Thạc sỹ sinh học biểu hiện và tiết enzym nattokinase tái tổ hợp ở bacillus subtilis

Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ Biểu tiết Enzym Nattokinase tái tổ hợp Bacillus subtilis ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN HOÀNG THỊ KHÁNH HỒNG BIỂU HIỆN VÀ TIẾT ENZYM NATTOKINASE TÁI TỔ HỢP Ở BACILLUS SUBTILIS Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS LÊ THỊ THÚY ÁI THÀNH PHỐ HỐ CHÍ MINH – 2012 Luận văn Thạc sĩ Sinh học MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT i Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ DANH MỤC CÁC BẢNG iii DANH MỤC CÁC HÌNH iv MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 BỆNH NGHẼN MẠCH DO HUYẾT KHỐI 1.1.1 Khái niệm huyết khối 1.1.2 Tình hình nghẽn mạch huyết khối 1.1.3 Cơ chế hình thành huyết khối 1.1.4 Sự phân hủy huyết khối enzym nội sinh plasmin 1.1.5 Các nhân tố điều trị bệnh nghẽn mạch huyết khối 1.2 NATTOKINASE 12 1.2.1 Nguồn gốc, đặc tính Nattokinase 12 1.2.2 Cơ chế phân hủy fibrin Nattokinase 14 1.2.3 Sinh tổng hợp sản xuất Nattokinase 15 1.2.4 Tình hình nghiên cứu sản xuất Nattokinase tái tổ hợp nước 17 1.3 CÁC HỆ THỐNG VECTOR BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRONG TẾ BÀO VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS 19 1.3.1 Biểu gen tế bào vật chủ E coli Bacillus subtilis 19 1.3.2 Hệ thống biểu dựa vector sát nhập 20 1.3.3 Hệ thống biểu dựa vector plasmid có khả tự chép 25 1.4 HỆ THỐNG TIẾT CỦA BACILLUS SUBTILIS 27 Luận văn Thạc sĩ Sinh học CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 VẬT LIỆU 29 2.1.1 Dụng cụ 29 2.1.2 Thiết bị 29 2.1.3 Hóa chất 30 2.1.4 Môi trường 33 2.1.5 Vật liệu sinh học 34 2.2 PHƯƠNG PHÁP 37 2.2.1 Phân lập Bacillus subtilis từ mẫu sản phẩm Natto 37 2.2.2 Phương pháp thử nghiệm khả phân hủy fibrin người 38 2.2.3 Tách chiết genom vi khuẩn Bacillus subtilis 38 Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ 2.2.4 Thu nhận gen aprE phản ứng PCR 39 2.2.5 Tinh sản phẩm khuếch đại gen aprE 40 2.2.6 Thu nhận plasmid phương pháp SDS kiềm 40 tái tổ hợp mang gen mã hóa cho proteinα2.2.7 Tạo dòng tế bào E coli DH5 Nattokinase vector pBluescript II KS (+) 41 tái tổ hợp mang gen mã hóa cho proteinα2.2.8 Tạo dòng tế bào E coli DH5 Nattokinase hệ thống vector pAX01 43 tái tổ hợp mang gen mã hóa cho proteinα2.2.9 Tạo dòng tế bào E coli DH5 Nattokinase hệ thống vector pBG01 46 hóa biến nạp sản phẩm nối vào tế α2.2.10 Chuẩn bị tế bào khả nạp E coli DH5 48 αbào khả nạp E coli DH5 2.2.11 Tinh chế sản phẩm cắt qua cột 49 2.2.12 Chuẩn bị tế bào khả nạp Bacillus subtilis biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả nạp B subtilis 49 Luận văn Thạc sĩ Sinh học 2.2.13 Tạo dòng tế bào Bacillus subtilis có mang plasmid biểu pAX01 chứa gen aprE 50 2.2.14 Tạo dòng tế bào Bacillus subtilis có mang plasmid biểu pBG01 chứa gen aprE 52 2.2.15 Biểu gen aprE hệ thống pAX01 Bacillus subtilis 53 2.2.16 Biểu gen aprE hệ thống pBG01 Bacillus subtilis DB104 54 2.2.17 Phân tích protein biểu SDS-PAGE 54 2.2.18 Phương pháp xác định hoạt tính Nattokinase 55 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC CHỦNG BACILLUS SUBTILIS NATTO TỪ SẢN PHẨM NATTO 56 3.2 PHÂN TÍCH ĐA DẠNG GEN MÃ HÓA SUBTILISIN VÀ CHỌN TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA ĐẠI DIỆN 59 3.2.1 Tách chiết DNA gen Bacillus sp phân lập từ Natto 59 3.2.2 Thu nhận gen mã hóa Nattokinase 60 Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ 3.2.3 Tạo dòng tế bào E coli mang gen aprE 61 có mang plasmid chứa gen aprE 61α3.2.3.1 Sàng lọc dòng tế bào E coli DH5 có mang plasmid chứa gen aprEα3.2.3.2 Sàng lọc dòng tế bào E coli DH5 phương pháp PCR 61 có mang plasmid chứa gen aprEα3.2.3.3 Kiểm tra dòng tế bào E coli DH5 phương pháp cắt enzym cắt hạn chế 63 3.2.3.4 Giải trình tự gen aprE, nhận định tuyển chọn gen mã hóa thích hợp cho Nattokinase 64 Luận văn Thạc sĩ Sinh học 3.3 DÒNG HÓA GEN aprE VÀO CÁC VECTOR ĐƯỢC CẤU TRÚC CHO BIỂU HIỆN Ở BACILLUS 68 3.3.1 Hệ thống biểu pAX01 68 3.3.2 Hệ thống biểu pBG01 72 3.4 TẠO CÁC DÒNG BACILLUS SUBTILIS MANG CASSET BIỂU HIỆN NATTOKINASE TÁI TỔ HỢP 74 3.4.1 Sát nhập casset biểu gen aprE kiểm soát Pxyl vào gen chủng Bacillus subtilis 75 3.4.2 Dòng hóa casset biểu gen aprE kiểm soát Pgrac vào gen chủng Bacillus subtilis DB104 78 3.5 KIỂM TRA SỰ BIỂU HIỆN CỦA PROTEIN TÁI TỔ HỢP NATTOKINASE 80 3.5.1 Kiểm tra biểu gen aprE kiểm soát Pxyl 80 3.5.2 Kiểm tra biểu gen aprE hệ thống pBG01 83 3.6 KIỂM TRA HOẠT TÍNH ENZYM NATTOKINASE TÁI TỔ HỢP 85 3.6.1 Kiểm tra hoạt tính sơ 85 3.6.2 Xác định hoạt độ phân hủy fibrin 86 CHƯƠNG : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN 88 4.2 ĐỀ NGHỊ 88 TÀI LIỆU THAM KHẢO 89 PHỤ LỤC 93 Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ Luận văn Thạc sĩ Sinh học -iDANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT Amp APC bp dH O dNTP DNA EDTA EGTA Ery GRAS Kb kDa LB LS MCS Neo OD PAI-1 pB PCR Rnase SD Amp icillin Activated Protein C base pair Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ distilled water DeoxyriboNucleotide Triphosphate DeoxyriboNucleic Acid Ethylene Diamine TetraAcetic Acid Ethylene Glycol Tetraacetic Acid Erythromycin Generally recognized as safe organism Kilobaze kilo Dalton Luria – Bertani Linsmaier - Skoog Multicloning site Neomycin Optical Density Plasminogen Activator Inhibitor pBluescript II KS (+) Polymerase chain reaction RiboNuclease Shine - Dalgarno Kháng sinh ampicillin Protein hoạt hóa C Cặp baze Nước cất Các loại axít nucleotid Axít deoxyribonucleic Kháng sinh erythromycin Vi sinh vật an toàn Trọng lượng kDa Môi trường LB Môi trường LS Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ Vị trí tạo dòng Kháng sinh neomycin Mật độ quang học Chất kìm hãm hoạt hóa plasminogen Plasmid pB Phản ứng PCR Enzym Rnase Trình tự gắn ribosom Luận văn Thạc sĩ Sinh học - ii SDS SDSPAGE SK Spec TE tPA TAE u-PA X-gal S odium D odecyl S ulphate SDS-PolyAcrylamide Gel Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ Electrophoresis Streptokinase Spectinomycin Tris-EDTA tissue Plasminogen Activator Tris-Acetic acid- EDTA urokinase Plasminogen Activator 5-bromo-4 chloro-3 indolyl-beta-Dglactoside Dung dịch SDS Điện di SDS-PAGE Thuốc chống đông máu Kháng sinh spectinomycin Dung dịch TE Chất hoạt hóa plasminogen mô Dung dịch đệm chạy điện di TAE Chất hoạt hóa plasminogen urokinase Luận văn Thạc sĩ Sinh học - iii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Các yếu tố đông máu Bảng 2.1 Thành phần môi trường HS 33 Bảng 2.2 Thành phần môi trường LS 34 Bảng 2.3 Các trình tự mồi sử dụng luận văn 36 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR 39 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng cắt plasmid pB EcoRV 42 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng nối pB aprE 43 Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ Bảng 2.7 Thành phần phản ứng cắt kiểm tra pB-aprE BamHI 43 Bảng 2.8 Thành phần phản ứng cắt plasmid pAX01 gen aprE BamHI 45 Bảng 2.9 Thành phần phản ứng cắt plasmid pAX01 gen aprE SacII 45 Bảng 2.10 Thành phần phản ứng nối 45 Bảng 2.11 Thành phần phản ứng cắt plasmid pBG01 gen aprE BamHI XbaI 47 Bảng 2.12 Thành phần phản ứng nối 47 Bảng 3.1 So sánh hoạt độ phân hủy fibrin dịch ngoại bào chủng Bacillus 87 Luận văn Thạc sĩ Sinh học - iv DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Cơ chê hình thành huyết khối Hình 1.2 Sự hoạt hóa tác động lẫn yếu tố đông máu Hình 1.3 Cơ chế phân hủy fibrin in-vivo Hình 1.4 Sản phẩm Natto 13 Hình 1.5 Cơ chế phân giải fibrin in-vivo Nattokinase 14 Hình 1.6 Sơ đồ vector sát nhập chứa promoter xylA sử dụng luận văn 23 Hình 1.7 Sự sát nhập pAX01 vào DNA Bacillus subtilis nhờ trao đổi đồng dạng locus lacA 24 Hình 1.8 Sơ đồ vector biểu pBG01 sử dụng luận văn 26 Hình 2.1 Sơ đồ vector pBluescript II KS (+) 35 Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ Hình 2.2 Thang chuẩn DNA 1kb protein 37 Hình 2.3 Chương trình PCR thu nhận gen aprE 40 Hình 3.1 Sản phẩm Natto dùng phân lập thử nghiệm hoạt tính sơ 57 Hình 3.2 Các dạng khuẩn lạc Bacillus phân lập từ sản phẩm Natto 58 Hình 3.3 Kết thử nghiệm nhanh hoạt tính phân hủy fibrin người chủng phân lập sau ủ 59 Hình 3.4 DNA gen chủng Bacillus sp phân lập từ sản phẩm Natto sản phẩm khuếch đại gen aprE gel agarose 1% 60 Hình 3.5 Kết sàng lọc dòng tế bào E coli DH5 α có mang pB-aprE phản ứng PCR 62 Hình 3.6 Kết sàng lọc 12 dòng tế bào E coli DH5 α có mang pB-aprE tương ứng phản ứng PCR, mẫu plasmid 63 Luận văn Thạc sĩ Sinh học -vHình 3.7 Kết đại diện chọn dòng tế bào E coli DH5 α có mang pB- aprE enzym cắt hạn chế BamHI 64 Hình 3.8 Trình tự peptide trưởng thành gồm 275 amino acid Nattokinase 65 Hình 3.9 So sánh phần trình tự nucleotide gen aprE chủng phân lập với trình tự chuẩn 66 Hình 3.10 Trình tự codon mã hóa gen aprE khuyết cytosine vị trí 437 66 Hình 3.11a Trình tự gen aprE chủng B2 cho thấy có khác biệt nucleotide so với aprE công bố 67 Hình 3.11b Một phần trình tự mã hóa gen aprE chủng B2 so sánh với Nattokinase cho thấy khác biệt vị trí quan trọng Valin 298 (tương ứng vị trí 193 Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ trường thọ cho người Nhật Nattokinase (còn gọi Subtilisin natto) serine protease chiết tách từ sản phẩm lên men đậu tương với vi khuẩn Bacillus subtilis natto Enzym có khả làm tan đặc hiệu fibrin protein dạng sợi cấu trúc nên huyết khối Hơn nữa, Nattokinase hỗ trợ tăng cường sản sinh Plasmin (enzym thể sản sinh làm tan huyết khối bám chặt nội mạc) Nattokinase thực mạnh thuốc làm tan huyết tụ thông thường khác Urokinase, Streptokinase, tissue Plasminogen Activator (tPA) Tuy nhiên, Urokinase Streptokinase có tính đặc hiệu thấp với fibrin, hiệu dùng đường tiêm tĩnh mạch thường không hiệu động mạch bệnh nhân đột quỵ đau tim chai cứng nhiều vị trí t-PA thể hoạt tính phân hủy fibrin mạnh t-PA có giá thành cao thời gian bán phân hủy ngắn thể Nattokinase có hoạt tính phân hủy huyết tụ cao gấp lần Plasmin, thực nghiệm cho thấy Nattokinase phân cắt plasminogen activator inhibitor type (PAI-1) dẫn tới việc loại bỏ hiệu cấu trúc huyết khối thể Nattokinase chứng minh có hiệu điều trị lâm sàng không gây phản ứng phụ Luận văn Thạc sĩ Sinh học -2Từ trước đến nay, Nattokinase thu nhận chủ yếu đường lên men bán rắn chủng Bacillus subtilis natto chất đậu nành nấu chín hay lên men dịch thể Thực Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ tế, Nattokinase ly trích từ chất hay môi trường lỏng thường có hàm lượng không cao hoạt tính ổn định Vì thực nghiệm cho thấy tổng hợp Nattokinase tự nhiên Bacillus subtilis natto phức tạp đạt mức độ giới hạn Hay nói cách khác, cách tiếp cận thường hiệu kèm công nghệ lên men hoàn hảo với thông số nghiên cứu tối ưu hóa Tuy nhiên, công nghệ thường công bố Theo thống kê, nhu cầu sản phẩm Nattokinase ngày tăng cao thị trường Nhật Bản Đài Loan Ở nước phát triển Trung Quốc Việt Nam, người dân bắt đầu quan tâm sử dụng Trong nước, công ty dược phẩm bắt đầu cho sản phẩm từ Nattokinase với nguyên liệu ngoại nhập chủ yếu từ Nhật Bản với giá thành cao Việc tìm kiếm nguồn nguyên liệu Nattokinase có hoạt tính ổn định giá phù hợp định hướng nhiều công ty nước Do vậy, việc tìm hiểu thu nhận nguồn gen mã hóa Nattokinase tốt từ chủng Bacillus natto xây dựng hệ thống tái tổ hợp tiếp cận mở triển vọng cho công nghệ sản xuất thu nhận Nattokinase hoạt tính cao nhằm làm nguyên liệu cho dược phẩm, thực phẩm chức Trong khuôn khổ luận văn, thực nội dung sau: Phân lập chủng Bacillus subtilis natto từ mẫu sản phẩm Natto có nguồn gốc từ Nhật• Bản Thu nhận gen mã hóa Nattokinase từ chủng phân lập phương pháp PCR• Dòng hóa gen mã hóa Nattokinase trình tự tiết tự nhiên vào hệ thống vector• khác Escherichia coli Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ Biến nạp vector tái tổ hợp vào chủng Bacillus subtilis DB104.• Điện di phân tích biểu ngoại bào Nattokinase tái tổ hợp.• Luận văn Thạc sĩ Sinh học Chương VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP Vật liệu phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học - 29 2.1 VẬT LIỆU 2.1.1 Dụng cụ Một số dụng cụ phòng thí nghiệm Vi sinh sau: que cấy, que trải, đèn l), đầu típ loại,µl, 100-1000µl, 20-100µl, 10-100µcồn, eppendorf, pipetman (0,5-10 ống đong, ống falcon loại, bình tam giác, cốc thủy tinh, ống nghiệm thủy tinh, đĩa petri, tăm vô trùng, bình tia, thùng đá, giấy thấm, kéo, kẹp, thấm, không thấm, giấy bạc, găng tay cao su, đồng hồ bấm giây… 2.1.2 Thiết bị - Bộ điện di ngang DNA Horizon 58 (Life Technology) - Hộp soi đèn tử ngoại Hoefer (UVTM – 19 – 230V) Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ - Bộ điện di protein (Biorad) - Máy ly tâm lạnh Mikro 22R (Hettich Zentrifugen) - Máy đo quang phổ Ultrospec 2000 - Máy đo quang phổ chuyên dụng GenQuantpro (Amersham Biosciences) - Máy lắc ổn nhiệt (Stualrt Scientific) - Máy chụp hình gel Imagemaster VDS (Amersham Biosciences) - Nồi hấp khử trùng Autoclave (SS325-TOMY) - Máy điều nhiệt theo chu kì Eppendorf Mastercycler Personal - Máy Vortex (IKA, Mỹ) - Máy đo pH (Orion, Anh) - Tủ ấm Memmert (Đức), Tủ sấy Memmert (Đức) - Tủ cấy vô trùng Class II (Mỹ) - Bể ổn nhiệt (Memmert) - Cân kỹ thuật Ohaus (Mỹ), Cân phân tích Precica (Thụy Sỹ) - Máy khuấy từ gia nhiệt Bibby (Anh ) - Tủ mát o C (Nhật ), Tủ lạnh -20 o C (Nhật ) Vật liệu phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học - 30 2.1.3 Hóa chất Các hóa chất sử dụng luận văn bao gồm: a) Hóa chất dùng cho tách chiết DNA vi khuẩn - Lysis buffer: 0,1M NaCl, 0,05M EDTA, pH 8,0 - Dung dịch SDS 10%, - Lysozym 20mg/ml, Proteinase K 20mg/ml - Phenol bão hòa TE, pH 8,0 - Chloroform, Sodium acetat 3M - Ethanol 99% lạnh (giữ -20 o C), Ethanol 70% lạnh (giữ -20 o Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ C) - Dung dịch TE: Tris-HCl 10mM pH 8,0, EDTA 1mM pH 8,0 b) Hóa chất dùng cho tách chiết plasmid từ vi khuẩn - Dung dich I: glucose 50mM, Tris-HCl 25mM pH 8,0, EDTA 10mM pH 8,0 - Dung dịch II (pha trước dùng): SDS 10%, NaOH 5N - Dung dịch III: glacical acetic acid 0,2M, CH COOK 0,2M pH 4,8 - RNase 10mg/ml - Phenol bão hòa TE, pH 8,0 - Chloroform, Sodium acetat 3M - Ethanol 99% lạnh (giữ -20 o C), Ethanol 70% lạnh (giữ -20 o C) - Dung dịch TE: Tris-HCl 10mM pH 8,0, EDTA 1mM pH 8,0 c) Hóa chất dùng cho phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) - PCR buffer Taq DNA polymerase 10X - PCR buffer DeepVent DNA polymerase 10X - Dung dịch MgCl , MgSO 25mM - dNTP 8mM - Mồi aprE-F-BamHI, aprE-R-SacII, E-anh-R, pAX01-F-seq, pMTL-R - Nước cất hai lần (ddH2O) Vật liệu phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học - 31 d) Hóa chất dùng cho điện di gel agarose - Agarose (Sigma), Safe View - Ethidium bromide 10mg/ml, - Dung dịch điện di TAE 50X (242g Tris, 57,1g acetic acid băng, 100ml EDTA Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ 500 mM lít) - Dung dịch nạp mẫu DNA 6X (orange G 0,2%, xylene cyanol 0,05%, bromophenol blue 0,09%, glycerol 60% EDTA 60mM) e) Hóa chất dùng cho điện di SDS-PAGE - Dung dịch tạo gel polyacrylamide 12,5%: gel polyacrylamide 100x100x0,75mm nồng độ 12,5% polyacrylamide có thành phần sau: + Gel phân tích 12% (4 gel): nước cất 4,46ml, Tris-HCl 1,5M (pH 8,8) 3,95ml, lµl SDS 10%, 79µ30% Acrylamide/Bisacrylamide 0,8% 7,1ml, 157,5 l TEMEDµammonium persulfate 10%, 7,9 + Gel gom 4% (4 gel): nước cất 3,5ml, Tris-HCl 0,5M (pH 6,8) 1,625ml, 30% l ammoniumµl SDS 10%, 15µAcrylamide/Bisacrylamide 0,8% 2,264 ml, 75 l TEMEDµpersulfate 10%, - Dung dịch điện di 5X: Tris-HCl 15,1g, glycine 94g, SDS 5g, nước cất đủ 1000ml, pH 8,3 - Dung dịch nạp mẫu 5X: Tris-HCl 0,3M, SDS 10,28%, glycerol 36%, DTT 0,6M, bromophenol blue 0,012%, pH 6,8 - Dung dịch nhuộm gel: coomassie brilliant blue 0,625g, ethanol tuyệt đối 112,5ml, glacical acetic acid 25ml, nước cất đủ 250ml - Dung dịch giải nhuộm: glacical acetic acid 100ml, ethanol tuyệt đối 100ml, nước cất đủ 1000ml f) Hóa chất dùng cho phản ứng cắt hạn chế - Enzym: BamHI, SacII, HindIII, EcoRV, EcoRI, XbaI - Buffer Blue 10X, Green 10X, Red 10X Vật liệu phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học - 32 g) Hóa chất dùng cho tinh chế phản ứng PCR phản ứng cắt - Chloroform, Sodium acetat 3M - Ethanol 99% lạnh (giữ -20 o C), Ethanol 70% lạnh (giữ -20 o C) h) Hóa chất dùng cho phản ứng nối Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ - Enzym T4 DNA ligase - Buffer ligation 10X - ATPase, PEG i) Hóa chất dùng cảm ứng biểu gen - Xylose 25%, IPTG 100mM - Dung dịch TE, Tris 1M - Enzym lysozym - TCA 100% - Ethanol tuyệt đối lạnh, Ethanol 70% lạnh j) Kháng sinh Ampicillin, Spectinomycin, Erythromycin, Neomycin, Chloramphenicol k) Hóa chất làm tế bào khả nạp E coli DH5 α - Glycerol 50% (hấp riêng) (giữ o C) - CaCl 1M (hấp riêng) (giữ o C) - Hỗn hợp dung dịch CaCl 0.1M Glycerol 15% vô trùng (giữ o C) l) Hóa chất cho xác định hoạt tính Nattokinase - Tris-HCl 1M (pH 7,8) - Fibrin heo 0.12% - TCA 0,1M Vật liệu phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học - 33 2.1.4 Môi trường Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ a) Môi trường LB (Luria – Bertani) - Thành phần môi trường lỏng sau: 1,0% trypton, 0,5% cao nấm men, 0,5% NaCl - Môi trường LB thạch: bổ sung 2% agar LB lỏng - Môi trường LB-Amp: bổ sung kháng sinh ampicillin môi trường LB để có g/mlµnồng độ cuối 100 - Môi trường LB-Spec: bổ sung kháng sinh spectinomycin môi trường LB để g/mlµcó nồng độ cuối 100 - Môi trường LB-Ery: bổ sung kháng sinh erythromycin môi trường LB để có g/mlµg/ml, 1µnồng độ cuối 100 - Môi trường LB-Neo: bổ sung kháng sinh neomycin môi trường LB để có g/mlµnồng độ cuối 15 - Môi trường LB-Cm: bổ sung kháng sinh chloramphenicol môi trường LB để g/mlµcó nồng độ cuối 10 b) Môi trường thử hoạt tính tan fibrin Thành phần môi trường: agarose 2% w/v, fibrinogen 0,6% w/v, đệm phosphate 50 mM, thrombin (10 NIH unit/ml) c) Môi trường HS (môi trường làm tế bào khả nạp Bacillus subtilis) Thành phần Thể tích sử dụng MgSO 1M 10 µ l 10X-S-base, Mg 2+ 10ml Glucose 20% 2,5ml L-tryptophan 0,1% 5ml Casein 2% 1ml B ảng 2.1 Thành ph Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ ần môi tr ờng H S Vật liệu phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học - 34 Cao nấm men 10% 5ml Arginin 8% + Histidin 0,4% 10ml Nước cất vô trùng hai lần (ddH O) 66,5ml Tổng thể tích 100ml Hấp khử trùng thành phần 121 o C, 15 phút, riêng L-tryptophan hỗn hợp Arginin + Histidin lọc khử trùng, không hấp Thành phần 10X-S-base, Mg• 2+ : (NH4) SO4 2,0g, K HPO4 14,0g, KH PO4 6,0g, Natrium citrate 1,0g Cho nước vào đủ 100ml, đem hấp khử trùng 121 o C, 15 phút Sau bổ sung thêm 0,1ml MgSO 1M hấp khử trùng riêng Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ d) Môi trường LS (môi trường dùng biến nạp tế bào Bacillus subtilis) Thành phần Thể tích sử dụng 10X-S-base, Mg 2+ 10ml Glucose 20% 2,5ml L-tryptophan 0,1% 0,5ml Casein 2% 0,5ml Cao nấm men 10% 1ml MgCl 1M 0,25ml CaCl 1M (cho sau cùng) 0,25ml Nước cất vô trùng hai lần (ddH O) 85ml Tổng thể tích 100ml 2.1.5 Vật liệu sinh học a) Chủng vi sinh vật sử dụng [F- endA1 hsdR17 (rk/mk-) sup E44 thi l- recA1α- Chủng Escherichia coli DH5 gyrA96 DlacU169 (f80lacZDM15)] (Takara) sử dụng làm tế bào chủ để nhân plasmid Bảng 2.2 Thành phần môi trường LS Vật liệu phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học - 35 - Chủng vi sinh vật dùng để biểu vector tái tổ hợp mang gen mục tiêu aprE: + Bacillus subtilis 1012 dùng làm tế bào chủ biểu protein tái tổ hợp vector pAX01 + Bacillus subtilis DB104 [his, nprR2, nprE18, aprED3](Bacillus Gentics Stock Centre at Ohio) dùng làm tế bào chủ biểu protein tái tổ hợp vector pAX01 pBG01 Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ b) Plasmid - Plasmid pBluescript II KS (+) sử dụng làm vector dòng hóa, mang gen kháng kháng sinh Amp R -β, gen lacZ mã hóa cho 146 acid amin đầu N enzym galactosidase, vùng MCS chèn vào gen lacZ, cho phép dòng hóa gen mục tiêu vào vector pBluescript II KS (+) (Hình 2.1) - Plasmid pAX01 sử dụng làm vector dòng hóa vector biểu gen mục tiêu Plasmid có kích thước 7781bp chứa promoter xylA cảm ứng xylose -galactosidase tương ứngβTrên plasmid có đoạn trình tự lacA mang gen mã hóa cho enzym với vùng lacA gen Bacillus subtilis, mang gen kháng kháng sinh Amp R (chọn lọc Hình 2.1 Sơ đồ vector pBluescript II KS (+) Vật liệu phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học - 36 cho tế bào E coli erythromycin Ery R Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ (chọn lọc cho B subtilis) Sơ đồ đặc điểm plasmid pAX01 trình bày Hình 1.6 Plasmid pBG01 vector biểu protein dựa vector plasmid có khả tự chép Đặc điểm plasmid trình bày Hình 1.8 c) Mồi Các mồi sử dụng phản ứng khuếch đại gen, tạo dòng giải trình tự thiết kế Phòng thí nghiệm Bộ môn Vi sinh, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh có trình tự sau: Tên mồi Trình tự nucleotide Mục đích sử dụng aprE-FBamHI CATGGATCCAGAATGAGAAGCAAAAAATTG TGGATC Khuếch đại gen aprE aprE-RSacII CATCCGCGGTTATTGTGCAGCTGCTTG TACGTT pAX01F-seq GTTTATTGGATAAACAAACTAAC Giải trình tự gen aprE aprE-Rseq GCGGAACTCATGGCACTAATTGTC pMTL-R Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ GGTATAAACTTTTCAGTTGCAGACAAAGAT Kiểm tra diện gen aprE pBG01 T3 AATTAACCCTCACTAAAGGG Kiểm tra diện gen aprE pBluescript T7 GTAATACGACTCACTATAGGGC d) Thang chuẩn DNA protein - Thang kb (Fermentas, Đức), Ladder, # SM0311/2/3 Bảng 2.3 Các cặp mồi sử dụng luận văn Vật liệu phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học - 37 - Thang phân tử lượng protein (Low weigh molecular, LWM) (Amersham Bioscience) e) Các kít Bộ kít (EZ – 10 Spin Columm DNA gel Extration Kit Bio Basis INC) dùng để tinh chế DNA thu nhận từ gel agarose, quy trình tinh thực qua bước: làm tan gel, hấp thu DNA cột, rửa dung ly để thu nhận DNA Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ Trường hợp cần tinh chế sản phẩm PCR, hỗn hợp PCR sau phản ứng bơm vào cột tinh chế DNA (EZ – 10 Spin Column PCR purification Kit Bio Basis INC), ly tâm rửa, DNA giữ lại cột Sau dung ly thu nhận DNA tinh 2.2 PHƯƠNG PHÁP 2.2.1 Phân lập Bacillus subtilis từ mẫu sản phẩm Natto Các bước thực bao gồm: - Lấy hạt đậu từ mẫu Natto hòa với 9ml nước cất vô trùng l dịch pha loãng trải lên đĩa LBµ- Hút 100 - Ủ đĩa 37 o C qua đêm, sau quan sát dạng khuẩn lạc mọc đĩa Hình 2.2 Thang chuẩn DNA 1kb protein Vật liệu phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học - 38 - Lấy khuẩn lạc có hình dạng đặc trưng ria lại đĩa LB mới, ủ 37 o C qua đêm Tiến hành lặp lại thu khuẩn lạc riêng rẽ, đồng - Dùng que cấy vòng cấy khuẩn lạc lên đĩa thạch chứa Ủ 37 o C qua đêm Quan sát vòng phân giải tiến hành chọn lọc dòng có khả phân hủy fibrin mạnh để tiến hành nuôi cấy cho thí nghiệm sau 2.2.2 Phương pháp thử nghiệm khả phân hủy fibrin người Hoạt tính thủy phân fibrin xác định theo phương pháp Astrup Mullertz cải tiến (Choi et al., 2004): 10ml hỗn hợp agarose (2% w/v) fibrinogen (0,6% w/v) đệm 50mM phosphate pH 7,4 Thêm 100µl dung dịch Thrombin (10 NIH unit/ml) khuấy đều, đổ dung dịch agarose vào đĩa petri, ổn định nhiệt độ phòng Tạo lỗ đường kính 4mm lớp agarose, 50µl dịch môi trường nuôi cấy Bacillus phân lập chuyển Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ vào lỗ, ủ -18 37 o C Nhận diện sơ hoạt tính theo diện tích vòng phân hủy fibrin [40] 2.2.3 Tách chiết genom vi khuẩn Bacillus subtilis Các bước tiến hành sau: - Nuôi cấy qua đêm chủng vi khuẩn Bacillus subtilis 20ml môi trường LB, lắc tốc độ 180 vòng/phút, 37 o C - Cho dịch nuôi cấy vi khuẩn vào ống falcon loại 50ml (hoặc loại 15ml), ly tâm 5.000 vòng/phút thời gian phút, nhiệt độ phòng - Thu rửa tế bào 10ml lysis buffer (0,1M NaCl, 0,05M EDTA, pH 8,0) ly tâm Sau đó, huyền phù lại 2ml lysis buffer l) lysozym nồng độ 20mg/ml, ủ thời gian 30 phút,µl (hoặc 100µ- Thêm 25 nhiệt độ 37 o C l proteinase K 20mg/ml, tiếp tục ủ 37µl SDS 10% 10µ- Thêm 200 o C 15 phút [...]... 3.26 Phân tích Nattokinase tái tổ hợp ngoại bào từ 2,5 ml dịch môi trường nuôi cấy chủng B subtilis DB104 ở trường hợp kiểm soát bởi Pxyl 82 Hình 3.27 Phân tích Nattokinase tái tổ hợp ngoại bào từ 2,5 ml môi trường nuôi cấy chủng B subtilis DB104 ở trường hợp kiểm soát bởi P Sgrac 84 Hình 3.28 Phân tích Nattokinase tái tổ hợp nội bào ở Bacillus subtilis DB104 ở trường hợp kiểm soát bởi P Sgrac 85 Hình... liệu và phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học - 35 - Chủng vi sinh vật dùng để biểu hiện vector tái tổ hợp mang gen mục tiêu aprE: + Bacillus subtilis 1012 được dùng làm tế bào chủ biểu hiện protein tái tổ hợp bằng vector pAX01 + Bacillus subtilis DB104 [his, nprR2, nprE18, aprED3] (Bacillus Gentics Stock Centre at Ohio) được dùng làm tế bào chủ biểu hiện protein tái tổ hợp bằng các vector pAX01 và pBG01... gen mã hóa Nattokinase từ các chủng phân lập bằng phương pháp PCR• Dòng hóa gen mã hóa Nattokinase cùng trình tự tiết tự nhiên vào các hệ thống vector• khác nhau ở Escherichia coli Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ Biến nạp vector tái tổ hợp trên vào chủng Bacillus subtilis DB104.• Điện di phân tích sự biểu hiện ngoại bào của Nattokinase tái tổ hợp. • Luận văn Thạc sĩ Sinh học Chương... trong nước Do vậy, việc tìm hiểu và thu nhận nguồn gen mã hóa Nattokinase tốt từ các chủng Bacillus natto và xây dựng hệ thống tái tổ hợp là tiếp cận mở ra triển vọng cho công nghệ sản xuất và thu nhận Nattokinase hoạt tính cao nhằm làm nguyên liệu cho dược phẩm, thực phẩm chức năng Trong khuôn khổ luận văn, chúng tôi thực hiện các nội dung như sau: Phân lập chủng Bacillus subtilis natto từ 4 mẫu sản phẩm... enzym với vùng lacA trên bộ gen của Bacillus subtilis, mang gen kháng kháng sinh Amp R (chọn lọc Hình 2.1 Sơ đồ vector pBluescript II KS (+) Vật liệu và phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học - 36 cho tế bào E coli và erythromycin Ery R Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ (chọn lọc cho B subtilis) Sơ đồ đặc điểm của plasmid pAX01 được trình bày ở Hình 1.6 Plasmid pBG01 là vector biểu hiện. .. mồi aprEF/pMTL-R 73 Hình 3.18 Plasmid tái tổ hợp pBG01-aprE cắt với HindIII 74 Hình 3.19 Kết quả sàng lọc chủng Bacillus subtilis 1012 khả nạp trên 2 đĩa môi trường có bổ sung kháng sinh 76 Hình 3.20 Kết quả kiểm tra chủng B subtilis DB104 khả nạp bằng phản ứng PCR khuẩn lạc với mồi pAX01-F/aprE-R 77 Luận văn Thạc sĩ Sinh học - vi Hình 3.21 Kết quả kiểm tra chủng B subtilis DB104 khả nạp bằng phản ứng... nghệ peptide trưởng thành) 68 Hình 3.12 Sơ đồ các bước tạo dòng gen aprE vào hệ thống pAX01 trong Bacillus subtilis 1012, DB104 69 Hình 3.13 Kết quả dòng hóa ở E coli DH5 α 70 Hình 3.14 Kết quả kiểm tra sự dòng hóa aprE bằng PCR khuẩn lạc, cặp mồi pAX01F/aprE-R 71 Hình 3.15 Plasmid tái tổ hợp cắt với EcoRV 71 Hình 3.16 Sơ đồ các bước tạo dòng gen aprE vào hệ thống pBG01 trong Bacillus subtilis DB104... 3.29 Kết quả thử khả năng phân giải fibrin của dịch ngoại bào ở chủng B subtilis DB104 mang pBG01-aprE được cảm ứng IPTG sau 2 giờ ủ 86 Luận văn Thạc sĩ Sinh học MỞ ĐẦU Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ Luận văn Thạc sĩ Sinh học -1Ngày nay, tỉ lệ bệnh nghẽn mạch (như chứng nhồi máu cơ tim hay nhồi máu não) đang tăng cao ở một số nước châu Á như Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc, Việt Nam,... thọ cho người Nhật Nattokinase (còn gọi là Subtilisin natto) là một serine protease được chiết tách từ sản phẩm lên men đậu tương với vi khuẩn Bacillus subtilis natto Enzym này có khả năng làm tan đặc hiệu fibrin là một protein dạng sợi cấu trúc nên huyết khối Hơn nữa, Nattokinase còn hỗ trợ tăng cường sản sinh ra Plasmin (enzym do cơ thể sản sinh làm tan huyết khối bám chặt nội mạc) Nattokinase thực... Hình 3.22 Kết quả sàng lọc chủng Bacillus subtilis DB104 khả nạp trên đĩa môi trường có bổ sung kháng sinh chloramphenicol 79 Hình 3.23 Kết quả kiểm tra sự dòng hóa aprE bằng PCR khuẩn lạc, cặp mồi aprEF/pMTL-R 79 Hình 3.24 Kết quả kiểm tra sự dòng hóa aprE bằng PCR với bản mẫu là các plasmid tái tổ hợp, cặp mồi aprE-F/pMTL-R 80 Hình 3.25 Phân tích Nattokinase tái tổ hợp ngoại bào từ 5 ml dịch môi trường ... Thạc sĩ Sinh học - 35 - Chủng vi sinh vật dùng để biểu vector tái tổ hợp mang gen mục tiêu aprE: + Bacillus subtilis 1012 dùng làm tế bào chủ biểu protein tái tổ hợp vector pAX01 + Bacillus subtilis. .. vector tái tổ hợp vào chủng Bacillus subtilis DB104.• Điện di phân tích biểu ngoại bào Nattokinase tái tổ hợp. • Luận văn Thạc sĩ Sinh học Chương VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP Vật liệu phương pháp Luận văn Thạc. .. CHO BIỂU HIỆN Ở BACILLUS 68 3.3.1 Hệ thống biểu pAX01 68 3.3.2 Hệ thống biểu pBG01 72 3.4 TẠO CÁC DÒNG BACILLUS SUBTILIS MANG CASSET BIỂU HIỆN NATTOKINASE TÁI TỔ HỢP 74 3.4.1 Sát nhập casset biểu