Nghiên cứu khả năng kháng pepsin của một số đột biến điểm trên bề mặt phytase từ bacillus subtilis

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI =============== VŨ PHƯƠNG LIÊN NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG PEPSIN CỦA MỘT SỐ ĐỘT BIẾN ĐIỂM TRÊN BỀ MẶT PHYTASE TỪ Bacillus subtilis LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC HÀ NỘI - 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI =============== VŨ PHƯƠNG LIÊN NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG PEPSIN CỦA MỘT SỐ ĐỘT BIẾN ĐIỂM TRÊN BỀ MẶT PHYTASE TỪ Bacillus subtilis Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60.42.01.07 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS TRẦN THỊ THÚY HÀ NỘI - 2015 Lời cảm ơn! ===**=== Qua thời gian làm việc Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học – Vi sinh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội, hoàn thành luận văn thạc sĩ: “Nghiên cứu khả kháng pepsin số đột biến điểm bề mặt phytase từ Bacillus subtilis” Để hoàn thành công trình này, nhận nhiều giúp đỡ, bảo đóng góp ý kiến quý báu từ thầy cô, gia đình bạn đồng nghiệp Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Trần Thị Thúy, người dạy dỗ em trình học tập, người dìu dắt em bước đường khoa học tạo điều kiện tốt cho em trình thực nội dung nghiên cứu đề tài Em xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới thầy, cô giáo Bộ môn Công nghệ Sinh học – Vi sinh, người dạy dỗ, quan tâm, động viên khuyến khích có ý kiến đóng góp quý báu cho em trình học tập nghiên cứu Em xin chân thành cảm ơn cô Đỗ Thị Hồng – cán Bộ môn Hóa sinh Tế bào bạn nhóm nghiên cứu Sinh học phân tử tất anh, chị, em nghiên cứu sinh, học viên cao học, sinh viên Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học – Vi sinh nhiệt tình giúp đỡ chia sẻ với em suốt thời gian qua Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tình yêu thương tới gia đình, người sát cánh, động viên vượt qua khó khăn suốt thời gian học tập nghiên cứu Cảm ơn gái bé nhỏ Thùy Dương mẹ Ngoài ra, nội dung nghiên cứu luận văn tài trợ Quỹ phát triển Khoa học Công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) đề tài mã số 106.06 – 2012.86 Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn đến quỹ NAFOSTED Xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Học viên Vũ Phương Liên MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lí chọn đề tài Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Axit phytic phytate 1.1.1 Axit phytic 1.1.2 Phytate 1.2 Phytase 1.2.1 Phân loại phytase 1.2.2 Đặc tính lí hóa phytase 1.3 Phytase kiềm (β-propller phytase-BPP) từ Bacillus sp 10 1.3.1 Vài nét chi Bacillus 10 1.3.2 Phytase từ Bacillus 10 1.4 Ứng dụng phytase 12 1.5 Một số thành tựu nghiên cứu gây đột biến điểm phytase 14 1.6 Pepsin 15 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Vật liệu hóa chất 19 2.1.1 Hóa chất 19 2.1.2 Thiết bị 19 2.1.3 Chủng giống vi sinh vật 20 2.1.4 Plasmid 20 2.1.5 Môi trường nuôi cấy dung dịch đệm 20 2.2 Phương pháp nghiên cứu 21 2.2.1 Phương pháp tin sinh học 21 2.2.2 Phương pháp vi sinh 22 2.2.3 Phương pháp sinh học phân tử 23 2.2.4 Phương pháp hóa sinh 28 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Thiết kế cặp mồi mang đột biến điểm bề mặt phytase kiềm 34 3.2 Tách chiết plasmid tái tổ hợp mang gen phyC từ E coli NovaBlue 36 3.3 Sinh tổng hợp gen đột biến phản ứng PCR 38 3.4 Chuyển plasmid mang cấu trúc đột biến vào tế bào biểu E coli BL21(DE3) 39 3.5 Kiểm tra có mặt điểm đột biến gen phyC 41 3.6 Biểu phytase kiềm từ Bacillus subtilis 42 3.7 Đánh giá biểu gen phyC thông qua hoạt tính phytase 43 3.7.1 Đánh giá hoạt tính phytase tái tổ hợp biểu E coli BL21(DE3) mang cấu trúc phyC không đột biến 43 3.7.2 Đánh giá hoạt tính phytase tái tổ hợp biểu E coli BL21(DE3) mang đột biến Y143P gen phyC 44 3.7.3 Đánh giá hoạt tính phytase tái tổ hợp biểu E coli BL21(DE3) mang đột biến E189P gen phyC 45 3.7.4 Đánh giá hoạt tính phytase tái tổ hợp biểu E coli BL21(DE3) mang đột biến E297P gen phyC 46 3.8 Đánh giá tính kháng pepsin phytase kiềm đột biến 48 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 52 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Tên đầy đủ aa Axit amin Bp Base pairs cs Cộng EDTA Ethylendiamin tetra acetic acid IU International Unit Kb Kilo bases kDa Kilo Dalton LB Luria- Betani PCR Polymerase Chain Reaction Pvc Phốt phát vô SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate – Poly Arcrylamide Gel VSV Vi sinh vật DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Phân loại phytase theo Hiệp hội nhà hóa sinh học Quốc tế Bảng 1.2 Phân loại số phytase nghiên cứu Bảng 1.3 Nhiệt độ pH tối ưu số phytase Bảng 2.1 Xử lý sản phẩm PCR đột biến 24 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR tuyển chọn 27 Bảng 3.1 Các vị trí có khả bị thủy phân cao enzyme pepsin phytase kiềm từ Bacillus subtilis 34 Bảng 3.2 Các axit amin cần đột biến ba mã hóa thay 36 Bảng 3.3 Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR gây đột biến 36 Bảng Phản ứng PCR sinh tổng hợp plasmid mang đột biến gen phyC 38 Bảng 3.5 Kết cô đặc enzyme 49 Bảng 3.6 Kết thử nghiệm điều kiện tiếp xúc phytase kiềm chưa đột biến với pepsin 49 Bảng 3.7 Khả kháng pepsin cấu trúc phytase kiềm trước sau đột biến 50 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cấu tạo phân tử phytate liên kết với ion kim loại protein Hình 1.2 Phản ứng thủy phân phytate phytase Hình 1.3 Cấu trúc BPP phytase 11 Hình 1.4 Sơ đồ minh họa chế tác dụng protease với chất 16 Hình 2.1 Đồ thị chuẩn thể mối tương quan hàm lượng BSA (μg/ml) với độ hấp thụ quang A595 29 Hình 2.2 Đồ thị chuẩn thể mối tương quan nồng độ NaH2PO4 hay Pvc (mM) với độ hấp thụ quang A700 32 Hình 3.1 Minh họa điểm bề mặt phân tử 1POO có khả bị cắt pepsin phần mềm Pymol 35 Hình 3.2 Kiểm tra plasmid mang gen mã hóa phytase kiềm tách chiết từ E coli NovaBlue 37 Hình 3.3 Sản phẩm PCR sinh tổng hợp cấu trúc đột biến 39 Hình 3.4 Kết kiểm tra có mặt gen phyC dòng E coli BL21(DE3) biến nạp cấu trúc đột biến 40 Hình 3.5 Kết điện di tách mẫu plasmid mang cấu trúc đột biến 41 Hình 3.6 Kết đọc trình tự cấu trúc đột biến 42 Hình 3.7 Đồ thị sinh trưởng dòng tế bào E coli mang không mang đột biến 43 Hình 3.8 Hoạt tính phytase tái tổ hợp biểu E coli BL21(DE3) mang cấu trúc phyC không đột biến 44 Hình 3.9 Hoạt tính phytase tái tổ hợp biểu E coli BL21(DE3) mang đột biến Y143P gen phyC 44 Hình 3.10 Hoạt tính phytase tái tổ hợp biểu E coli BL21(DE3) mang đột biến E189P gen phyC 45 Hình 3.11 Hoạt tính phytase tái tổ hợp biểu E coli BL21(DE3) mang đột biến E297P gen phyC 46 Hình 3.12 Sự biểu gen phyC môi trường nuôi cấy đánh giá điện di SDS- PAGE 47 MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Phytase enzyme sử dụng phổ biến chăn nuôi nhằm loại bỏ chất kháng dinh dưỡng - phytate loại bột ngũ cốc, thành phần thức ăn chăn nuôi Phytate (myo-inositol 1,2,3,4,5,6 hexakisphosphate) hạt ngũ cốc loại hạt đậu nguồn dự trữ phốt yếu hạt (chiếm 60% tổng số phốt hạt) [33] Mặc dù đóng vai trò quan trọng trình chín, nảy mầm hạt, phytate (dạng muối axit phytic) lại tạo liên kết chặt chẽ với axit amin, protein, tinh bột khoáng kim loại quan trọng (như kẽm, sắt, canxi, magiê…) gây hiệu ứng kháng dinh dưỡng, làm giảm giá trị dinh dưỡng chất [13] Đường ruột động vật dày đơn lợn, gia cầm cá khả chuyển hóa phytate, vậy, việc bổ sung phytase vào thức ăn chăn nuôi nhằm giảm lượng axit phytic, giúp tận dụng tối đa nguồn phốt phát, ion kim loại protein sẵn có thức ăn; đồng thời giảm thiểu ô nhiễm môi trường phốt phát thải từ phân động vật nuôi [24] Phytase loại enzyme xúc tác thủy phân đặc hiệu phytate thành myo-inositol phốt phát bậc thấp gốc phốt phát vô (Pvc) tự do, giúp động vật hấp thu cách dễ dàng [24] Các phytase thương mại chủ yếu phytase axit (từ nấm mốc, nấm men vi khuẩn E coli), chúng hoạt động tốt pH thấp dày hoạt động pH trung tính kiềm ruột non, đặc biệt không chịu nhiệt độ cao [24, 49] Phytase kiềm (từ Bacillus phấn hoa số loài thực vật) hoạt động tốt môi trường trung tính kiềm ruột non; enzyme chịu nhiệt pH axit (chịu nhiệt độ cao trình ép viên thức ăn công nghiệp môi trường axit dày), nhiên, chúng hoạt động pH dày thường nhạy cảm với pepsin, loại enzyme tiêu hóa có dày [46] Do vậy, cần có nghiên cứu nhằm tăng cường đặc tính phytase kiềm cho phù hợp với ứng dụng ngành chăn nuôi (bền nhiệt, hoạt động dải pH rộng, kháng lại enzyme đường tiêu hóa động vật nuôi) Pepsin enzyme tiêu hóa quan trọng chủ đạo dày người động vật dày đơn, chúng thủy phân đặc hiệu cấu trúc dạng vòng xoắn bề mặt phân tử protein có chứa axit amin kị nước [30] Loại bỏ điểm nhạy cảm bề mặt phytase kiềm giúp nâng cao khả kháng lại pepsin cho phytase kiềm đưa chúng vào thức ăn vào đường tiêu hóa động vật nuôi Từ lí trên, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu khả kháng pepsin số đột biến điểm bề mặt phytase từ Bacillus subtilis” Mục tiêu nghiên cứu Sinh tổng hợp số cấu trúc mang đột biến điểm bề mặt phytase từ Bacillus subtilis đánh giá khả kháng pepsin phytase đột biến Nội dung nghiên cứu 1/ Tổng hợp cấu trúc ADN tái tổ hợp mã hóa phytase kiềm từ Bacillus subtilis mang điểm đột biến 2/ Tách kiểm tra plasmid tái tổ hợp mang gen mã hóa cho phytase kiềm đột biến 3/ Biến nạp plasmid tái tổ hợp mang đột biến điểm vào E coli, tiến hành biểu phytase đột biến 4/ Đánh giá hoạt tính tính kháng pepsin phytase đột biến 3.7.4 Đánh giá hoạt tính phytase tái tổ hợp biểu E coli BL21(DE3) mang đột biến E297P gen phyC Hình 3.11 Hoạt tính phytase tái tổ hợp biểu E coli BL21(DE3) mang đột biến E297P gen phyC Hoạt tính thể cấu trúc đột biến E297P tương tự cấu trúc trên, nhiên suy giảm hoạt tính enzyme hai đột biến Y143P E189P Thời gian nuôi cấy để thu hoạt độ enzyme cao (1,94 IU/ml) lúc 10 sau kích hoạt biểu gen Lượng enzyme thoát môi trường 15,5 %, xoang chu chất 19,6% cao lượng enzyme thu nội bào 64,9 % (Hình 3.11) Rõ ràng điểm đột biến gây ảnh hưởng đến việc phân bố enzyme tế bào E coli Phần lớn enzyme phytase tái tổ hợp đột biến bị giữ lại nội bào, enzyme tái tổ hợp chuyển vào xoang chu chất thoát môi trường nuôi cấy Để đánh giá ảnh hưởng điểm đột biến đến biểu protein phytase kiềm tái tổ hợp, tiến hành kiểm tra có mặt protein tái tổ hợp gen SDS-PAGE 46 Hình 3.12 Sự biểu gen phyC môi trường nuôi cấy đánh giá điện di SDS- PAGE Ghi chú: M: Thang protein chuẩn (protein standards #1610373), 1: protein đối chứng (phytase không đột biến);2a, 2b, 2c: protein cấu trúc đột biến Y143P, E189P, E297P Theo nghiên cứu Lehmann M cs phytase kiềm tái tổ hợp có trọng lượng khoảng 44 kda [22] Kết thể hình 3.12 cho thấy: băng điện di SDS- PAGE có trọng lượng đối chứng dương độ đậm băng bị thay đổi: Cấu trúc phytase chưa đột biến có vạch đậm sáng nhất, vạch cấu trúc đột biến mờ có vạch cấu trúc đột biến E297P tương đối rõ ràng Kết tương ứng với kết kiểm tra hoạt tính, chứng tỏ trình đột biến không làm ảnh hưởng đến cấu trúc hoạt tính enzyme làm ảnh hưởng đến trình biểu gen 47 Phytase có nguồn gốc từ Bacillus subtilis biểu E coli BL21(DE3) vi khuẩn gram âm, theo nghiên cứu Pugsley (1993) có ba vị trí mà enzyme có khả tiết là: môi trường, xoang chu chất nội bào chiếm ưu xoang chu chất (khoảng trống thành màng tế bào) Quá trình tiết enzyme điều khiển nhờ chuỗi tín hiệu giúp cho tiền enzyme chuyển hóa thành enzyme trưởng thành tập trung xoang chu chất thoát môi trường theo kênh khác [theo 18] Tiền enzyme chứa đoạn peptide ngắn (khoảng 15 – 30 aa), đoạn pelB, tín hiệu giúp cho enzyme tiết bên xoang chu chất Trình tự tín hiệu điển hình cấu tạo gồm đầu H-miền kỵ nước, khoảng 10 - 20 axit amin đầu N tích điện dương có khoảng - 10 axit amin Trình tự tín hiệu giàu axit amin kỵ nước (alanine, valine, leucine) giúp enzyme bám vào protein vận chuyển tăng khả tiết enzyme vị trí xoang chu chất (Pugsley 1993) Khi vận chuyển protein khỏi tế bào chất, trình tự tín hiệu phân cắt peptidase để tạo sản phẩm protein trưởng thành xoang chu chất [18] Chính lí mà phytase cấu trúc chưa đột biến lượng enzyme tập trung đa số xoang chu chất môi trường Sự thay đổi axit amin kị nước valine, leucine proline bề mặt enzyme phytase kiềm đột biến làm ảnh hưởng đến tín hiệu tiết giàu axit amin kị nước enzyme, mà phần lớn enzyme tồn chủ yếu tế bào, không chuyển xoang chu chất Tổng hoạt tính enzyme đột biến thấp ảnh hưởng trình tự peptide tín hiệu chưa loại bỏ hoàn toàn khỏi enzyme 3.8 Đánh giá tính kháng pepsin phytase kiềm đột biến Kết kiểm tra biểu phytase kiềm đột biến không đột biến dịch môi trường nuôi cấy cho thấy: chúng biểu bên môi trường dinh dưỡng sạch, nhìn thấy 01 băng protein 48 gel Vì vậy, định cô đặc enzyme dịch môi trường nuôi cấy để đánh giá tính kháng pepsin chúng Sau cô đặc, hoạt độ riêng mẫu enzyme xác định bảng 3.5 Bảng 3.5 Kết cô đặc enzyme Lượng enzyme trước cô đặc (ml) Lượng enzyme sau cô đặc (ml) Hoạt độ riêng enzyme trước cô đặc (IU/mg) Hoạt độ riêng enzyme sau cô đặc (IU/mg) (Pha loãng mẫu 10 lần) Đối chứng dương (phytase Y143P E189P E297P không mang đột biến 100 50 50 50 10 5 2,892 0,234 0,223 0,777 2,896 0,234 0,222 0,782 Trước đánh giá tính kháng pepsin phytase kiềm đột biến, thử nghiệm xác định nhạy cảm phytase kiềm không đột biến pepsin Thử nghiệm đánh giá hoạt tính phytase kiềm không đột biến sau 5, 10 phút tiếp xúc với pepsin có hoạt độ riêng khác (giữ nguyên hoạt độ riêng protein phytase kiềm 2,896 IU/mg) cho thấy enzyme phytase kiềm thể 52,7 % hoạt tính sau phút tiếp xúc với pepsin có hoạt độ riêng 0,2 IU/mg pH nhiệt độ 37⁰C (Bảng 3.6) Bảng 3.6 Kết thử nghiệm điều kiện tiếp xúc phytase kiềm chưa đột biến với pepsin Hoạt độ riêng pepsin (IU/mg) 20 0,2 Đối chứng (phytase kiềm không tác dụng pepsin) Thời gian phản ứng với pepsin (phút) 10 Hoạt tính enzyme sau thời gian phản ứng pepsin (IU/ml) 0 0 0 6,301 10,9 11,95 49 Thử nghiệm tiếp xúc với pepsin phytase kiềm đột biến lặp lại điều kiện tương tự (2,896 IU/mg phytase phản ứng với 0,2 IU/mg pepsin 37⁰C pH phút) Kết thực nghiệm phản ứng với pepsin cấu trúc đột biến trình bày bảng 3.7 đây: Bảng 3.7 Khả kháng pepsin cấu trúc phytase kiềm trước sau đột biến Cấu trúc phytase kiềm Khả kháng pepsin trước đột biến (%) Khả kháng pepsin sau đột biến (%) Y143P E189P E297P 52,7 52,7 52,7 68 67 82 Theo kết điểm đột biến Y143P làm tăng khả kháng pepsin so với cấu trúc trước đột biến 15,3%; điểm đột biến E189P làm tăng kháng so với lúc ban đầu 14,3%; điểm đột biến E297P làm tăng khả kháng pepsin cao nhất, so với cấu trúc trước đột biến khả kháng pepsin tăng 29,3% Các kết cho thấy: Tất cấu trúc đột biến điểm thiết kế có hiệu nhiều nâng cao khả kháng pepsin phytase kiềm Sự thay axit amin nhạy cảm với pepsin bề mặt phytase kiềm proline, axit amin có xác suất bị cắt pepsin thấp (0 %), nâng cao khả kháng pepsin enzyme Bảng tổng hợp xác suất (%) vị trí cắt pepsin axit amin vị trí P1-P1’ Palashoff (2008) đánh giá Proline Histidine vị trí aa bị phân cắt pepsin [30] Tuy nhiên, việc lựa chọn aa để thay vị trí nhạy cảm với pepsin trình sinh tổng hợp đột biến tùy thuộc vào vị trí xác định aa thay phân tử protein enzyme Khéo léo lựa chọn aa thích hợp để thay làm ảnh hưởng đến 50 biểu cấu trúc hoạt tính enzyme Protein enzyme bị pepsin công từ nhiều điểm phân tử nó, việc thiết kế nhiều đột biến phân tử protein enzyme việc làm cần thiết nhằm nâng cao tính kháng protein enzyme Việc đánh giá ảnh hưởng vị trí riêng biệt đến khả kháng pepsin phytase kiềm đóng góp phần hiểu biết quan để thiết kế đa điểm đột biến enzyme tương lai 51 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Qua trình thực đề tài, thu số kết sau: Đã sinh tổng hợp 03 plasmid tái tổ hợp Y143P, E189P, E297P mang điểm đột biến thay axit amin bề mặt phytase kiềm ACZ57955.1 từ Bacillus subtilis Đã biểu thành công plasmid tái tổ hợp Y143P, E189P, E297P mang điểm đột biến thay axit amin bề mặt phytase ACZ57955.1 từ Bacillus subtilis vào tế bào E coli BL21(DE3) Kết biểu cho thấy trình đột biến ảnh hưởng đến phân bố phytase tế bào E coli Phần lớn lượng enzyme bị giữ lại nội bào, enzyme tái tổ hợp chuyển xoang chu chất thoát môi trường nuôi cấy Đã xác định hoạt tính enzyme thể đột biến Y143P, E189P, E297P thấp so với cấu trúc không đột biến Hoạt tính enzyme cấu trúc không đột biến 1,7IU/ml; 1,81 IU/ml; 1,94 IU/ml với cấu trúc không đột biến 2,5 IU/ml Đã xác định cấu trúc đột biến Y143P, E189P, E297P làm tăng khả kháng pepsin so với cấu trúc không đột biến với tỉ lệ tương ứng 15,3%; 14,3% 29,3% 52 Đề nghị Tiếp tục sinh tổng hợp đánh giá tính kháng pepsin đột biến điểm vị trí khác bề mặt, không nằm bề mặt phytase kiềm từ Bacillus sutilis để chọn vị trí gây đột biến tối ưu Thiết kế đánh giá tính kháng pepsin enzyme phytase mang đa điểm đột biến Nghiên cứu hiệu hoạt động enzyme đột biến tiêu hóa hai pha in vitro 53 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu Tiếng việt Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1997), Vi sinh vật học, Nhà xuất Giáo dục, trang 25-38 Lương Đức Phẩm, Hồ Sưởng (1978), Vi sinh tổng hợp, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, trang 100- 117 Trần Quốc Việt, Ninh Thị Len (2005), “Ảnh hưởng việc bổ sung enzyme thương mại vào phần đến suất sinh trưởng hiệu sử dụng thức ăn lợn cai sữa lợn nuôi thịt”, Hội thảo khoa học lần thứ nhất, Chương trình hợp tác Việt Nam Thụy Điển, Hà Nội, tr 78-86 V.T.T Hằng, Đỗ Thị Hồng, Vũ Phương Liên, Trần Thị Thúy (2015) Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 31, Số 4S: 86-93 II Tài liệu Tiếng anh Attia, Y.A., E M A.Qota, F A M Aggoor and A K Kies, (2003) “Value of rice bran, its maximal utilization and upgrading by phytase and other enzymes and diet- formulation based on available amino acid for broiler chicks” Archiv Für Geflügelkunde Germany 67 (4):157-166 Barbosa TM et al (2005), Screening for Bacillus isolates in the broiler gastrointestinal tract, Appl Envirom Microbiol 71(2): 968- 978 Bhutta ZA, Black RE and Brown KH (1999), Prevention of diarrhea and pneumonia by zinc supplementation in children in developing countrry: pool analysis of radomized controlled trials J Pediatr 135: 689-697 Boyer PD, Lardy H, Myrback K (1960) The enzymes - Academie press Publishers Newyork - London: 3-381 Bradford MM (1976), A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein - dye binding Anal Biochem 72; 248-254 54 10 Brown KH and Solomons NW (1991), Nutritional problems of developing countries Infect Dis Clin North Am 5: 297-317 11 Erdman JW (1981), Bioavailability of trace minerals from cereals and legumes Cereal Chem 58: 21-26 12 Greiner R, Konietzny U, Jany KD (1993), Purification and chacracterization of two phytases from Escherichia coli, Arch Biochem Biophys 303: 107-113 13 Greiner et al (2002), The pathway of dephosphorylation of myo-inositol hexakisphosphate by phytate-degrading enzymes of different Bacillus spp Can J Microbiol 4848: 986–994 14 Ha NC et al (2000), Crystal structures of a novel, thermostable phytase in partially and fully calcium-loaded states, Nat Struct Biol 7: 147-153 15 Harlan BF, Morris ER (1995), Phytase: A good or a bad food component, Nutr Res 15: 733-754 16 Igbasan FA, Simon o, Miksch G, Monjner K (2001) The effectiveness of an Escherichia coli phytase in improving phosphorus and calcium bioavailabilities in poultry and young pigs Arch Anim Nutr 54: 117-126 17 Janne Kerovo (2000), A novel phytase from Bacillus, characterization and production of the enzyme, Finland, Helsinky 18 Choi JH, Lee SY (2004), Secretory and extracellular production of recombinant proteins using Escherichia coli Appl Microbiol Biotechnol 64: 625 - 635 19 Kerovuo J et el (1998), Isolation, characterization, molecular gene cloning of a novel phytase from Bacillus subtilis, Appl Environ Microbiol 64(6): 2079–2085 20 Kim YO et al (1998), Purification and properties of a thermostable phytase from Bacillus sp DS 11, Enzyme Microbiol Technol 22: 2- 55 21 Kim YO, Kim HK, Yu HH & Oh TK (1998), Cloning of the thermostable phytase gene (phy) from Bacillus sp DS11 and its overexpression in Escherichia coli, FEMS Microbiol Lett 162: 185 -191 22 Lehmann M, Kostrewa D, Wyss M, Brugger R, D’Arcy A, Pasamontes L (2000), From DNA sequence to improved functionality: using protein sequence comparisons to rapidly design a thermostable consensus phytase Protein Eng 13: 49-57 23 Lehmann M et al (2002), The consensus concept for thermostability engineering of proteins: further proof of concept Protein Eng 15: 403-411 24 Lei XG, Porres JM (2003), Phytase enzymology, applications, and biotechnology Biotech Lett 25: 1787-1794 25 Lott JNA (1984), Accumulation of seed reserves of phosphorus and other minerals In: Seed Physiology (Murray, DR, ed.), 139-166 Academic Press, New York, NY 26 Mai TH et al (2008), Efficacy of hydrolytic enzyme preparation from Aspergillus spp on the fattening broiler chicken fed with corn soybean based diets, Intern J Poultry Sci 7(10): 984-989 27 Manary MJ et al (2002), Community-based dietary phytate reduction and its effect on iron status in Malawian children, Ann Trop Paediatr 22: 133-136 28 Mullaney EJ et al (2002), Site-directed mutagenesis of Aspergillus niger NRRL 3135 phytase at residue 300 to enhance catalysis at pH 4.0 Biochem Biophys Res Commun 297: 1016-1020 29 Oh BC et al (2001), Calcium-dependent catalytic activity of a novel phytase from Bacillus amyloliquefaciens DS11”, Biochem 40: 9669 - 9676 30 Palashoff MH (2008), Determining the specificity of pepsin for proteolytic digestion Chemistry master thesis at Northeastern University 31 Pasamonte LJ, Haiker M, Wyss M, Tessier M & Loon APGM (1997), Gene cloning, purification and characterisation of heat stable phytase from fungus Aspergillus fumigatus, Appl Environ Microbiol 63: 1696 – 1700 56 32 Powers JC et al (1976), Substrate specificity of porcine pepsin, Adv Experiment Med Biol 95: 141-159 33 Reddy NR, Pierson MD, Sathe SK, Salunkhe DK (1989), Phytates in cereals and legumes, Boca Raton Florida CRC Press Inc: 218-227 34 Reddy VA et al (2008), Chimeric gene construct coding for bifunctional enzyme endowed with endoglucanase and phytase activities, Arch Microbiol 191: 171–175 35 Rodriguez E, Han Y, Lei XG (1999), Cloning, sequencing, and expression of an Escherichia coli acid phosphatase/phytase gene (appA2) isolated from pig colon, Biochem Biophys Res Commun 257: 117-123 36 Rodriguez E, Wood ZA, Karplus PA, Lei XG (2000), Site-directed mutagenesis improves catalytic efficiency and thermostability of Escherichia coli pH 2.5 acid phosphatase/phytase expressed in Pichia pastoris Arch Biochem Biophys 382: 105-112 37 Salvadó JMV, López JAG, Treviño JGC, Galván MC, Domínguez AR and Olazarán MG (2010), Design and overproduction of thermostable beta-propeller phytases in Pichia pastoris with a broad pH activity range Appl Environ Microbiol 76(19): 6423–6430 38 Sambrook J, Russell D W (2001), Molercular cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 1,2: 1.31-1.38; 8.18-8.30 39 Sharpley AN et al (1994), Managing agricultural phosphorus for protection of surface waters: Issues and options J Environ Qual 23:437-451 40 Shimizu M (1992), Purification and characterization of phytase from Bacillus subtilis (natto) N-77 Biosci Biotechnol Biochem 56: 1266-1269 41 Stahl CH, Roneker KR, Thornton JR and Lei XG (2000), A new phytase expressed in yeast effectively improves the bioavailability of phytase phosphorus to weaning pigs, Am Soc Animal Sci 78: 668- 674 57 42 Tomschy A et al (2002), Engineering of phytase for improved activity at low pH, Appl Environ Microbiol 68: 1907-1913 43 Tomschy A et al (2000), Optimization of the catalytic properties of Aspergillus fumigatus phytase based on the three-dimensional structure Protein Sci 9: 1304-1311 44 Tran TT, Hashim SO, Gaber Y, Mamo G, Mattiasson B and Hatti-Kaul R (2011), Thermostable alkaline phytase from Bacillus sp MD2: effect of divalent metals on activity and stability J Inorg Biochem 105: 1000 -1007 45 Tran TT, Mamo G, Buxó L, Le NN, Gaber Y, Mattiasson B and HattiKaul R (2011), Site-directed mutagenesis of an alkaline phytase: Influencing specificity, activity and stability in acidic milieu Enzyme Microb Technol 49: 177-182 46 Tran TT, Mamo G, Mattiasson B and Hatti-Kaul R (2010), A thermostable phytase from Bacillus sp MD2: cloning, expression and high-level production in Escherichia coli J Ind Microbiol Biotechnol 37: 279-287 47 Tye AJ, Siu FKY, Leung TYC and Lim BL (2001), Molecular cloning and the biochemical characterization of two novel phytases from B subtilis 168 and B licheniformis, Appl Microbiol Biotechnol 59: 190-197 48 Konietzny U, Greiner R (2004), Bacterial phytase: potential application, in vivo function and regulation of its synthesis, Braz J Microbiol 35:11-18 49 Vats P, Banerjee UC (2004), Production studies and catalytic properties of phytases (myo-inositolhexakisphosphate phosphohydrolase): an overview Enzyme Microb Technol 35: 3-4 50 Wodzinski RJ, Ullah AHJ (1996), Phytase, Adv Appl Microbiol, 42: 263-302 51 Wyss M et al (1999), Biophysical characterization of fungal phytases (myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolases): molecular size, glycosylation pattern, and engineering of proteolytic resistance Appl Environ Microbiol 65: 359-366 III Trang Web: 52 http://www.aaes.auburn.edu/comm/pubs/highlightsonline/spring99/phyta se.html 58 53 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi 54 www.genomics.agilent.com 55 http://www.helmholtz-muenchen.de/fileadmin/PEPF/pET_vectors/pET22b_map.pdf 59 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Kết đọc trình tự – T7 – promotor : cấu trúc đột biến Y143P – T7 – promotor : cấu trúc đột biến E189P 11 – T7 – terminator : cấu trúc đột biến E297P Phụ lục 2: Bài báo tác giả đước đăng tạp chí [...]... tăng độ bền của enzyme trong môi trường axit (Ở pH 2,6, sau 3 giờ ủ thì hoạt tính của phytase đột biến E227S vẫn giữ được trên 80% trong khi đó enzyme không đột biến thì chỉ giữ được khoảng 40% hoạt tính ban đầu) [45] Đó là những nghiên cứu bước đầu về đột biến điểm nhằm thay đổi đặc tính và hoạt động của enzyme phytase kiềm; chưa có một nghiên cứu nào nhằm nâng cao khả năng kháng pepsin của phytase, ... và tính ổn định của enzyme trong môi trường axit Các đột biến này được thực hiện trên bề mặt xúc tác của enzyme (P257R, E180N, E229V và S283R) và một số điểm ở gần trung tâm hoạt động (K77R, K179R và E227S) Kết quả của nghiên cứu này chỉ ra rằng với các điểm đột biến E229V và S283R làm tăng hoạt động của enzyme lên 19% và 13% ở pH 2,6 - 3 Đột biến E227S đã thay đổi pH hoạt động tối ưu của enzyme đến... kém bền ở nhiệt độ cao do đó gây cản trở trong việc chế biến thức ăn công nghiệp [28, 36, 43] Để nâng cao tính bền nhiệt của phytase axit, hàng loạt các nghiên cứu đã được tiến hành, trong đó có nghiên cứu đột biến điểm trên phytase có nguồn gốc từ nấm mốc Aspergillus fumigatus của Lehmann và cs [22, 23] Nghiên cứu này đã thành công trong việc làm tăng tính chịu nhiệt của enzyme lên 15 – 26oC so với phytase. .. đột biến mà vẫn bảo toàn được hoạt tính của phytase Đột biến điểm thay thế Gly - 277 và Tyr - 282 trên phytase từ A fumigatus bằng các gốc tương ứng Lys và His của phytase A niger đã làm thay đổi pH hoạt động của enzyme này [42, 43] Năm 2000, để nâng cao được hiệu quả xúc tác và tính chịu nhiệt của axit phosphatase (appA) có nguồn gốc từ Escherichia coli, Rodriguez và cs đã tiến hành gây đột biến điểm. .. so với ban đầu Phytase của một số vi sinh vật có nhiệt độ tối ưu rất cao như: phytase từ Schwanniomyces castelii là 77°C, từ Bacillus sp MD2 là 73°C [46], từ Bacillus amyloliquefaciens DS11 là 70°C [21] pH tối ưu của phytase nằm trong khoảng từ 2,2 đến 8,0 Đối với vi sinh vật pH tối ưu của phytase trong khoảng 4,5 – 5,6 (ở nấm) Phytase của 8 A fumigatus có phổ pH tối ưu khá rộng pH từ 4,0 – 7,3 Đối... phosphatase 7 phyC Bacillus subtilis Beta-propeller phytase 8 TS-phy Bacillus amyloliquefaciens Beta-propeller phytase 9 168phyA Bacillus subtilis 168 Beta-propeller phytase 7 1.2.2 Đặc tính sinh lí, sinh hóa của phytase Phytase từ vi nấm, E coli, Klebsiella terrigena, Bacillus subtilis đã được xác định là các enzyme đơn phân tử Kích thước phân tử của phytase từ vi khuẩn thường dao động trong khoảng từ 35 đến... với xác suất cắt lần lượt là 30% và 29%) nằm gần trung tâm hoạt động của enzyme này [4] Những nghiên cứu trên là tiền đề cho các nghiên cứu đột biến điểm thay thế các vị trí axit amin nhạy cảm với pepsin bằng các axit amin có tần suất bị cắt bởi pepsin thấp như proline, histidine; từ đó nâng cao được khả năng kháng pepsin của protein (phytase) , giúp chúng qua được pha ruột non và thể hiện tốt hoạt tính... bởi pepsin từ 50 71%, trong đó không có vị trí nào nằm trên bề mặt phân tử ACZ57955.1; trong số 18 vị trí có xác suất cắt ≥40% thì có 10 vị trí nằm trên bề mặt phân tử ACZ57955.1 Các vị trí cắt có tần suất thấp hơn (từ 20-30%) đa phần lại nằm trên bề mặt phân tử protein [4] Trong số các điểm cắt với xác suất  20%, không có vị trí nào nằm trong trung tâm hoạt động của phytaza kiềm ACZ57955.1; có hai điểm. .. phytase kiềm (0,1M Tris-HCl, 5mM CaCl2, pH 7) Dung dịch đệm cho pepsin: 0,2 M KCl – HCl, pH 2 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp tin sinh học 2.2.1.1 Thiết kế các cặp mồi mang đột biến điểm trên bề mặt phytase từ Bacillus subtillis a Tìm kiếm cấu trúc bậc 3 của phytaze kiềm bằng công cụ Blast http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi và 3D viewer [53] Dựa vào trình tự của phytase kiềm (mã số. .. ra, phytase còn được nghiên cứu sử dụng dể loại bỏ phytate 13 trong thực phẩm, sản xuất các dẫn xuất myo-inositol phốt phát cho công nghiệp dược, loại bỏ phytate trong công nghiệp sản xuất giấy [17] 1.5 Một số thành tựu nghiên cứu gây đột biến điểm trên phytase Các sản phẩm phytase thương mại trên thị trường hiện nay đều là các phytase axit (HAP – Histidine acid phosphatase), chúng có nguồn gốc từ E