Phân lập bacillus subtilis TH2 từ natto, tạo chế phẩm lên men natto và thử nghiệm sản xuất natto từ đậu tương

1 MỤC LỤC MỞ ĐÀU PHẰNI TỔNG QUAN TÀI LIỆU .6 I ĐẬU TƯƠNG VÀ CÁC SẢN PHẨM TỪ ĐẬU TƯƠNG Nguồn gốc tình hình sử dụng đậu tương giới Thành phàn lợi ích đậu tương .7 2.1 Thành phần chất dinh dưỡng đậu tương 2.2 Tác dụng đậu tương 10 2.2.1 Cung cấp protein 10 2.2.2 Ngăn chặn ung thư 10 2.2.3 Ngăn chặn chứng loãng xương 10 2.2.4 Lợi ích nông nghiệp 11 Một số sản phẩm sản xuất từ đậu tương 12 3.1 Các sản phẩm truyền thống từ đậu tương 12 3.2 Một số sản phẩm protein đậu tương 13 3.3 Sản phẩm dậu nành 14 II NATTO- SAN PHẨM LÊN MEN TỪ ĐẬU TƯƠNG 14 III LỢI ÍCH CỦA NATTO * 15 1.Giá trị dinh dưỡng Natto 15 Lợi ích Natto 16 2.1 Ngăn chặn bệnh đau tim, đột quỵ tình trạng suy nhược thể 16 2.2 Ngăn chặn bệnh ung th .17 2.3 Ngăn chặn chứng loãng xương 19 2.4 Tác dụng kháng khuẩn 19 2.5 Cải thiện khả tiêu hóa ngăn chặn rối loạn ruột .20 2.6 Ngăn chặn lão hoá béo phì 20 2.7 Giúp phát triển trí não 20 Đặc điểm Natto cách khắc phục .21 IV VI KHUẨN LÊN MEN NATTO ,ế 23 Phân loại vi khuẩn 23 Đặc điểm hình thái 23 Đặc điểm sinh lý 23 ứng dụng 24 V CÁC SẢN PHẲM TRÊN THỊ TRƯỜNG 25 Sản phẩm bột Natto để hoạt hóa đường ruột 25 Sản phẩm Nattokinaza 25 Sản phẩm Natto 27 PHÀN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 28 I ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN c ứ u 28 II HÓA CHẤT 28 III THIẾT B Ị .29 IV CÁC KĨ THUẬT SỬ DỤNG TRONG ĐỀ TÀI .29 Phân lập giống vi sinh vật khiết 29 Phương pháp định tên vi sinh v ậ t 30 TkìỂT7Ku ý 'H ằng Đ áv\ tố t ngKiẬp 2.1 Nguyên tắc phương pháp 30 2.2 Phương pháp 30 2.2.1 Hình dạng vi khuẩn 30 2.2.2 Hình thái khuẩn lạc 30 2.2.3 Khả tạo catalaza .30 2.2.4 Khả lên men đường môi trường lỏng .31 2.2.5 Khả phân giải gelatin 31 2.2.6 Khả sử dụng tinh bột ta n 32 2.2.7 Khả đồng hoá xitrate 32 Xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp cho vi khuẩn 33 3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy phát triển vi sinh vật .33 3.2 Anh hưởng thành phần dinh dưỡng đến hoạt động sống vi sinh vật .ễ; ! .33 3.2.1 Ảnh hưởng NaCl đến phát triển vi sinh vật 33 3.2.2 Ảnh hưởng glucoza đến phát triển vi sinh vật .34 3.3 Thay đổi pH môi trường trình phát triển vi sinh v ậ t 34 Phương pháp tạo chế phẩm lên men Natto 34 4.1 Tạo chế phẩm 34 4.2 Bảo quản chế phẩm lên men Natto 34 4.3 Nghiên cứu đặc tính chế phẩm 35 4.3.1 Xác định độ ẩm chế phẩm lên men N atto 35 4.3.2 Xác định số lượng vi sinh vật ứong chế phẩm xác định tỷ lệ tế bào sống 35 Quy trình sản xuất N atto 37 5.1 Vật liệu 37 5.1.1 Kích thước 37 5.1.2 Màu sắc 38 5.1.3 Ảnh hưởng chất lượng đậu tương tới chất lượng Natto thành phẩm T 38 5.2 Thiết b ị 39 5.3 Phương pháp 39 5.3.1 Ngâm đậu tương 39 5.3.2 Hấp chín đậu tương 39 5.3.3 Chuẩn bị giống 40 5.3.4 Lên men .40 5.3.5 Tàng trữ 40 Đặc tính cảm quan sản phẩm 40 PHẦN i l l KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41 Phân lập vi khuẩn TH2 từ Natto 41 Định tên vi khuẩn TH2 41 Xác định đặc điểm sinh lý, sinh hoá Bacillus subtiỉis TH2 44 Sản xuất chế phẩm vi sinh vật lên men N atto 51 Thử nghiệm quy trình lên men thu Natto từ chế phẩm vi sinh 54 KẾT LUẬN 57 TkìỂ~Cl\uỵ ■Hằng Đ áv\ tố t ngKiẬp ĐÈ NGHỊ 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 TkìỂ~Cl\uỵ ■Hằng Đ áv\ tố t ngKiẬp MỞ ĐẦU Thực phẩm lên men xuất từ lâu đời Các sản phẩm làm phong phú thêm văn hoá ẩm thực mà góp phàn cung cấp cho người chất dinh dưỡng dạng họrp chất đơn giản dễ tiêu thụ Nhưng lợi ích chúng không đơn giản cung cấp dinh dưỡng mà nhiều thực phẩm, đặc biệt thực phẩm lên men mang lại cho người thể khoẻ mạnh nhờ thành phàn có tác dụng tăng cường sức khoẻ, chống lại bệnh tật tác dụng y học khác Từ bao đời người đặc biệt dân cư Châu Á quen thuộc với sản phẩm từ đậu tương đậu phụ, tương, tào phớ, chao, miso, kinema, douchi, natto, tempeh, thua nao Các sản phẩm không cung cấp nhiều chất dinh dưỡng lại rẻ tiền sẵn có Một tác dụng khác chúng đặc biệt quan trọng chúng có lợi cho sức khoẻ nhờ việc cung cấp cho thể hợp chất hoá học, sinh học có tác dụng ngăn ngừa bệnh tật Bên cạnh đậu tương loại kinh tế, dễ trồng đất bạc màu, cho suất cao, điều kiện chăm sóc không phức tạp, lại có khả cố định đạm làm cho đất đai màu mỡ Trong số sản phẩm lên men từ đậu tương có lẽ Natto, loại thực phẩm lên men truyền thống có nguồn gốc từ Nhật Bản, nghiên cứu nhiều Qua người ta tim từ Natto chất có lợi cho sức khoẻ người mà chưa có thực phẩm thay Ở Nhật Natto gọi phomat đậu tương ăn truyền thống ưa thích Nó thường ăn vào bữa sáng với cơm ăn “tốn cơm” Trong Natto có có chứa số enzym Nattokinase enzym tiêu biểu Enzym bác sĩ Dr.Hiroyuki Sumi đại học Chicago phát vào năm 1991 ông nghiên cứu gàn 200 loại thực phẩm có tác dụng bệnh tim mạch Sau phát Nattokinaza nhà khoa học tiến hành nhiều nghiên cứu sâu từ tìm nhiều tác dụng khác Natto Sản phẩm mang lại ảnh hưởng có lợi cho hệ tim mạch, hệ tiêu hoá giúp ngăn chặn số bệnh tim mạch, ung thư, chứng loãng xương; trì cho người tiêu dùng thể khoẻ mạnh; giảm bớt tác hại gây ảnh hưởng lão hoá béo phì Ngoài tác dụng mặt y học, hàm lượng protein cao sản phẩm hứa hẹn đem lại nhiều lợi ích cho người đặc biệt dân cư sống nước phát triển, nơi mà nhu càu protein người cao mà khả cung cấp lại hạn chế Với tác dụng to lớn Natto ngày sử dụng phổ TkìỂ~Cl\uỵ ■Hằng Đ áv\ tố t ngKiẬp biến giới vừa thực phẩm giàu dinh dưỡng, vừa thực phẩm chức Tại Việt Nam, Natto có mặt thị trường với sản phẩm nhập từ Nhật Bản Tuy chưa nhiều người biết đến nhờ hiệu mà mang lại, Natto chắn t ó nên phổ biến việc sản xuất Natto để cung cấp cho thị trường nước hứa hẹn đem lại giá trị kinh tế không nhỏ Và với sản phẩm từ đậu tương dầu ăn, sữa đậu nành, đậu phụ, tương, ễ thi việc sử dụng Natto làm tăng nhu càu, quy mô trồng tiêu thụ đậu tương nước ta, đóng góp vào phát triển nông nghiệp với phát triển kinh tế trước hết cho người nông dân trồng đậu tương Với lợi ích mặt kỉnh tế xã hội mà Natto mang lại việc phân lập vỉ sinh vật từ Natto để tạo chế phẩm lên men Natto, ứng dụng vào tạo sản phẩm thiết thực em thực đề tài: “ Phân lập Bacillus subtìlis TH2 từ Natto, tạo chế phẩm lên men Natto thử nghiệm sản xuất Natto từ đậu tương” TkìỂ~Cl\uỵ ■Hằng Đ áv\ tố t ngKiẬp PHẦN I TỎNG QUAN TÀI LIỆU IỄĐẬU TƯƠNG VÀ CÁC SẢN PHẨM TỪ ĐẬU TƯƠNG Nguồn gốc tình hình sử dụng đậu tương giói Đậu tương loại ngũ cốc có hàm lượng protein cao Chúng có nguồn gốc từ Châu Á sử dụng rộng rãi ứên giới nhiều loại thực phẩm Từ ngàn đời cư dân nước Châu Á đặc biệt Trung Quốc Nhật Bản sử dụng nhiều sản phẩm thực phẩm có nguồn gốc từ đậu tương Các sản phẩm ưa thích sử dụng phổ biến hàm lượng protein cao, giá thành rẻ, sẵn có có tác dụng trì sức khoẻ cho người tiêu dùng Trong vài thập kỉ trở lại nhà khoa học Phương Tây cố gắng để tìm hiểu người Phương Đông lại gặp vấn để với bệnh ung thư ung thư vú, ung thư tiền liệt tuyến, ung thư ruột kết, ung thư trực tràng, bệnh loãng xương, bệnh tắc nghẽn mạch máu Sau nhiều nghiên cứu, kết cho thấy khoa học chứng minh tác dụng đậu tương có đựơc thành phàn đậu tương sản phẩm chứng có chứa số chất hoá học, vitamin chất có hoạt tính sinh học hữu ích Tuy có nguồn gốc tò nước Châu Á 45% diện tích sản xuất tương ứng với 55% sản lượng đậu tương giới sản xuất Mỹ với sản lượng 75 triệu (năm 2000) [27] Ngoài Mỹ, nước sản xuất đậu tương lớn giới bao gồm Brazil , Argentina, Trung Quốc Ấn Độ Hiện sản lượng sản xuất đậu tương ngày tăng nguồn protein thực vật vô quan trọng sống người Chúng sử dụng rộng rãi to n g chế biến thực phẩm, nguồn nguyên liệu dồi để sản xuất dầu nành, thức ăn cho động vật, chế biến sản phẩm sữa thực vật, nguồn cung cấp nhiên liệu sinh học Đậu tương loại hạt có hàm lượng protein cao loại thực vật với hàm lượng 30% Ngoài chứa nhiều axit amin cần thiết vitamin khoáng chất Các sản phẩm từ đậu tương nguồn thực phẩm quan trọng đời sống với dân cư Châu Á Trải qua hàng nghin năm sử dụng người ta phát minh nhiều cách chế biến đậu tương Nhờ mà ngày chứng ta có số TkìỂ~Cl\uỵ ■Hằng Đ áv\ tố t ngKiẬp lượng phong phú sản phẩm từ đậu tương Các sản phẩm truyền thống bao gồm bột đậu tương, sữa đậu, đậu phụ; Các sản phẩm đậu tương lên men Thua nao (Thái Lan), Kinema (Ấn Độ, Nêpal), Natto, tempeh, shoyu, miso (Nhật), Đậu phụ lên men (Trung Quốc), Chao (Việt Nam); Các sản phẩm đậu tương tách chiết thu protein, có hàm lượng protein cao, nguyên liệu để tạo thành sản phẩm giả thịt, cung cấp protein phục vụ cho người ăn chay với số lượng ngày tăng giới Dầu thực vật sản phẩm tách chiết tò đậu tương nhờ hàm lượng lipit cao Đậu tương nguồn cung cấp dầu thực vật dồi sản lượng đậu tương sản xuất hàng năm giới lớn Từ đậu tương người ta sản xuất sữa đậu nành, loại sữa thực vật giúp giảm hàm lượng cholesterol cho người sử dụng ngày phổ biến Công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc sử dụng đậu tương làm nguyên liệu giá thành chất lượng hợp lý 2ẺThành phần lọi ích đậu tương Đậu tương nguồn protein hoàn hảo chứa số lượng đáng kể amino axit càn thiết cho thể mà người tự tổng hợp Trong nghiên cứu họ đậu, đậu tương có hàm lượng axit phytic, axit hữu cơ, vitamin c khoáng chất Ca, Mg, Fe, K, p, Zn cao Các chất tồn chủ yếu tong mô tế bào đặc biệt ừong hạt [18] Một thành phàn quan trọng đậu tương cho có tác dụng chữa bệnh hợp chất Isoflavones, dạng Phytoestrogen nghiên cứu nhà dinh dưỡng bác sĩ Các hợp chất cho ngăn chặn số bệnh ung thư, loại bệnh mà chưa có thuốc điều trị đặc hiệu Nhờ tác dụng mà đậu tương thu hút nhiều ý nhà khoa học nhằm tim thêm hợp chất có ích khác [19] Bên cạnh tác dụng mặt dinh dưỡng y học, đậu tương sử dụng rộng rãi loại dễ trồng, cho suất cao, phát triển loại đất cằn cỗi Không nhờ vi khuẩn nốt sàn có tong rễ mà đậu tương có khả cố đinh đạm Điều có tác dụng việc cải tạo độ màu mỡ cho đất trồng Chính nhờ tác dụng mà đậu tương thường trồng xen canh vụ mùa để tận dụng đất đai nhàn rỗi, cung cấp cho đất lượng đạm định từ N2 ừong tự nhiên TkìỂ~Cl\uỵ ■Hằng Đ áv\ tố t ngKiẬp 2.1 Thành phần chất dinh dưỡng đậu tương Đậu tương loại thực phẩm bổ dưỡng từ thực vật ưa chuộng nước Châu Á đặc biệt Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản Sở dĩ yêu thích thành phàn dinh dưỡng phong phú đa dạng Hơn đậu tương lại nguồn thức ăn giàu protein loại thực phẩm Chúng sử dụng sống hàng ngày nhiều hình thức Những sản phẩm tạo từ đậu tương góp phần cung cấp cho người tiêu dùng lượng càn thiết phục vụ cho nhu càu thể Bất kỳ loại đậu tương có thành phàn sau: TkìỂ~Cl\uỵ ■Hằng Đ áv\ tố t ngKiẬp Bảng PI.2.1: Thành phần chất dinh dưỡng đậu tương [28] Thành phân Đơn vị Năng lượng KCal 416,000 Protein Gms 36,490 Tông chât béo Gms 19,940 Carbonhydrate Gms 30,160 Tổng chất béo bão hoà Gms 2,884 Tổng chất béo không bão hoà đơn Gms 4,404 Tông chât béo không bão hoà đa Gms 11,255 Cholesterol mg 0,000 Na mg 2,000 Vitamin A IU 24,000 Vitamin c mg 6,000 Thiamin mg 0,874 Riboflavin Mg 0,870 Vitamin B6 mg 0,377 K mg 1797,000 Ca mg 277,000 p mg 704,000 mg mg 280,000 Fe mg 15,700 Zn mg 4,890 Mg mg 2,217 Axit linoleic Gms 9,925 Axit linolenic Gms 1,330 Histidine Gms 0,984 Lysine Gms 2,492 Isoleucine Gms 1,770 Isoleucine Gms 1,495 Valine Gms 1,821 Arginine Gms 2,831 Gms Serine Gms 2,115 Proline Gms 2,135 TkìỂ~Cl\uỵ ■Hằng Đ áv\ tố t ngKiẬp 10 2.2 Tác dụng đậu tương 2.2Ệ1ỆCung cấp protein Hiện quy mô dân số giới không ngừng tăng lên Tương ứng với nhu càu lương thực, thực phẩm ngày trở nên cấp thiết Với hàm lượng protein cao loại thực phẩm từ 30 - 42 % đậu tương đã, góp phàn không nhỏ việc đáp ứng nhu cầu protein cho người, đặc biệt nước có kinh tế phát triển Điều lí giải ngày đậu tương lại quan tâm nghiên cứu, phát triển sử dụng 2.2ế2ế Ngăn chặn ung thư Mặc dù sử dụng từ lâu đời tác dụng mặt y học đậu tương sau biết tới khoa học phát triển Những tác dụng đậu tương ban đàu nhận thấy tỉ lệ mắc bệnh ung thư phụ nữ Châu Á thấp nhiều so với phụ nữ phương Tây Sau nhiều nghiên cứu người ta nhận phần ăn người phương Đông có chứa nhiều sản phẩm từ đậu tương hẳn so với phần ăn người Phương Tây phần nguyên nhân dẫn đến kết có lợi Những nghiên cứu tiến hành từ năm 1980 đậu tương tìm thấy đậu tương đặc tính đáng ngạc nhiên Những nghiên cứu cho thấy hợp chất Isoflavone to n g đậu tương nguyên nhân ban đàu mang lại cho đậu tương hiệu có lợi sức khoẻ Chúng giúp giảm phát triển số bệnh ung thư ung thư vú, ung thư buồng trứng ung thư tiền liệt tuyến Trong thành phàn Isoflavone, Genistein đóng vai trò yếu tố ức chế hình thành mạch, enzym có enzym Tyrozin kinaza loại enzym ảnh hưởng trực tiếp việc hình thành phát triển tế bào ung thư; Genistein Daidzein có khả bất hoạt phát triển ung thư vú ung thư kết, cách ngăn chặn phát triển khối u làm cho tế bào trở nên già cỗi khả sinh sản Theo nghiên cứu phụ nữ Trung Quốc có liên quan việc sử dụng đậu tương giảm bớt chứng ung thư vú phụ nữ tiền mãn kinh [14] Điều giải thích việc ăn đậu tương làm biến đổi hormon đặc trưng phụ nữ tiền mãn kinh, dẫn đến làm giảm yếu tố gây ung thư vú [9] 2.2ẻ3ẻNgăn chặn chứng loãng xương Bên cạnh tác dụng giảm nguy mắc bệnh ung thư đậu tương biết tới loại thực phẩm giúp ngăn chặn chứng loãng xương phụ nữ tiền mãn TkìỂ~Cl\uỵ ■Hằng Đ áv\ tố t ngKiẬp 47 bước sóng 600 nm để xác định ảnh hưởng NaCl lên phát triển vi khuẩn nồng độ muối khác ta có kết thể đồ thị sau: Bảng PIII.3.2: Ảnh hưởng NaCl đến phát triển Bacillus subtìlis TH2 Thời gian (h) ODóoonmở nông độ NaCl khác 0% 0.5% 3% 6% 10% 0.003 1% 0.014 0.014 0.016 0.017 0.013 0ể025 0ể004 0.03 0ể019 0ể033 0ể034 12 0ể025 0ể010 0ể035 0.022 0.039 0ể02 18 1.401 0.524 1.021 1.165 0.241 0.012 24 1.945 1.280 1.559 1.275 1.202 0.139 30 l ể977 l ể970 l ể872 1.415 1.32 0.567 36 l ể781 2ể052 l ể635 1.417 l ể33 0.689 42 2.278 2.230 1.892 1.419 1.436 0.81 48 2.444 2.268 1.991 1.856 1.411 1.23 54 2ể495 2ể385 2ể14 l ể883 1.709 1.242 60 2.52 2.688 2.405 1.736 1.356 0.393 66 2.543 2.674 2.165 2.215 1.381 0.135 TkìỂ~Cl\uỵ ■Hằng Đồ áv\ tốt ngKiẬp 48 Thòi gian (h) — 0% —s—0.50% —*—1% -A -3 % —■—6% -© -10% Hình PIII.3.2: Ảnh hưởng NaCl lên phát triển Bacillus subtilis TH2 Từ kết xác định ảnh hưởng nồng độ NaCl lên phát triển vi khuẩn ta thấy: Trong thời gian từ -12 h vi khuẩn phát triển chậm giai đoạn thích nghi vi khuẩn với thành phàn NaCl ứong môi trường Giai đoạn phát triển luỹ tiến 12 đến 60 Ở giai đoạn mật độ vi khuẩn tăng nhanh nồng độ NaCl 0% phát triển nhanh cao Sau 30 mật độ vi khuẩn cao nồng độ NaCl % Sau khảo sát phát triển vi khuẩn giai đoạn phát triển luỹ tiến ta thấy môi trường không bổ sung NaCl tốt cho phát triển vi khuẩn với mục đích thu sinh khối Như môi trường thu sinh khối không cần bổ sung NaCl 3.3ẻ Ảnh hưởng Glucoza đến phát triển Bacillus subtílìs TH2 Với điều kiện nhiệt độ 40°c môi trường NA không bổ sung NaCl, để xác định ảnh hưởng nồng độ Glucoza, ta bổ sung vào môi trường nồng độ 0, 2, 4, 6, 8, 10 % Xác định phát triển tế bào thông qua đo OD bước sóng 600 nm Kết khảo sát thể đồ thị sau: T k ìỂ~Cl\uỵ ■Hằng Đ áv\ tố t ngKiẬp 49 Bảng PHI 3.3: Ảnh hưởng Glucoza tới phát triển Bacillus subtilis TH2 Thời gian (h) ODóoonm nông độ glucoza khác 0% 2% 4% 6% 8% 10% 0.003 0.036 0.039 0.047 0.046 0.035 6h 0.004 1.049 0.839 0.853 0.583 0.631 12 0ể010 1.932 1.873 l ể835 1.583 1.590 18 0ể524 2.237 2.476 2ể564 2.173 2.266 24 1.280 2.378 2.571 2.577 2.598 2.532 30 l ể970 2.527 2.608 2ể779 2.741 2.741 36 2ể052 2.592 2.733 2ể817 2.763 2.686 42 2.230 2.690 2.841 2.840 2.807 2.765 48 2.268 2.675 2.751 2.814 2.771 2.788 54 2ể385 2.669 2.625 2ể756 2.764 2.798 60 2ể688 2.632 2.547 2ể684 2.756 2.678 66 2.674 2.626 2.435 2.647 2.742 2.641 Thời gian (h) : % -: % % % ——:8 % : 10 % Hình PIII.3.3: Ảnh hưởng Glucoza tới phát triển Bacillus subtilis TH2 T k ìỂ~Cl\uỵ ■Hằng Đ áv\ to't ngKiẬp 50 Qua đồ thị ta thấy ảnh hưởng glucoza tới phát triển vi khuẩn Bacillus subtilis TH2 rõ rệt Khi môi trường có bổ sung glucoza vi khuẩn phát triển tốt, giai đoạn thích nghi ngắn đạt tới giai đoạn phát triển luỹ tiến nhanh Chỉ sau 30 h vi khuẩn đạt đến giai đoạn phát triển cân Giai đoạn cân kéo dài đến 60 h thi mật độ tế bào bắt đàu giảm nghĩa chuyển sang giai đoạn suy thoái Sinh khối càn thu đàu giai đoạn phát triển cân bằng, thời điểm thi với nồng độ Glucoza khác có chênh lệch mật độ sinh khối thấp Ngược lại, không bổ sung glucoza vi khuẩn phát triển chậm hẳn kéo dài thời gian thích nghi tới tận 12h giai đoạn phát triển luỹ tiến kéo dài từ - Như để thu sinh khối vi khuẩn ta sử dụng môi trường chứa 2% glucoza để giảm thời gian nuôi cấy, thành phàn chi phí cho môi trường thu sinh khối 3.4 Thay đổi pH trình phát triển vỉ khuẩn Với điều kiện nuôi cấy thích hợp, tiến hành đo pH vi khuẩn trình phát triển số nhiệt độ 30, 40 50°c ta có bảng kết sau: Bảng PIII.3.4: Thay đỗi pH môi trường trình phát triển Bacillus subtilis TH2 Thời gian (h) 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 TkìỂ~Cl\uỵ ■Hằng Giá trị pH nhiệt độ khác 30uc 4.84 4.86 4.89 5.44 40°c 4.84 4.87 7.66 7.99 8.00 8.10 8.34 8.41 8.46 8.48 8.51 4.93 6ể51 7ể75 8.05 8.1 8.12 8.39 8.42 8ể45 8.5 8.54 8.63 8.65 50°c 4ể84 4.87 4.99 7ể04 7ể85 8.11 8ể15 8ể08 8.44 8.47 8.42 8ể56 8.74 8.71 Đồ áv\ tốt ngKiẬp 51 84 90 96 102 108 114 8.68 8.55 8.76 8.80 8.77 8.68 8ể68 8ể71 8.67 8.6 8ể58 8.58 8ể68 8ể64 8.63 8.59 8ể55 8.54 120 126 132 138 144 150 156 162 8.74 8.88 8.87 9.04 8.94 8.91 8.96 8.98 8.43 8ể45 8.5 8.49 8.5 8.44 8.51 8ể51 8ể53 8.54 8.56 8ể59 - - - - Ghi (-): Chưa xác định Thời gian (h) — :30 độ c — :40 độ c —A— :50 độ c Hình PIII.3.4: Thay đỗi p H trình phát triển Bacillus subtìlis TH2 Từ kết đo thay đổi pH trình nuôi cấy cho thấy thay đổi pH không đáng kể, pH môi trường tăng dần từ 4,84 đến 8,9 Như trình phát triển Bacillus subtilis TH2 tạo thành axit tong môi trường Sản xuất chế phẩm vỉ sinh vật lên men Natto T k ìỂ~Cl\uỵ ■Hằng Đ áv\ tố t ngKiẬp 52 4.1 Tạo chế phẩm lên men Natto Nuôi vi khuẩn Bacillus subtilis TH2 môi trường NA bổ sung 2% Gluoza, 40°c, 30 h, lắc 200 v/pửCanh trường ly tâm 7000 v/p 10 phút để thu sinh khốiỂ Chất mang sử dụng để tạo chế phẩm hỗn hợp đậu tương glucoza theo tỷ lệ Glucoza : Đậu tương =1:3 (w/w) Tỷ lệ phối trộn Sinh khối: Chất mang = %(w/w) Hình PIII.4.1: Chế phẩm lên men Natto 4.2 Bảo quản chế phẩm lên men Natto Chế phẩm đem sấy để giảm độ ẩm bảo quản nhiệt độ phòng Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ sấy đến đặc tính sản phẩm Chế phẩm sau sấy xác định độ ẩm máy sấy hồng ngoại, kết độ ẩm chế phẩm sử dụng chế độ sấy thể đồ thị sau Bảng PIII.4.2: Ảnh hưởng nhiệt độ sẩy tới độ ẩm chế phẩm Độ ẩm chế phẩm nhiệt độ sấy khác Độ ẩm 40°c 50°c 60°c 70°c 80°c 10,6 10,2 9,85 8,5 8,0 TVclìn T K ì ~Cl\uỵ ’H ằ i ^ Đ áv\ tố t r\0 k ỉ4 p 53 90 o> 4m 60 o -re ■Q 12 30 H 40 50 60 70 80 Nhiệt độ (°C) Hình PIII.4.2: Ảnh hưởng nhiệt độ sẩy tới tỷ lệ tế bào sống chế phẩm Từ hình PII.4.2 bảng PIII.4.2 ta thấy sấy nhiệt độ giảm độ ẩm chế phẩm xuống 12% nhiệt độ sấy vi khuẩn có tỷ lệ sống sót cao 40°c với tỷ lệ lên tới 81,7% Điều là nhiệt độ thích hợp để vi khuẩn phát triển nên trình sấy vi khuẩn không bị tiêu diệt Khi tăng nhiệt độ lên 50°c lượng vi khuẩn sống sót giảm mạnh 36% lên tới 60°c tỷ lệ tế bào sống 20,1% Nguyên nhân dẫn đến tượng nhiệt độ cao nhiều so với nhiệt độ tối thích vi khuẩn nên phàn lớn tế bào bị giết chết Cũng theo hình PIII.4.2 sấy chế phẩm nhiệt độ 70°c tỷ lệ tế bào sống lại lớn sấy 60°c Điều giải thích nhiệt độ gần nhiệt độ tạo bào tử Bacillus subtilis nên tế bào sinh dưỡng chuyển sang dạng bào tử Tỷ lệ sống sót tế bào giảm xuống 9,2% chế phẩm sấy 80°c nhiệt độ cao so với khoảng nhiệt độ Bacillus subtilis Như sau khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ sấy ta xác định nhiệt độ thích hợp cho trình tạo chế phẩm 40°c thời gian h 4ế3ẳ Đặc tính chế phẩm lên men Natto Chế phẩm lên men Natto thu có đặc tính sau T k ìỂ~Cl\uỵ ■Hằng Đ áv\ tố t ngKiẬp 54 Bảng P in 4.3: Đặc tính chế phẩm VIỆsinh lên men Natto Các tiêu CFU trước sây 4,8.108 CFU sau sây rp •> 1A IẴ > 3,92.108 81,7% 10,6% Vàng nâu Bột khô, mịn Thơm Ẩ Tỷ lệ tê bào sông Độ âm Màu săc Trạng thái Mùi Thử nghiệm quy trình lên men thu Natto từ chế phẩm vỉ sỉnhề Sử dụng đậu tương chế phẩm vi sinh vật để tiến hành lên men thu Natto theo quy trình trình bày Trong quy trình sản xuất thử nghiệm Natto tiến hành xác định số đơn vị khuẩn lạc chế phẩm cách pha loãng chế phẩm cấy lên đĩa pectri, đếm số khuẩn lạc tạo thành, kết thể bảng sau: 1.6 T 1.2 - o> ọ 0.8 CO 0.4 - -I - 12 18 24 30 36 42 Thcri gian (h) Hình PIII.5: S ự phát triển vi khuẩn trình lên men Natto T k ìỂ~Cl\uỵ ■Hằng Đ áv\ to't ngKiẬp 55 Theo quy trình lên men nêu phần vật liệu phương pháp, đánh giá chất lượng cảm quan trình lên men Natto thu bảng số liệu sau: Bảng PHI 5.1 ỉ Nhận xét cảm quan Natto trình lên men Các tiêu Thời gian xác định (h) 12 18 24 Màu săc Màu vàng nhạt đậu tương Màu vàng Màu vàng sậm Màu vàng ngả sang đậm nâu Mùi Hơi chua Mùi chua Vị Vị bùi Bê mặt Trơn Mùi chua rõ rệt, mùi amoniac nhẹ Vị bùi, Vị bùi, có chua mùi Hơi nhăn Nhăn rõ Mùi chua mạnh, mùi amoniac đặc trưng Vị ngọt, bùi đặc trưng Nhăn nheo Thời gian lên men thu Natto 24 h Sau trình lên men Natto giữ lạnh 48 h để hoàn thiện chất lượng sản phẩm, tăng mùi vị, độ nhót chất lượng cảm quanửSo sánh Natto sản xuất thử nghiệm với Natto thương mại có bán sẵn thị trường thu bảng sau: Natto sản xuất thử nghiệm Natto thương phẩm Hình PIII.5.2: Sản phẩm Natto TVclìn T K ì ~Cl\uỵ Đ áv\ tố t r\0 k ỉ4 p 56 Bảng P in 5.2: So sánh cảm quart Natto thương mại Natto chế phẩm Các tiêu Natto sản xuât thử nghiệm Natto thương mại Màu săc Nâu vàng Nâu đậm Mùi vị Mùi amoniac mạnh, Mùi amoniac nhẹ, khó chịu khó chịu Bê mặt Trơn, nhăn, sờ vào thây Dính, nhớt dính, nhớt Cấu trúc hạt đậu lên Mềm, mịn Khá mềm, mịn men An vào thây có độ bùi, nhớt, An thây bùi, ngọt, nhớt, vị đậm, Vị vị nhạt, khó ăn khó ăn Kích thước hạt đậu Rộng 5mm, dài 12mm Rộng 3mm, dài 6mm Độ nhớt Khi trộn hạt đậu tương Độ nhớt mạnh, hạt đậu dính lên, chúng dính vào với vào với nhau tong lớp polysaccarit có màu nâu, trong, nhớt kéo dài Từ bảng so sánh giá trị cảm quan ta thấy độ tương đồng Natto sản xuất thử nghiệm có độ tương đồng cao so với sản phẩm Natto thương mại có bán sẵn ừên thị trường Sự sai khác màu sắc kích thước có Natto sản xuất thử nghiệm sản xuất tò loại đậu tương Việt Nam khác hẳn với đậu tương dùng để sản xuất chế phẩm thương mại chế phẩm nhập từ Nhật Sự khác kích thước hạt đậu làm ảnh hưởng tới độ nhớt Natto tự sản xuất làm cho chúng có độ nhớt so với Natto thương phẩm Chính sai khác mà trình sản xuất Natto càn tăng thời gian lên men đậu tương 24 để vi khuẩn có điều kiện phân huỷ protein đậu tương cách triệt để TkìỂ~Cl\uỵ ■Hằng Đồ áv\ tốt ngKiẬp 57 KET LUẬN Sau thời gian thực đề tài “Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis TH2 từ Natto, tạo chế phẩm lên men Natto thử nghiệm sản xuất Natto từ đậu tương” em thu kết sau: Phân lập vi khuẩn TH2 từ Natto Xác định TH2 từ Natto thuộc loài Bacillus subtiỉis, đặt tên Bacillus subtiỉis TH2 Xác định số điều kiện thích hợp cho thu sinh khối Bacillus subtỉlỉs TH2: Nhiệt độ, NaCl, Glucoza Từ tìm môi trường thích hợp để nuôi cấy thu sinh khối vi khuẩn phục vụ cho sản xuất chế phẩm lên men Natto: Môi trường NA bổ sung 2% Glucoza, nhiệt độ 40°c, thời gian nuôi 30h Tạo chế phẩm vi sinh lên men Natto: Chọn điều kiện sấy thích hợp 40°c với thời gian h thiết bị sấy chân không Sử dụng chế phẩm vi sinh để thử nghiệm lên men Natto tò đậu tương: Natto thu có giá trị cảm quan tương đối giống với Natto có bán thị trường TkìỂ~Cl\uỵ ■Hằng Đồ áv\ tốt ngKiẬp 58 ĐE NGHỊ Natto loại thực phẩm có nhiều lợi ích đã, sử dụng sản phẩm chức Ở nước ta Natto phài nhập nên có giá thành cao thị trường Natto hạn chế Nhưng tương lai chắn nhu cầu Natto tăng lên việc sản xuất Natto ứong nước đem lại hiệu kinh tế không nhỏ cho người trồng đậu tương nhà sản xuất Natto Để sản xuất Natto thiết nghĩ đề tài cần phải tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện để tìm điều kiện sản xuất chế phẩm vi sinh sản phẩm Natto tốt hơn, tốn chi phí Mặt khác sản phẩm Natto chưa biết đến rộng rãi Để Natto trở nên phổ biến chứng ta càn nhiều nghiên cứu để xác định thành phàn có giá trị dinh dưỡng tác dụng to lớn hàm lượng protein, hàm lượng hợp chất cacbon, vitamin khoáng chất chất có hoạt tính sinh học khác Với lý đề nghị: Nghiên cứu khả phân huỷ protein chửng Bacillus subtilis TH2 với đày đủ yếu tố ảnh hưởng để tìm điều kiện tối ưu cho việc tạo sinh khối vi khuẩn Nghiên cứu điều kiện thích hợp để tiến hành tạo chế phẩm lên men Natto với chi phí thấp Xác định thành phàn hàm lượng chất dinh dưỡng protein, vitamin chất có tác dụng sinh học, y học Natto TkìỂ~Cl\uỵ ■Hằng Đồ áv\ tốt ngKiẬp 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1.GS N.XểEGÔRÔ hiệu đính; Người dịch GS NGUYỄN LÂN DŨNGể Thực tập vi sinh vật, NXB Đại học Trung học chuyên nghiệp Hà Nội Lương Đức Phẩm, Vỉ sinh vật ỉương thực thực phẩm Phan Thị Trân Châu, Nguyễn Thị Hiền, Bùi Gia Tường, Thực hành hoá sinh học, NXB Giáo dục, 1997 Đặng Thị Thu, Nguyễn Thị Xuân Sâm, Tô Kim Anh(1997), Thỉ nghiệm hoá sinh công nghiệp, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty(1997), Vi sinh vật học, NXB Giáo Dục Lê Ngọc Tú(1997), Hoá sinh công nghiệp, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Lê Thanh Bình, Phạm Thị Ngọc Lan, Lên men vi khuẩn lactic phế thải hữu cơ, môi giải pháp hữu hiệu để bảo quản tái thu hồi, Tạp chí Khoa học Công nghệ, tập 36, số 3, 1997ể Đỗ Thị Hạnh(2005), Nghiên cứu khả kháng khuẩn vi khuẩn lactic phân lập từ nem chua để ứng dụng vào công nghệ sản xuất nemchua nhằm nâng cao chất lượng kéo dài thời gian bảo quản, Hà Nội Tài liệu nước Dr James Zhou, Ph.D.(1999), “Soy Isoflavones: A Review of Literature and Use”, Focus on Allergy Research Group newsletter 10 Sakar PK, Cook PE, and Owens ID (1993), Bacillus fermentation o f soybean World J Microbiol Biotechnol 11.Chuanlai Xu, Kaihao, Effecta o f fermentation tempertature and time on the Physicochemiscal and Sensory Characteristics on Douchi Wuxi City, Jiangsu, P.R China, 2005 12 Edward R.Famworth Ph.D(2003), Handbook offermentation functional food, CRC Press, Canada 13 Doerge and Sheehan, Letter to the FDA, Feb 18, 1999 TkìỂ~Cl\uỵ ■Hằng Đồ áv\ tốt ngKiẬp 60 14 Lephart ED, Thompson JM, Setchell KD, Adlercreutz H, Weber KS, Phytoestrogens decrease brain calcium-binding proteins Brain Res 2000 Mar 17-859(1): 123-31 15 Soy Infant Formula Could Be Harmful to Infants: Groups Want it Pulled Nutrition Week, Dec 10, 1999;29(46):l-2 16 Cassidy A, Bingham s, Setchell KD, Biological effects of a diet of soy protein rich in isoflavones on the menstrual cycle of premenopausal women Am J Clin Nutr 1994 Sep;60(3):333-40 17 Setchell KD, Zimmer-Nechemias L, Cai J, Heubi JE, Exposure of infants to phytooestrogens from soy-based infant formula Lancet 1997 Jul 5;350(9070):23-27 18 Rackis, J J., " Biological and physiological factors in soybeans," Journal o f the American Oil Chemists’ Society, 51: 161A-170A, January 1974 19 Setchell, K D R., "Phytoestrogens: the biochemistry, physiology, and implications for human health of soy isoflavones," American Journal o f Clinical Nutrition, 68 (Supplement): 1333S-46S, 1998 20 O'Dell TJ, Kandel ER, Grant SG, Long-term potentiation in the hippocampus is blocked by tyrosine kinase inhibitors Nature 1991 Oct 10 353:6344 558-60 21 U.S Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Food & 'Nutrition Research Briefs, July 1997 22 Tạp chi National soybean research laboratory, số ngày 13/2/2006 23 Tạp chi Japanese microbiologycal research 24 Tạp chí Y khoa Naval, Đại học Y khoa Hokkaido, 1936-1939 25 Http://www Food of Akita home page.com 26 Http://www.Natto for everybody Homepage.com/ 27 Http ://www soybeanrust.com/ 28 Http://waltonfeed.com/ 29 http://www.bio.org/ 30 http://www.micron.ac.uk/ 31 http://www.epa.gov/ 32 http://en.wikipedia.org/wiki/Bacillus_subtilis TkìỂ~Cl\uỵ ■Hằng Đồ áv\ tốt ngKiẬp 61 33 Japan function foods research association, 2004 34 Sumi et al, Experientia, Vol 43, 1110-1111, 1987 35.Http://www.Nattokinase Products, Nattokinase Product Description, Product Ingredients.htm 36.Http://www.Natto For Nattokinase, Nattokinase Usage Elucidation, Discovery Of Nattokinase.htm 37 Folasade M.OLAJUYIGBE Joshua O.AJELE, Production dynamics of extracellular protease from Baillus specie, African Journal o f Biotechnology Vol.4 (8), pp 776-779, August, 2005 38 Tran Lien Ha, Nagano Hiroko,Tran, Isolation and characteristics of Bacillus subtilis CN2 and its collagenase production, Journal o f Food Science, Vol 67 (3), 1184-1187, 2002 TkìỂ~Cl\uỵ ■Hằng Đ áv\ tố t ngKiẬp [...]... men là nấm mốc, thời gian lên men trong khoảng 18 tháng Sản phẩm tạo ra có dạng lỏng và sánh Có thể dùng nước tương để tạo hương cho sản phẩm 3.2 Một sổ sản phẩm protein đậu tương Phàn đậu tương còn lại sau quá trình tách dầu sản xuất dầu nành là cơ sở để tạo hàng loạt sản phẩm đậu tương Tuỳ thuộc vào hàm lượng protein và thành phần trong sản phẩm mà người ta phân chia thành các dạng sau: Bột đậu tương. .. được đặt tên là Bacillus subtilis natto 3 Một số sản phẩm sản xuất từ đậu tương Bảng PI.3: Thành phần dinh dưỡng của một sổ sản phẩm từ đậu tương (lOOg) [9] Sản phẩm Năng lượng Protein Cacbonhydrat Chât béo (calo) (g) 9,90 (g) 9,00 Đậu tương 173 (g) 16,6 Tempeh 199 19,0 17,0 7,70 Bột đậu tương tách béo 268 53,2 30,0 0,00 Đậu phụ 145 15,8 4,30 8,70 Bột đậu tương khô 328 47,2 38,4 1,20 Sữa đậu nành 40,8... tương này thường được dùng để tạo cấu trúc và giữ độ ẩm cho thực phẩm Sản phẩm đậu tương tinh chế chứa khoảng 90% protein và là sản phẩm protein được ưa dùng nhất Các chất tách ra được dùng để tăng tính giữ ẩm, độ kết dính và độ nhớt cho nhiều sản phẩm như thịt, đồ biển và gia cầm Đậu tương tinh chế là thành phàn chính ừong nhiều sản phẩm giống sữa như pho mat đậu tương, sữa đậu, sữa bột cho trẻ em, cà... trộn Chế phẩm Chế phẩm lên men Sấy khô (35 C; 310 4.3ẻ Nghiên cứu đặc tính của chế phẩm 4.3Ệ1ỆXác định độ ẩm của chế phẩm lên men Natto Chế phẩm sau sấy ở các nhiệt độ khác nhau được đo độ ẩm bằng máy sấy hồng ngoại Mục đích của việc này là xác định độ ẩm của chế phẩm sau khi sấy nhằm tim ra phương pháp sấy thích hợp nhất cho việc bảo quản chế phẩm 4.3.2 Xác định số lượng vỉ sinh vật trong chế phẩm và. .. mạch máu và gây ra các bệnh tim mạch Dầu nành cũng chứa các axit béo càn thiết cho cơ thể tong đó có axit linoleic và linolenic với lượng tương ứng là 50% và 8%, 2 axit béo càn thiết nhưng không được tạo ra trong cơ thể [9] IIẻ NATTO- SẢN PHẨM LÊN MEN TỪ ĐÂU TƯƠNG Natto là một loại thức ăn truyền thống của Nhật Bản thường được ăn vào bữa sáng Do Natto được làm từ đậu tương lên men nên nó nhầy và có mùi... thước 300 Mesh để làm chất tạo độ xốp và 5% vi khuẩn tạo bào tử Sản phẩm này được đóng gói 0,5 g trong vỏ capsule cứng Dạng sản phẩm này của Natto có tác dụng như probiotic [35] 2 Sản phẩm Nattokinaza Enzym này là sản phẩm trao đổi chất quan trọng của Bacillus subtilis natto Chứng đã được tách tinh chế từ Natto để thu được enzym tinh khiết và phối trộn với một số các chất khác và đóng gói dưới dạng viên... hoá của cơ thể; Cũng trong quá trình lên men mà hàm lượng các phyte giảm đáng kể Chính nhờ lên men mà ngày nay chúng ta có được một phổ sản phẩm vô cùng phong phú từ đậu tương - Một nguồn thực phẩm rẻ, sẵn có, dễ trồng, dễ chế biến Natto là một sản TkìỂ~Cl\uỵ ■Hằng Đ ồ áv\ tố t ngKiẬp 12 phẩm như vậy Loại thức ăn này được sản xuất từ đậu tương hấp chín sau đó lên men nhờ một loại vi sinh vật có to n... dày Điều đó giúp Bacillus subtilis natto có thể sống sót khi đưa vào cơ thể III LỢI ÍCH CỦA NATTO Hiệu quả của Natto một phàn là do nó được làm từ đậu tương Ngoài ra ừong quá trình lên men, Bacillus subtilis natto sản xuất ra nhiều loại enzym, vitamin, axit amin và các chất dinh dưỡng độc đáo khác Những chất này làm cho Natto trở thành một loại thực phẩm bổ dưỡng, có lợi cho sức khoẻ và độc đáo Đáng... t ngKiẬp 23 IV VI KHUẨN LÊN MEN NATTO 1 Phân loai vỉ khuẩn Sau khi tiến hành phân lập và định tên người ta đã xác định rằng Natto là loại thực phẩm lên men tương đối thuần khiết Vi khuẩn đóng vai trò chủ yếu to n g Natto là loài Bacillus subtilis chủng natto Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Nhóm: Bacillales Họ: Bacillaceae Giống: Bacillus Loài: subtilis Bacillus subtilis là vi khuẩn gram... phẩm tương tự Natto đã được trưng bày có nguồn gốc từ nhiều nước như Nepan, Thái Lan, Indonesia và Nigeria [10] Hiệu quả tuyệt vời mà Natto mang lại là ngăn chặn chứng đông máu do thành phàn nattokinase có trong chất nhầy của thực phẩm này, tác dụng này của natto là mạnh nhất trong gần 200 loại thực phẩm đã được nghiên cứu [33] Chất lượng Natto phụ thuộc vào loại đậu tương và chủng Bacillus subtilis natto ... vật từ Natto để tạo chế phẩm lên men Natto, ứng dụng vào tạo sản phẩm thiết thực em thực đề tài: “ Phân lập Bacillus subtìlis TH2 từ Natto, tạo chế phẩm lên men Natto thử nghiệm sản xuất Natto từ. .. pháp tạo chế phẩm lên men Natto 34 4.1 Tạo chế phẩm 34 4.2 Bảo quản chế phẩm lên men Natto 34 4.3 Nghiên cứu đặc tính chế phẩm 35 4.3.1 Xác định độ ẩm chế phẩm lên. .. lượng phong phú sản phẩm từ đậu tương Các sản phẩm truyền thống bao gồm bột đậu tương, sữa đậu, đậu phụ; Các sản phẩm đậu tương lên men Thua nao (Thái Lan), Kinema (Ấn Độ, Nêpal), Natto, tempeh,