalase chủng vi khuẩn 58 Hình 3.12 Tính di động chủng vi khuẩn 58 Hình 3.13 Các ống chủng vi khuẩn ủ kỵ khí 370C sau ngày môi trường TSBH 63 x TIÊU CHUẨN VIỆT NAM (TCVN) TCVN 5107 : 2003 NƯỚC MẮM Fish sauce Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn áp dụng cho sản phẩm nước mắm sản xuất từ cá muối Tiêu chuẩn viện dẫn TCVN 3215 - 79 Sản phẩm thực phẩm Phân tích cảm quan Phương pháp cho điểm TCVN 3701 - 90 Thủy sản Phương pháp xác định hàm lượng natri clorua TCVN 3705 - 90 Thủy sản Phương pháp xác định hàm lượng nitơ tổng số protein thô TCVN 3706 - 90 Thủy sản Phương pháp xác định hàm lượng nitơ amoniac TCVN 3974 - 84 Muối ăn Yêu cầu kỹ thuật TCVN 4991 - 89 (ISO 7937:1985) Vi sinh vật học Hướng dẫn chung phương pháp đếm Clostridium perfringens Kỹ thuật đếm khuẩn lạc TCVN 5276 - 90 Thủy sản Lấy mẫu chuẩn bị mẫu TCVN 5287 - 94 Thủy sản đông lạnh Phương pháp thử vi sinh vật TCVN 5685 - 92 Nước mắm - Mức tối đa hàm lượng chì phương pháp xác định Quyết định 1329/2002/BYT/QĐ “Tiêu chuẩn vệ sinh nước ăn uống” Yêu cầu kỹ thuật 3.1 Yêu cầu nguyên liệu - Cá dùng để sản xuất nước mắm phải tươi, có chất lượng phù hợp - Muối ăn, phù hợp với TCVN 3974 - 84 - Nước, theo Quyết định 1329/2002/BYT/QĐ “Tiêu chuẩn vệ sinh nước ăn uống” 3.2 Phân hạng Nước mắm phân thành 04 hạng, dựa theo độ đạm, sau: - Đặc biệt; - Thượng hạng; - Hạng 1; - Hạng 3.3 Yêu cầu cảm quan Các yêu cầu cảm quan nước mắm qui định bảng Bảng – Yêu cầu cảm quan nước mắm Yêu cầu Tên tiêu Đặc biệt Thượng hạng Hạng 1 Màu sắc Từ nâu cánh gián đến nâu vàng Độ Trong, không vẩn đục Mùi Vị Thơm đặc trưng nước mắm, mùi lạ Ngọt đậm đạm, có hậu vị Ngọt đạm, Ngọt đạm, Ngọt đạm, có hậu vị rõ có hậu vị rõ Tạp chất nhìn thấy mắt thường Hạng Không có không mặn chát 3.4 Các tiêu hoá học nước mắm, qui định bảng Bảng - Các tiêu hoá học nước mắm Mức chất lượng Tên tiêu Đặc biệt Thượng hạng Hạng Hạng Hàm lượng nitơ toàn phần, tính g/l, không nhỏ 30 25 15 10 Hàm lượng nitơ axit amin, tính % so với nitơ toàn phần, không nhỏ 55 50 40 35 Hàm lượng nitơ amôniac, tính % so với nitơ toàn phần, không lớn 20 25 30 35 Hàm lượng axit, tính g/l theo axit axetic, không nhỏ 8,0 6,5 4,0 3,0 Hàm lượng muối, tính g/l, 245 - 280 khoảng 260 - 295 3.6 Chỉ tiêu vi sinh vật nước mắm, qui định bảng Bảng - Chỉ tiêu vi sinh vật nước mắm Tên tiêu Mức tối đa cho phép Tổng số vi sinh vật hiếu khí, số khuẩn lạc ml 105 Coliforms, số khuẩn lạc ml 102 E Coli, số khuẩn lạc ml Cl.perfringens, số khuẩn lạc ml 10 S aureus, số khuẩn lạc ml Tổng số bào tử nấm men nấm mốc, số khuẩn lạc ml 10 3.7 Dư lượng kim loại nặng nước mắm Dư lượng tối đa chì có nước mắm mg/l Phụ gia Chỉ sử dụng phụ gia thực phẩm theo Qui định hành Phương pháp thử 5.1 Lấy mẫu: Theo TCVN 5276 - 90 yêu cầu sau đây: 5.1.1 Đơn vị định lấy mẫu 5.1.1.1 Đơn vị chứa có dung tích từ 000 lít trở lên, đơn vị chứa lấy mẫu ban đầu, mẫu đồng thời mẫu trung bình 5.1.1.2 Đơn vị chứa có dung tích từ 000 đến 000 lít, lấy mẫu trung bình tất đơn vị chứa 5.1.1.3 Đơn vị chứa có dung tích từ 100 đến 000 lít, số đơn vị định lấy mẫu 10 % số đơn vị chứa lô đó, không nhỏ đơn vị 5.1.1.4 Đơn vị chứa có dung tích 100 lít, số đơn vị định lấy mẫu %, không nhỏ 15 đơn vị 5.1.1.5 Trường hợp số đơn vị chứa nhóm nhỏ số đơn vị định lấy mẫu (6 15) lấy mẫu tất đơn vị chứa Đơn vị chứa có dung tích nhỏ (chai 650 ml) số lượng lại lớn mẫu ban đầu lấy nguyên chai với tỷ lệ 0,5 % đến % số đơn vị chứa lô 5.1.2 Khi lấy mẫu phải khuấy đảo lấy nhiều điểm khác nhau, khối lượng lấy mẫu ban đầu % khối lượng nước mắm chứa đơn vị chứa Tập trung mẫu lấy vào dụng cụ khô sạch, khuấy lấy 000 ml làm mẫu trung bình Trường hợp không đủ 000 ml nâng tỷ lệ mẫu lấy đơn vị định lên cho đủ 000 ml 5.1.3 Mẫu thử trung bỉnh đóng vào chai dung tích 300 ml, chai để bên giao, hai chai để bên nhận, chai để phân tích, chai để theo dõi trình bảo quản để xử lý có tranh chấp 5.1.4 Chai đựng mẫu phải khô, tráng nước mắm mẫu trung bình, niêm phong cẩn thận dán nhãn với nội dung: - Tên đơn vị sản xuất kinh doanh - Tên cấp hạng sản phẩm - Cỡ lô hàng - Ngày, tháng, năm lấy mẫu - Họ tên người lấy mẫu, bên giao bên nhận 5.2 Phương pháp thử cảm quan 5.2.1 Dụng cụ điều kiện thử cảm quan, theo TCVN 3215 - 73 Lắc chai đựng mẫu thử, mở nút chai rót từ 13 ml đến 20 ml nước mắm vào cốc thuỷ tinh không màu, khô, có dung tích 50 ml để xác định tiêu cảm quan 5.2.2 Xác định màu sắc: Khi nhận xét màu phải đặt cốc thử nơi sáng, trắng, mắt người quan sát phải phía với nguồn sáng chiếu vào mẫu thử 5.2.3 Xác định độ trong: Đặt cốc mẫu thử nguồn sáng mắt quan sát, lắc nhẹ cốc để xác định độ 5.2.4 Xác định vị: Dùng đũa thuỷ tinh chấm vào mẫu thử đưa lên đầu lưỡi để xác định vị 5.2.5 Xác định mùi: Sau rót nước mắm từ chai mẫu vào cốc, phải để yên 15 phút xác định mùi Sau dùng mẫu nước mắm để xác định tiêu cảm quan không đổ lại vào chai đựng mẫu thử không dùng để xác định tiêu khác 5.3 Phương pháp thử tiêu hoá học 5.3.1 Chuẩn bị mẫu thử Lắc chai đựng mẫu, lọc qua giấy lọc cho vào chai khô, sạch, dùng ống hút lấy xác 10 ml nước mắm lọc, chuyển vào bình định mức 200 ml thêm nước cất đến vạch múc, lắc Dung dịch sử dụng giờ, kể từ pha xong 5.3.2 Xác định nitơ toàn phần, theo TCVN 3705 - 90 5.3.3 Xác định hàm lượng nitơ amoniac, theo TCVN 3706 - 90 Hàm lượng nitơ amoniac, X, tính %, theo công thức sau: X= X NH3 X  100 XNH3 nitơ amoniac, tính gam lít; Xtp hàm lượng nitơ, tính gam lít; 5.3.4 Xác định hàm lượng axít, theo TCVN 3705 - 90 5.3.5 Hàm lượng nitơ axit amin, y, tính %, theo công thức sau: y= X AA' 100 X XAA' hàm lượng nitơ axit amin tính g/l 5.3.6 Xác định hàm lượng muối, theo TCVN 3701 - 90 5.4 Phương pháp kiểm tra vi sinh vật 5.4.1 Định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí, Coliform, E.coli, Staphylococcus aureus, theo TCVN 5287 - 90 5.4.2 Định lượng Clostridium perfringens, theo TCVN 4991 - 89 5.5 Xác định hàm lượng chì, theo TCVN 5685 - 92 Bao gói, ghi nhãn, vận chuyển 6.1 Bao gói Nước mắm phải chứa dụng cụ khô, sạch, có nắp đậy Vật liệu làm dụng cụ chứa đựng không độc, không ảnh hưởng đến chất lượng nước mắm sức khoẻ người 6.2 Ghi nhãn 6.2.1 Trên dụng cụ chứa đựng nước mắm để bày bán phải có tối thiểu thông tin hàm lượng đạm tổng số 6.2.2 Bao bì bán lẻ phải có nhãn ghi nội dung sau: - Nước mắm tên loài cá sử dụng để sản xuất nước mắm (nếu có); - Tên, địa sở sản xuất (nếu sở vừa chế biến nước mắm đóng chai) và/hoặc sở đóng chai; - Thành phần (Chỉ tiêu chất lượng): độ đạm tổng số đạm axit amin, đơn vị gN/l; - Thể tích nước mắm, đơn vị mililit, lít; - Ngày sản xuất/đóng chai, thời hạn sử dụng 6.3 Bảo quản Nước mắm phải bảo quản nơi sạch, tránh ánh nắng trực tiếp 6.4 Vận chuyển Nước mắm phải chuyên chở phương tiện sạch, hợp vệ sinh TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 8352 : 2010 THUỶ SẢN VÀ SẢN PHẨM THUỶ SẢN (XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG HISTAMINE (PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO) Fish and fishery products  Determination of histamine content  Method using high-performance liquid chromatography Lời nói đầu TCVN 8352 : 2010 Cục Chế biến, Thương mại nông lâm thuỷ sản nghề muối biên soạn, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn qui định phương pháp xác định hàm lượng histamine thủy sản sản phẩm thủy sản sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Giới hạn phát phương pháp mg/kg Nguyên tắc Histamine có mẫu thủy sản sản phẩm thủy sản tách chiết metanol Dịch chiết làm cột trao đổi anion, sau tạo dẫn xuất huỳnh quang với o-phthal aldehyt (OPT) Hàm lượng dẫn xuất histamine xác định hệ thống HPLC với detector huỳnh quang theo phương pháp ngoại chuẩn Thuốc thử vật liệu thử Chỉ sử dụng thuốc thử vật liệu thử tinh khiết phân tích, trừ có quy định khác, sử dụng nước cất loại dùng cho HPLC nước có độ tinh khiết tương đương 3.1 Metanol 3.2 Dung dịch axit HCl, 2,5 M Pha loãng 125 ml axit clohydric (HCl, đậm đặc 37 %) nước để có 500 ml 3.3 Dung dịch axit HCl, M Pha loãng 40 ml dung dịch axit HCl 2,5 M (3.2) nước để có 100 ml 3.4 Dung dịch axit HCl, 0,1 M Pha loãng 10 ml dung dịch axit HCl M (3.3) nước để có 100 ml 3.5 Dung dịch NaOH, M Hòa tan 40 g natri hydroxit (NaOH, rắn) 1000 ml nước 3.6 Dung dịch OPT Hòa tan 0,100 mg o-phthal aldehyt (OPT, 99%, bảo quản lạnh) 100 ml metanol (3.1) Dung dịch OPT bền tuần bảo quản lạnh chai sẫm màu 3.7 Dung dịch H3PO4, 1,19 M Pha loãng 121,8 ml axit phosphoric (H3PO4, đậm đặc 85 %) với nước để có 1000 ml 3.8 Các dung dịch chuẩn histamine 3.8.1 Dung dịch chuẩn gốc histamine, 1000 mg/l Hoà tan 0,165 g histamine dihydroclorua (C5H11Cl2N3, M = 184,07g/mol) axit HCl 0,1 M định mức đến 100 ml Dung dịch chuẩn gốc histamine bền tuần bảo quản lạnh 3.8.2 Dung dịch chuẩn trung gian histamine, 10 mg/l Pha loãng ml dung dịch chuẩn gốc histamine 1000 mg/l (3.8.1) với dung dịch axit HCl 0,1 M (3.4) định mức đến 100 ml Dung dịch chuẩn trung gian histamine bền tuần bảo quản lạnh 3.8.3 Các dung dịch chuẩn làm việc histamine Pha loãng 1; ml dung dịch chuẩn histamine 10 mg/l (3.8.2) dung dịch axit HCl 0,1 M (3.4) định mức đến 100 ml để dung dịch chuẩn 0,1; 0,2 0,3 mg/l Chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc phân tích 3.9 Dung dịch pha động Hòa tan 1,089 g kali dihydro phosphat rắn (KH2PO4) gần 600 ml nước Thêm 100 ml axetonitril 0,10 ml trietylamin (TEA), chỉnh pH đến 7,30  0,05 máy đo pH (4.10) Sau đó, chuyển dung dịch vào bình định mức 000 ml (4.3) định mức tới vạch nước CHÚ THÍCH: Trong trình chuẩn bị pha động, dung dịch phải lọc qua giấy lọc 0,45 m (4.6) đuổi khí bể siêu âm (4.5) trước sử dụng 3.10 Nhựa trao đổi anion, Dowex loại x 8, kích thước hạt 50 mesh đến 100 mesh loại tương đương Nhựa trao đổi anion đổ vào dung dịch NaOH M (3.5) với tỉ lệ tương ứng 15 ml NaOH/1 g nhựa Tiến hành khuấy dung dịch, để yên 30 gạn bỏ phần dung dịch Lặp lại thao tác Cuối rửa nhựa với nước Sau đó, đổ nhựa lên giấy lọc rửa nhiều lần với nước hết NaOH Nhựa bảo quản tuần nước Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường cụ thể sau: 4.1 Cân phân tích, cân xác đến 0,1 mg 4.2 Bình nón, dung tích 150 ml 4.3 Bình định mức, dung tích 50; 100 1000 ml 4.4 Pipet thủy tinh 4.5 Bể siêu âm 4.6 Giấy lọc, 0.45 m, Whatman No.1 loại tương đương 4.7 Máy nghiền, tốc độ 000 r/min đến 30.000 r/min, HEIDOLPH DIAX 900 loại tương đương 4.8 Bể điều nhiệt, trì nhiệt độ 20 0C đến100 0C, GRANT Y14 loại tương đương 4.9 Máy lắc, tốc độ 50 r/min đến 500 r/min, IKA KS 260 basic loại tương đương 4.10 Máy đo pH, đo từ đến 12 đơn vị pH, Knick 766 loại tương đương 4.11 Cột thủy tinh, có khóa teflon, dài 300 mm, đường kính 10,5 mm, đường kính 13 mm 4.12 Cột sắc ký lỏng C18, dài 50 mm, đường kính 4,6 mm, kích thước hạt: m, Licrocart loại tương đương 4.13 Hệ thống HPLC, trang bị detector huỳnh quang 4.14 Máy nghiền, sử dụng chất lỏng để đồng hóa mẫu Cách tiến hành 5.1 Chuẩn bị mẫu thử Nghiền 200 g mẫu máy nghiền (4.14) Cân 10 g mẫu nghiền, xác đến 0,1 mg cho vào bình nón 150 ml (4.2) Thêm 50 ml metanol (3.1), đồng hóa mẫu máy nghiền (4.7) Đặt bình chứa dung dịch mẫu bể điều nhiệt (4.8) nhiệt độ 60 0C 15 Sau đó, chuyển toàn sang bình định mức 100 ml (4.3); tráng bình nón metanol (3.1) Để nguội dung dịch tới nhiệt độ phòng định mức đến vạch metanol (3.1) để có 100 ml (kí hiệu V1) Lắc dung dịch lọc qua giấy lọc (4.6) Dịch chiết thu bền vài tuần bảo quản lạnh CHÚ THÍCH: Đối với mẫu nước mắm, mẫu thử chuẩn bị cách pha loãng trực tiếp 0,1 ml nước mắm với 0,9 ml metanol (3.1) ống ly tâm dung tích 1,5 ml, ly tâm lấy 0,1 ml dịch ly tâm đem làm theo 5.4.2 5.2 Chuẩn bị mẫu trắng Mẫu trắng mẫu thuỷ sản xác định không chứa histamine Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng chuẩn bị với mẫu thử theo 5.1 5.3 Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi 100 ppm Thêm xác ml dung dịch chuẩn histamine 000 mg/l (3.8.1) vào 10 g mẫu trắng nghiền Tiến hành chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi chuẩn bị với mẫu thử theo 5.1 5.4 Làm mẫu 5.4.1 Chuẩn bị cột làm Nhồi nhựa trao đổi anion chuẩn bị (3.10) vào cột thủy tinh (4.11) đến chiều cao khoảng cm giữ không để khô cột Trước sử dụng phải rửa cột thủy tinh với 10 ml nước 5.4.2 Làm mẫu Lần lượt cho ml dịch chiết thu theo 5.1, 5.2 5.3 0,1 ml nước mắm pha loãng theo 5.1 (kí hiệu V2) qua cột, rửa cột ml đến ml nước Thu dịch chảy vào bình định mức 50 ml (4.3) chứa ml dung dịch axit HCl M (3.3) Khi lớp dung dịch cách mặt lớp nhựa khoảng mm phải cho tiếp nước vào cột thu khoảng 35 ml dịch giải hấp Khóa cột định mức phần dịch giải hấp thu nước để có 50 ml (kí hiệu V3) 5.5 Tạo dẫn xuất huỳnh quang 5.5.1 Dung dịch xác định đường chuẩn Hút xác ml dung dịch chuẩn histamine làm việc (3.8.3) vào bình định mức 50 ml (4.3), thêm ml dung dịch NaOH M (3.5) vào bình lắc Sau khoảng min, thêm ml dung dịch OPT (3.6) vào bình Sau min, tiếp tục thêm ml dung dịch H3PO4 1,19 M (3.7) vào bình, định mức đến vạch dung dịch HCl 0,1 M (3.4) lắc bình Chú ý cần lắc dung dịch sau lần thêm thuốc thử, lần trình tạo phản ứng với dung dịch OPT (3.6) 5.5.2 Mẫu trắng Hút xác ml dịch chiết mẫu trắng làm (5.4.2) vào bình định mức 50 ml (4.3) Sau đó, tiến hành tạo dẫn xuất dung dịch xác định đường chuẩn theo 5.5.1 5.5.3 Mẫu xác định độ thu hồi Hút xác ml dịch chiết mẫu xác định độ thu hồi làm (5.4.2) vào bình định mức 50 ml (4.3) Sau đó, tiến hành tạo dẫn xuất dung dịch xác định đường chuẩn theo 5.5.1 5.5.4 Mẫu thử Hút xác ml dịch chiết mẫu thử làm (5.4.2) vào bình định mức 50 ml (4.3) Sau đó, tiến hành tạo dẫn xuất dung dịch xác định đường chuẩn theo 5.5.1 5.6 Tiến hành phân tích HPLC 5.6.1 Điều kiện phân tích – Cột sắc ký: cột C18 (4.12); – Nhiệt độ cột: 40 0C; – Pha động: hỗn hợp gồm: KH2PO4 , axetonitril TEA (3.9); – Tốc độ dòng : ml/min; – Bước sóng kích thích: 350 nm; – Bước sóng phát xạ: 444 nm; – Thể tích tiêm: 20 l 5.6.2 Ổn định cột sắc ký 30 chế độ làm việc 5.6.3 Tiêm dung dịch chuẩn tạo dẫn xuất huỳnh quang (5.5.1) Dựng đường chuẩn theo mối quan hệ tuyến tính diện tích píc sắc ký nồng độ Đường chuẩn phải có hệ số tương quan quy hồi tuyến tính (R2) lớn 0,99 5.6.4 Tiêm dịch chiết mẫu trắng (5.5.2),dịch chiết mẫu xác định độ thu hồi (5.5.3) dịch chiết mẫu thử (5.5.4) tạo dẫn xuất huỳnh quang vào hệ thống HPLC Mỗi dịch thực lần Tính diện tích trung bình xác định nồng độ histamine dịch chiết từ đường chuẩn Tính kết Hàm lượng histamine có mẫu thử, C, biểu thị miligam kilogam (mg/kg) tính theo công thức sau: Co : nồng độ histamine có dịch chiết mẫu (5.6.4), tính microgam mililit (g/ml); V1 : thể tích dịch mẫu thử (100 ml) định mức (5.1); V2 : thể tích dịch chiết làm (5.4.2) (1 ml dịch chiết thủy sản 0,1 ml dịch nước mắm pha loãng); V3 : thể tích dịch làm (5.4.2) chứa bình định mức (V3 = 50 ml); m : khối lượng (10 g) mẫu thử nghiền (5.1) CHÚ THÍCH: Nếu kết tính mẫu lớn 15 mg/100 g thủy sản phải pha loãng dịch chiết mẫu thực lại qui trình từ 5.4 Độ lặp lại độ thu hồi 7.1 Độ lặp lại Độ lệch chuẩn lặp lại, CVS, tính theo diện tích píc sắc ký lần tiêm dung dịch chuẩn phải nhỏ 0,5 % 7.2 Độ thu hồi Độ thu hồi mẫu, R, xác định theo lần phân tích mẫu Độ thu hồi tính phải nằm khoảng từ 90 % đến 110 % Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: a) Mọi thông tin cần thiết việc nhận biết đầy đủ mẫu thử; b) Phương pháp lấy mẫu sử dụng, biết; c) Phương pháp thử sử dụng viện dẫn tiêu chuẩn này; d) Mọi thao tác không quy định tiêu chuẩn này, điều coi tự chọn chi tiết có ảnh hưởng tới kết quả; e) Kết thử nghiệm thu PHỤ LỤC CÁC HÌNH ẢNH THÍ NGHIỆM Hình 4.1 Nấu môi trường HBI Hình 4.2 Đo pH môi trường HBI Hình 4.3 Phân tích hàm lượng NaCl mẫu dịch chượp mắm Hình 4.4 Thuần khiết khuẩn lạc Hình 4.5 Giữ chủng Hình 4.6 Thao tác cấy chủng [...]... “Nghiên cứu khả năng sinh histamine của một số vi sinh vật chủ yếu phân lập từ chượp cá cơm trong quá trình sản xuất nước mắm cá cơm truyền thống tạo tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm ức chế khả năng sinh histamine trong nước mắm từ đó nâng cao chất lượng và phục vụ nhu cầu ngày càng cao của người tiêu dùng 2 Mục tiêu nghiên cứu - Xác định khả năng sinh histamine của vi sinh vật trong quá trình. .. cơm truyền thống là cấp thiết 1 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI - Xác định khả năng sinh histamine của vi sinh vật trong quá trình sản xuất nước mắm cá cơm truyền thống - Phân lập một số chủng vi sinh vật hiện diện trong giai đoạn nước mắm có hàm lượng histamine cao NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 1) Phân tích sự thay đổi của các thành phần hóa học và hàm lượng histamine trong quá trình sản xuất nước mắm cá cơm truyền thống. .. quá trình hình thành histamine và hiểu biết về vi khuẩn trong nước mắm sinh histamine là cần thiết để từ đó cải tiến quy trình sản xuất giúp cho chất lượng nước mắm ra thị trường đáp ứng tiêu chuẩn trong nước và tiêu chuẩn của nước nhập khẩu Do vậy vi c thực hiện đề tài “Nghiên cứu khả năng sinh histamine của một số vi sinh vật chủ yếu phân lập từ chượp cá cơm trong quá trình sản xuất nước mắm cá cơm. .. Sơ bộ phân lập và định danh một số chủng vi sinh vật hiện diện trong giai đoạn nước mắm có hàm lượng histamine cao 3) Đánh giá khả năng sản sinh histamine của một số chủng vi sinh vật phân lập được Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN Ý NGHĨA KHOA HỌC Kết quả của đề tài là dẫn liệu khoa học mới về vi khuẩn sinh histamine trong nước mắm và bổ sung thêm các hiểu biết về hệ vi khuẩn trong nước mắm Do... xuất nước mắm, do vậy chất lượng của cá sẽ quyết định chất lượng của nước mắm Nước mắm chủ yếu được sản xuất từ các loại cá biển nhỏ như: cá cơm, cá nục, cá tráp, cá liệt, cá tạp… là những loài cá có giá trị kinh tế thấp Tuy nhiên, vi c sử dụng loại cá gì cho sản xuất còn phụ thuộc vào từng khu vực, từng mùa vụ khác nhau Những cơ sở sản xuất có nguồn nguyên liệu truyền thống là cá Cơm thì nước mắm thành... hưởng của chúng trong quá trình sản xuất nước mắm Nguyên liệu chính để sản xuất nước mắm là các loại cá và muối ăn 1.1.4.1 Nguyên liệu cá Nguyên liệu chính để sản xuất nước mắm theo phương pháp gài nén truyền thống thường được người dân sử dụng là các loại cá tầng nổi như cá cơm thường (hình 1.2), cá nục, cá tráp, cá liệt, cá tạp… 9 Hình 1.2 Cá cơm nguyên liệu Cá là nguyên liệu chính dùng để sản xuất nước. .. (tháng) sản xuất khác nhau - Tiếp tục nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh histamine của vi khuẩn như nguyên liệu ban đầu, điều kiện bảo quản, nồng độ muối, độ pH, nhiệt độ, quá trình lên men,… trên cơ sở đó đưa ra các giải pháp nhằm hạn chế (ức chế) sự hoạt động của các chủng vi khuẩn sinh histamine trong sản phẩm nước mắm 5 Từ khóa: Histamine, nước mắm, vi khuẩn sinh histamine trong nước mắm. .. nghiên cứu về khả năng sinh histamine của 2 chủng (Tetragenococcus halophilus và Lentibacillus juripiscarius) và thấy khi nuôi cấy các chủng vi khuẩn trên ở môi trường HEB chúng có khả năng sinh histamine với hàm lượng cao từ 451,60÷457,86 mg/L xii 4.2 Khuyến nghị: Từ các nghiên cứu ở trên cho phép kiến nghị: - Đề nghị tiếp tục nghiên cứu về khả năng sinh histamine của vi khuẩn trong chượp mắm ở từng... với khối lượng cá 1.1.5 Quá trình hình thành nước mắm 1.1.5.1 Cơ chế của quá trình hình thành nước mắm Cơ chế chung của quá trình sản xuất nước mắm là cá đem trộn với muối theo một tỉ lệ nhất định, được ướp trong điều kiện thích hợp, sau một thời gian hình thành nên nước mắm, có hương vị đặc trưng Nước mắm chính là sản phẩm của quá trình thủy phân protein thịt cá dưới tác dụng xúc tác của hệ enzyme... vật Tuy nhiên, quá trình này nhanh hay chậm và chất lượng của nước mắm có đảm bảo chất lượng và an toàn hay không còn phụ thuộc rất nhiều vào các yếu tố như bản thân nguyên liệu cá và muối; các yếu tố môi trường: Nhiệt độ, pH, vi sinh vật 1.1.5.3 Sự tham gia của vi sinh vật trong quá trình chế biến nước mắm Các vi sinh vật tồn tại trong nước mắm được chia thành 2 nhóm, nhóm vi sinh vật ưa muối có thể