Sản phẩm Natto thương mại nhập khẩu từ Nhật Bản được bán tại siêu thị Uni-mart, Hà Nội.
IIỄ HÓA CHẤTỄ
Các hoá chất sử dụng trong đồ án gồm:
Cao thịt (Merk - Đức); cao nấm men (Difco - Mỹ); agar- agar, cồn 75°, 96° glucoza, đỏ flicsin, dung dịch I2 lugol, tím tinh thể (Việt Nam); peptone, NH4NO3
NH4H2S 04, KC1, KH2P 0 4, Na3C6H50 7.2H20 , bromtimol blue, gelatin, CaCl2.2H20 , CH3COONa, MgSƠ4 MnSƠ4 Tween 80, NaCl, K2HPO4 cồn tuyệt đối, Glyxerol (Trung Quốc). Một số hóa chất khác.
* Thành phần môi trường M RS (1000ml H20 ) Peptone 1 0 g NH4NO3 0,4 g Cao thịt 8 g MgS04 0 , 2 g Cao nấm men 4 g MnS04 0,4 g CH3COONa 5 g Tween 80 1 ml k2h p o4 2 g Agar 14 g Glucoza 2 0 g * Thành phần môi trường NA (1000 ml H20 ) Peptone 10,36 g Thạch agar-agar 15,54 g Cao thịt 5,18 g
Môi trường và các dụng cụ thí nghiệm được hấp thanh trùng ở 110°c trong thời gian 30 phút, pH môi trường 6,5-6,7.
III. THIẾT BỊ
• Thiết bị vô trùng: tủ sấy; nồi thanh trùng HIRAYAMA HV-25/50/85/110- Nhật Bản,
• Thiết bị nuôi cấy và giữ giống: Tủ cấy, tủ nuôi (Nhật Bản); tủ lạnh (Sanyo, Nhật Bản); tủ lạnh sâu (Sanyo ultra low, Nhật Bản).
• Thiết bị nghiên cứu đặc điểm hình thái tế bào: Kính hiển vi quang học OLYMPUS, modelCHS, Nhật Bản.
• Các thiết bị khác: Cân điện tử SARORIUS (Nhật); máy đo pH (320 pH meter), METTLER TOLEDO, Thuỵ Sĩ; pipetman; máy đo quang Model 80 - 2088 - Anh; máy khuấy từ; lò vi sóng; máy ly tâm, máy sấy chân không,...
IV. CÁC KĨ THUẬT SỬ DỤNG TRONG ĐỀ TÀI1. Phân lập giống vỉ sinh vật thuần khiết [1] 1. Phân lập giống vỉ sinh vật thuần khiết [1]
Cơ sơ của phương pháp: Trên môi trường dinh dưỡng đặc, mỗi tế bào sẽ phát triển thành một khuẩn lạc riêng biệt, mỗi khuẩn lạc này sẽ tiếp tục được tách ra và nuôi cấy riêng. Kết quả là thu được vi sinh vật thuần khiết từ một hỗn hợp các vi sinh vật.
Vật liệu: Trong đề tài nghiên cứu của mình Bacillus subtilis TH2 được phân lập từ chế phẩm Natto thương mại nhập khẩu từ Nhật. Từ chế phẩm này áp dụng các phương pháp vi sinh vật để phân lập được vi sinh vật mong muốn
Phương pháp phân lập vi khuẩn: Cho 1 g mẫu, hoặc 1 ml dịch mẫu vào ống nghiệm chứa 9 ml nước cất thanh trùng. Ta có độ pha loãng 10'1. Tiếp đó lấy từ to n g dịch pha loãng nảy 1 ml dịch cho tiếp vào 9 ml nước cất thanh trùng ta có độ pha loãng 10'2. Cứ như thế ta có độ pha loãng 10'3, 10-4, 10'5... Với những nồng độ đó lấy 0,1 ml canh trường cho vào đĩa pectĩi chứa môi trường thạch dinh dưỡng, dùng que trang dàn đều canh trường ra khắp bề mặt thạch, mỗi nồng độ trang 3 đĩa, mang nuôi ở điều kiện thích hợp 40°c ừong thời gian 48 giờ. Sau thời gian nuôi cấy, các khuẩn lạc phát triển riêng rẽ, lấy que cấy móc từng khuẩn lạc cấy vào ống thạch nghiêng. Kiểm tra hình thái vi khuẩn để xác định sự đồng nhất của vi sinh vật phân lập được. Dựa vào đặc điểm hình thái học, sinh lý học để định tên vi khuẩn.
2. Phương pháp định tên vỉ sinh vật
Khi muốn nghiên cứu bất ki một quá trình nào liên quan đến hoạt động sống của vi sinh vật ta càn phải biết vị trí phân loại của các vi sinh vật gây ra quá trình này. Để định tên vi sinh vật người ta sử dụng nhiều đặc điểm khác nhau: Đặc điểm hĩnh thái học, về nuôi cấy, về sinh lý-sinh hoá học, các thử nghiệm huyết thanh học và thử nghiệm về tính mẫn cảm đối với thực khuẩn thể nữa. Hiện nay dựa vào cấu trúc DNA người ta cũng có thể sử dụng kít định tên vi sinh vật. Trong nghiên cứu này em sử dụng phương pháp định tên vi sinh vật dựa vào đặc điểm hình thái, khả năng trao đổi chất và lên men một số loại đường.
2.1. Nguyên tắc của phương pháp
Mỗi vi sinh vật được đặc trưng bởi các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá học khác nhau. Để định tên cho vi sinh vật càn xác định xem vi sinh vật có đặc điểm hình thái như thế nào, sử dụng được các loại thức ăn ra sao và những biến đổi gì sẽ xảy ra trong môi trường khi chúng phát triển. Sự phát triển của vi sinh vật có thể tạo ra việc tích luỹ các axit hữu cơ, các sản phẩm trung hoà, các loại khí,... Căn cứ vào đó có thể xác định được loại vi sinh vật mà ta đang sử dụng.
2.2. Phương pháp
Các thí nghiệm được dùng để định tên vi khuẩn bao gồm: Xác định hình dạng của vi khuẩn, khả năng tạo catalaza, khả năng sử dụng tinh bột tan, khả năng phân huỷ gelatin, khả năng đồng hoá ciừate, khả năng lên men các loại đường: Galatoza, glucoza, arabinoza, rafmoza, manitol, maltoza, saccaroza, lactoza, xyloza.
2.2.1. Hình dạng vỉ khuẩn
Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường lỏng có thành phàn thích hợp ở điều kiện 37°c,
sau 18 - 24 giờ có thể lấy canh trường vi khuẩn để nhuộm Gram.
2.2.2. Hình thái khuẩn lạc
Để quan sát hình thái khuẩn lạc, nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường NA đặc to n g các đĩa pectri ở 37°c. Sau 24 giờ lấy đĩa ra quan sát và mô tả đặc điểm khuẩn lạc.
Một vài loại vi khuẩn và đại thực khuẩn có khả năng làm biến đổi hai nguyên tử o thành peroxit và superoxit. Cả hai loại phân tử này đều độc đối với vi khuẩn. Tuy nhiên nhiều loại vi khuẩn có cơ chế bảo vệ để có thể giảm thiểu tác hại của hai chất này. Các vi khuẩn có sức đề kháng như thế nàt sử dụng hai enzym để xúc tác sự chuyển ngược lại từ peroxit và superoxit thành hai nguyên tử o và nước. Một trong các enzym là catalaza và sự có mặt của nó có thể được nhận ra bằng kĩ thuật kiểm tra đơn giản. Kĩ thuật catalaza bao gồm thêm H20 2 vào canh trường hoặc trên thạch nghiêng. Nếu vi khuẩn có phản ứng catalaza chúng sẽ chuyển hoá H2O2 và tạo ra khí Ơ2- Sự tạo khí gây ra các bong bóng biểu thị phản ứng dương tính nghĩa là vi khuẩn đó có khả năng gây phản ứng catalaza.
Phương pháp: Nhỏ một giọt huyền phù vi khuẩn lên đĩa, dùng que gạt dàn đều và nuôi trong tủ ấm. Khi thấy khuẩn lạc mọc thi nhỏ một giọt dung dịch H20 2 3 % lên khuẩn lạc. Nếu thấy các bọt khí xuất hiện chứng tỏ có catalaza tong tế bào [3].
2.2.4. Khả năng lên men đường trong môi trường lỏng
Môi trường lên men có thành phàn như sau (tong 1000 ml nước máy): (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
NH 4H2S0 4 1 g
KC1 0,2 g
MgS04.H20 0,2 g
Peptone 1-2 g
Đường 0,5 - 1 %
Dùng NaOH điều chinh pH = 7; thanh trùng 110°C; 30 phút [3].
2.2.5. Khả năng phân giải gelatin
Thành phàn môi trường để thử khả năng phân giải gelatin bao gồm các chất như sau (trong 1000 ml nước cất):
k2h p o4 7 g Gelatin 50 g
KH2PO4 2 g CaCl2.2H20 1 g
MgS04. 7H20 0,1 g Glucoza 10 g
Citrate .2H20 0,5 g Pepton 10 g
Cao nấm men 1 g
Đổ vào đĩa pectri nuôi ở điều kiện thích hợp.
Sau khi vi khuẩn phát triển thử khả năng phân giải gelatin bằng (NH4)2S 04 trong 5- 10 phút sau đó đổ đi, đo đường kính vòng phân giải. Nếu vi khuẩn có khả năng phân huỷ gelatin sẽ tạo vòng phân huỷ xung quanh chỗ khuẩn lạc phát triển [3].
2.2.6. Khả năng sử dụng tình bột tan
Cấy vi khuẩn trên các môi trường đặc đã bổ sung 1-3 % tinh bột tan. Sau vài ngày nuôi cấy ở điều kiện thích hợp lấy ra và thử bằng dung dịch lugol. Nếu vi khuẩn có khả năng phân huỷ tinh bột thì chúng sẽ tạo thành một vòng vô màu xung quanh chỗ có vi khuẩn phát triển (các phàn khác có màu xanh tím).
Thành phần môi trường (trong 1000ml nước máy):
NaCl 10,32 g Peptone 5,18 g Cao thịt 5,18 g Agar 15,5 g Tinh bột tan 10-30 g pH = 6,5 - 6,7; thanh trùng 110°C; 30 phút [3].
2.2.7. Khả năng đồng hoá xitrate
Khả năng sử dụng xitrate là đặc trưng của các loài Bacillus không gây bệnh. Vì thế việc kỉêm tra khả năng đồng hoá xitrate là càn thiết để xác định chủng phân lập được là không gây bệnh.
Thành phần môi trường (1000ml nước cất):
NH4H2P04 l g NaCl 5 g
MgS04.7H20 0,2 g Agar 20 g
K2HP04 1 g Bromtimol blue (5% trong cồn) 20 ml Na3C6H507.2H20 23 g
pH= 6,7; thanh trùng 110°C; 30 phút.
Vi khuẩn có khả năng sử dụng xitrate khi phát triển sẽ tạo các muối cacbonat làm tăng pH của môi trường làm cho màu của chỉ thị chuyển từ màu xanh lục sang xanh lam [3].
3. Xác định các điều kiện nuôi cấy thích họp cho vỉ khuẩn
Một trong các đặc điểm của vi sinh vật là sự phụ thuộc một cách đặc biệt vào các điều kiện của môi trường xung quanh. Sự phản ứng của vi sinh vật với các điều kiện môi trường mạnh hơn với các vi sinh vật khác là do chúng có kích thước rất nhỏ bé làm cho vi sinh vật tiếp xúc chặt chẽ với môi trường. Các nhân tố môi trường ngoài rất đa dạng. Trong đó quan trọng nhất phải kể đến thành phàn môi trường dinh dưỡng cho vi sinh vật phát triển. Chỉ một sự biến đổỉ nhỏ trong thành phàn dinh dưỡng cũng có thể làm vi khuẩn phát triển mạnh mẽ hoặc bị diệt vong. Các yếu tố hoá lý cũng ảnh hưởng đáng kể đến sự phát triển của vi sinh vật như pH, nhiệt độ, áp suất, nồng độ oxy,... Những vi sinh vật chỉ phát triển trong môi trường và điều kiện ngoại cảnh giới hạn xác định. Bất kỳ biến đổi của một nhân tố nào đó ừong phạm vi nhất định cũng lảm ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và hoạt động trao đổi chất của chứng, trong phạm vi nghiên cứu của minh em chỉ xác định một số yếu tố ảnh hưởng sau:
3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy sự phát triển của vỉ sinh vật (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hoạt động sống của vi khuẩn có thể coi là kết quả của các phản ứng hoá học. vì các phản ứng này phụ thuộc chặt chẽ vào nhiệt độ nên yếu tố nhiệt độ rõ ràng ảnh hưởng sâu sắc đến các quá trình sống của tế bào. Và mỗi loài vi khuẩn có nhiệt độ phát triển tối thích khác nhau, xác định nhiệt độ tại đó vi khuẩn tăng trưởng nhanh nhất và nhiều nhất là một trong những yếu tố quan trọng hàng đầu trong việc nuôi vi khuẩn thu sinh khối. Trong nghiên cứu này nhiệt độ thích hợp của vi khuẩn được xác định bằng cách nuôi vi khuẩn trong môi trường NA lỏng và đo OD sau khoảng thời gian 6h/làn. Nhiệt độ phát triển thích hợp là nhiệt độ tại cho OD max và sau thời gian ngắn nhất.
3.2 Ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng đến hoạt động sổng của vi sinh vật
Sự thay đổi hàm lượng dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng đến hoạt động sống của vi sinh vật. Sự thay đổi này được xác định bằng cách đo OD ở 600 nmỂ Trong nghiên cứu này tôi tiến hành thay đổi 2 yếu tố trong môi trường dinh dưỡng là NaCl và glucoza để xác định điều kiện phát triển thích hợp của Bacillus subtilis
Sự phát triển của vi khuẩn được xác định bằng phương pháp đo mật độ quang của canh trường vi khuẩn.
Nuôi cấy vi khuẩn TH2 trong môi trường NA lỏng có bổ sung NaCl với các nồng độ làn lượt là 0; 0,5; 1; 3; 6; 10% ở điều kiện 40°c và đo OD (600 nm) 6h/làn. Lượng canh trường bổ sung vào môi trường là 10%.
3.2.2. Ảnh hưởng của glucoza đến sự phát triển của vỉ sinh vật
Sau khi tìm được nồng độ NaCl thích hợp cho sự phát triển của TH2, tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của glucoza tới sự phát triển của TH2 bằng cách bổ sung 10% canh trường vi khuẩn vào môi trường NA lỏng có bổ sung lần lượt glucoza với nồng độ là 0, 2, 4,6, 8, 10%. ở mỗi nồng độ tiến hành nuôi cấy ở 40°c và đo OD (600nm) 6h/làn.
3.3. Thay đổi pH môi trường trong quá trình phát triển của vỉ sinh vật
Trong quá trình phát triển của vi khuẩn tiến hành đo pH môi trường bằng máy đo pH.
4Ẻ Phương pháp tạo chế phẩm lên men Natto 4.1 Tạo chế phẩm
Chủng vi khuẩn sau khi phân lập và định tên được nuôi cấy trong môi trường NA lỏng có bổ sung Glucoza 2%, 40°c với tốc độ lắc 200v/p. Tiến hành thu sinh khối sau 30 h bằng ly tâm với tốc độ 7000v/p trong thời gian 15 phút. Sinh khối được bổ sung chất mang (gồm bột đậu tương, đường glucoza với tỷ lệ 3:1) và khảo sát nhiệt độ sấy để xác định nhiệt độ sấy thích hợp.
4.2. Bảo quản chế phẩm lên men Natto
Mục đích: Giảm hàm ẩm của chế phẩm để cho vi sinh vật không có điều kiện phát triển hoặc phát triển rất chậm.
Phương pháp: Tiến hành sấy chế phẩm trong thiết bị sấy chân không.
Trong nghiên cứu này tiến hành xác định nhiệt độ sấy thích hợp bằng cách tiến hành sấy chế phẩm ở một số nhiệt độ khác nhau trong thời gian 3h. Sau đó xác định độ ẩm và tỷ lệ sống sót của tế bào. Chế độ sấy thích hợp là chế độ cho tỷ lệ tế bào sống cao nhất và có độ ẩm < 12%.
Sơ đồ P I 1.4: Quy trình tạo chế phẩm lên men Natto Canh trường vi khuẩn 10% Môi trường NA lỏng bổ sung 2% glucoza; nuôi ơ 40 C, 30 h Ly tâm 7000 v/p; 15 ohút Sinh khối vi khuẩn Bột đậu tương Chất mang Thanh trùng (Ì10°C; 30 phút) Phối trộn Glucoza (25% w/w) Chế phẩm Chế phẩm lên men Sấy khô (35 C; 310
4.3ẻ Nghiên cứu đặc tính của chế phẩm
4.3Ệ1Ệ Xác định độ ẩm của chế phẩm lên men Natto
Chế phẩm sau sấy ở các nhiệt độ khác nhau được đo độ ẩm bằng máy sấy hồng ngoại. Mục đích của việc này là xác định độ ẩm của chế phẩm sau khi sấy nhằm tim ra phương pháp sấy thích hợp nhất cho việc bảo quản chế phẩm.
4.3.2. Xác định số lượng vỉ sinh vật trong chế phẩm và xác định tỷ lệ tế bào sống
Hoà lg chế phẩm vào 9 ml nước cất thanh trùng, pha loãng kế tiép dung dịch đến các nồng độ 10'2, 10'3, 10"4,... sau đó ứng với mỗi nồng độ pha loãng cấy trải dịch pha
loãng lên 3 đĩa thạch môi trường thích hợp. Đặt đĩa thạch trong tủ cấy 40°c, thời gian 18- 24 hể
Dùng phương pháp đếm khuẩn lạc và tính kết quả. Chỉ đếm các đĩa có ừ 30-300 khuẩn lạc.
Số lượng tế bào vi sinh vật trong lg chế phẩm được tính theo phương pháp đếm CFU (Colony forming unit- đơn vị hình thảnh khuẩn lạc) [7]. đếm 3 đĩa của mỗi nồng độ pha loãng và ết quả là giá trị trung bình cả 3 làn đếm.
* CFU của chế phẩm được tính theo công thức sau: N = (Ai X Di) / V
Trong đó
Ai: Số khuẩn lạc trung bình/đĩa. Di: Độ pha loãng.
V: Lượng dịch huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa (0,1 ml). * Tỷ lệ tế bào sống (TTS)
TTS= (CFUss/ CFUts) X (m ss/m Ts) Trong đó
CFUts: CFU trước khi sấy (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
CFUss: CFU sau khi sấy
m ss: Khối lượng chế phẩm sau khi sấy m TS: Khối lượng chế phẩm trước khi sấy [8].
5. Q uy trìn h sản x u ất N att
Sơ đồ PII. ố.ế Quy trình sản xuất Natto
Đậu tương Ngâm nước Hấp chín
(12-24 h; 25°C) (110°c,30 phút)
Chế phẩm (lg) Hoà tan Phối trộn
Nước cất (1 ml) (40°C; 24h)Lên men
Sản phẩm Tàng trữ
Natto (40°c, 48h)
5.1. Vật liệu
Đậu tương 500 g. Chế phẩm vi sinh vật
Lưa chon và ngâm đâu• • o •
Trước khi ngâm đậu tương phải phân loại đậu tương theo kích thước hạt. Đậu tương sử dụng phải đạt tiêu chuẩn như sau:
5.1.1. Kích thước
Đậu tương được phân thảnh 4 loại theo đường kính: Loại rất nhỏ d < 5,5 mm
Loại nhỏ vừa d = 5,5-7,3 mm Loại vừa d = 7,3-7,9 mm Loại lớn d > 7,9 mm
Kích thước: Người ta thường dùng loại đậu nhỏ và nhỏ vừa để làm natto. Một số nơi người ta lại thích dùng đậu tương loại to. Natto tò đậu tương nhỏ và nhỏ vừa có hương đặc trưng riêng và vị đậm do lên men quá mức. Có báo cáo cho rằng hoạt tính của protease kiềm tính (subtilisin) ở natto làm từ đậu nhỏ thì cao hơn từ đậu to. Tuy nhiên hoạt tính của protease trung tính (metalloprotease) thì không khác nhau với các kích