Nghiên cứu ở mức độ phân tử khả năng kháng carbapenem của một số vi khuẩn gram âm phân lập từ bệnh nhân tại bệnh viện việt đức và bệnh viện trung ương quân đội 108

Một số phương pháp hiện đại ứng dụng trong nghiên cứu cơ chế đề kháng carbapenem ở mức độ phân tử và khả năng lan truyền của các chủng vi khuẩn mang gen kháng .... Tình trạng vi khuẩn kh

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TRẦN DIỆU LINH

NGHIÊN CỨU Ở MỨC ĐỘ PHÂN TỬ KHẢ NĂNG

KHÁNG CARBAPENEM CỦA MỘT SỐ VI KHUẨN

GRAM ÂM PHÂN LẬP TỪ BỆNH NHÂN

TẠI BỆNH VIỆN VIỆT ĐỨC VÀ BỆNH VIỆN TRUNG ƯƠNG QUÂN ĐỘI 108

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2018

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TRẦN DIỆU LINH

NGHIÊN CỨU Ở MỨC ĐỘ PHÂN TỬ KHẢ NĂNG

KHÁNG CARBAPENEM CỦA MỘT SỐ VI KHUẨN

GRAM ÂM PHÂN LẬP TỪ BỆNH NHÂN

TẠI BỆNH VIỆN VIỆT ĐỨC VÀ BỆNH VIỆN TRUNG ƯƠNG QUÂN ĐỘI 108

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 62420107

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 GS TS Đặng Đức Anh

2 GS TS Phạm Văn Ty

Hà Nội - 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu khoa học của riêng tôi, tất cả các kết quả và số liệu trong luận án do chính tôi thực hiện

Tất cả các số liệu trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học trong nước và nước ngoài

Phần còn lại trong luận án chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác

Tác giả của luận án

Trần Diệu Linh

và thực hiện nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành luận án này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS BS Trần Huy Hoàng, Phó Trưởng khoa Vi khuẩn, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, là cố vấn khoa học trong suốt quá trình nghiên cứu, đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tôi thực hiện các nghiên cứu, tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận án này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS TS Timothy Walsh, Trường Đại học Cardiff, Anh và TS Masato Suzuki, Viện Nghiên cứu Quốc gia các Bệnh truyền nhiễm Nhật Bản đã hợp tác giải trình tự toàn bộ hệ gen vi khuẩn; TS Rogier Van Doorm, Đơn vị nghiên cứu lâm sàng Trường Đại học Oxford Hà Nội (OUCRU) đã

hỗ trợ phân tích kết quả, tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận án này

Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới các bạn đồng nghiệp của Phòng thí nghiệm Kháng sinh Khoa Vi khuẩn, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương và OUCRU

đã quan tâm, giúp đỡ, hỗ trợ tôi trong quá trình thực hiện nghiên cứu và hoàn thành luận án

Tôi xin gửi lời trân trọng cảm ơn tới:

 Ban giám đốc, Trung tâm Đảm bảo chất lượng xét nghiệm và Kiểm chuẩn, Khoa Vi khuẩn, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương;

 Ban giám đốc cùng toàn thể cán bộ Khoa Vi sinh vật và Khoa Sinh học phân

tử, Bệnh viện Trung ương Quân đội 108;

 Ban giám đốc cùng toàn thể cán bộ Khoa Vi sinh vật, Bệnh viện Hữu nghị Việt Đức

Cuối cùng tôi xin ghi nhớ công ơn sinh thành, nuôi dưỡng, dạy dỗ của cha mẹ tôi, cha mẹ chồng và sự ủng hộ, động viên, thương yêu, chăm sóc, khích lệ của chồng, con và các em, những người luôn ở bên tôi, là chỗ dựa vững chắc để tôi yên tâm học tập và hoàn thành luận án

Hà Nội, ngày tháng năm 2018

Trần Diệu Linh

Nghiên cứu được thực hiện sử dụng kinh phí của các đề tài/dự án:

- Đề tài cấp nhà nước "Đánh giá thực trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn tại

Việt Nam, xác định đặc điểm cấu trúc gen và yếu tố liên quan của các vi khuẩn kháng thuốc thường gặp ở Việt Nam" (Mã số: MOST: NHQT/SPĐP/02.16)

do TS Trần Huy Hoàng chủ nhiệm

- Đề tài nhánh “Dịch tễ học phân tử của các chủng Enterobacteriaceae và

Acinetobacter kháng carbapenem" thuộc Dự án "Phát triển và áp dụng các kỹ

thuật chẩn đoán chuyên sâu một số bệnh truyền nhiễm tại Việt Nam" giữa Viện

Vệ sinh dịch tễ Trung ương và Viện Nghiên cứu Quốc gia các Bệnh truyền nhiễm Nhật Bản giai đoạn 2016-2019 do TS Trần Huy Hoàng chủ nhiệm

1

MỤC LỤC

MỤC LỤC 1

CÁC TỪ VIẾT TẮT 4

DANH MỤC CÁC HÌNH 7

DANH MỤC CÁC BẢNG 9

MỞ ĐẦU 10

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 14

1.1 Vi khuẩn Gram âm và tính kháng kháng sinh 14

1.1.1 Vi khuẩn Gram âm 14

1.1.2 Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn Gram âm 15

1.1.3 Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn Gram âm 17

1.1.4 Cơ sở di truyền học của cơ chế kháng kháng sinh 21

1.2 Kháng sinh nhóm carbapenem và cơ chế kháng kháng sinh nhóm carbapenem của vi khuẩn Gram âm 25

1.2.1 Kháng sinh nhóm carbapenem 25

1.2.2 Cơ chế đề kháng kháng sinh nhóm carbapenem của vi khuẩn Gram âm 28

1.3 Một số phương pháp hiện đại ứng dụng trong nghiên cứu cơ chế đề kháng carbapenem ở mức độ phân tử và khả năng lan truyền của các chủng vi khuẩn mang gen kháng 41

1.3.1 Các phương pháp nghiên cứu đặc tính và cơ chế kháng carbapenem ở mức độ phân tử của các chủng vi khuẩn kháng thuốc 41

1.3.2 Các phương pháp nghiên cứu khả năng lan truyền của các chủng vi khuẩn mang gen kháng 44

1.4 Tình hình kháng kháng sinh nhóm carbapenem của vi khuẩn Gram âm trên thế giới và tại Việt Nam 46

1.4.1 Tình hình kháng kháng sinh nhóm carbapenem của vi khuẩn Gram âm trên thế giới 46

1.4.2 Tình hình kháng kháng sinh nhóm carbapenem của vi khuẩn Gram âm tại Việt Nam 51

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 54

2.1 Địa điểm nghiên cứu 54

2.2 Thiết kế nghiên cứu 54

2.3 Thời gian và địa điểm thực hiện nghiên cứu 54

2.3.1 Thời gian thực hiện 54

2.3.2 Địa điểm thực hiện 54

2.4 Đối tượng nghiên cứu 55

2

2.5 Cỡ mẫu nghiên cứu 55

2.5.1 Cỡ mẫu cho mục tiêu 1 55

2.5.2 Cỡ mẫu cho mục tiêu 2 56

2.6 Sơ đồ tóm tắt các bước nghiên cứu 58

2.6.1 Sơ đồ tóm tắt các bước nghiên cứu đáp ứng mục tiêu 1 58

2.6.2 Sơ đồ tóm tắt các bước nghiên cứu đáp ứng mục tiêu 2 59

2.7 Phương pháp nghiên cứu 59

2.7.1 Trang thiết bị chính 59

2.7.2 Nuôi cấy và định danh lại vi khuẩn 59

2.7.3 Tách chiết ADN 60

2.7.4 Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) 60

2.7.5 Giải trình tự gen 60

2.7.6 Thử nghiệm khả năng sinh enzyme carbapenemase của các chủng mang gen kháng bằng phương pháp Carba NP cải tiến (Carba NP - direct) 61

2.7.7 Thử nghiệm xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế sự phát triển của vi khuẩn (MIC) 62

2.7.8 Kỹ thuật điện di xung trường (PFGE) 63

2.7.9 Kỹ thuật giải trình tự toàn bộ hệ gen của vi khuẩn (WGS) 65

2.7.10 Kỹ thuật S1-PFGE và Southern blot 65

2.7.11 Kỹ thuật tiếp hợp vi khuẩn để truyền plasmid 66

2.8 Xử lý và phân tích số liệu 67

2.9 Kiểm soát tính chính xác và độ tin cậy của các kỹ thuật trong quá trình nghiên cứu 70

2.10 Đạo đức trong nghiên cứu 70

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 71

3.1 Một số đặc điểm chung của các chủng vi khuẩn phân lập tại 2 bệnh viện 71

3.2 Phát hiện sự có mặt của các gen mã hoá carbapenemase ở các chủng vi khuẩn kháng carbapenem phân lập tại 2 bệnh viện 74

3.3 Xác định khả năng sinh enzyme carbapenemase và mức độ nhạy cảm kháng sinh của các chủng vi khuẩn mang gen mã hoá carbapenemase 80

3.3.1 Xác định khả năng sinh enzyme carbapenemase của các chủng vi khuẩn mang gen mã hoá carbapenemase 80

3.3.2 Xác định mức độ nhạy cảm kháng sinh của các chủng vi khuẩn mang gen mã hoá carbapenemase theo tiêu chuẩn lâm sàng 82

3.4 Xác định mối liên hệ về kiểu gen của các chủng vi khuẩn mang gen mã hoá carbapenemase phân lập tại Bệnh viện Việt Đức và Bệnh viện Trung ương quân đội 108 92

3

3.4.1 Xác định mối liên hệ về kiểu gen của các chủng vi khuẩn sinh enzyme

carbapenemase trong nghiên cứu bằng kỹ thuật PFGE 92

3.4.2 Xác định mối liên hệ về kiểu gen và sequence type của các chủng vi khuẩn sinh enzyme carbapenemase tại Việt Nam và trên thế giới bằng kỹ thuật giải trình tự toàn bộ hệ gen của vi khuẩn 97

3.5 Xác định cơ chế lan truyền qua trung gian plasmid của các chủng vi khuẩn mang gen mã hoá carbapenemase 110

3.5.1 Xác định đặc điểm của các plasmid mang gen mã hoá carbapenemase 110

3.5.2 Xác định khả năng lan truyền gen kháng qua trung gian plasmid giữa các chủng vi khuẩn 117

3.6 Xác định cấu trúc của các yếu tố di truyền di động mang gen mã hoá carbapenemase 119

3.6.1 Cấu trúc của các yếu tố di truyền di động mang gen blaKPC-2 120

3.6.2 Cấu trúc của các yếu tố di truyền di động mang gen blaNDM-1 123

3.6.3 Cấu trúc của các yếu tố di truyền di động mang gen blaOXA-48 126

3.6.4 Cấu trúc của yếu tố di truyền di động mang gen blaIMP-1 127

3.6.5 Cấu trúc của yếu tố di truyền di động mang gen blaOXA-23 129

KẾT LUẬN 131

KIẾN NGHỊ 133

DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ ĐÃ XUẤT BẢN CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 134

TÀI LIỆU THAM KHẢO 135

PHỤ LỤC TÀI LIỆU

PHỤ LỤC 1: DANH SÁCH MẪU NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ THEO MỘT SỐ NỘI DUNG CỦA MỤC TIÊU 1

PHỤ LỤC 2: DANH SÁCH MẪU NGHIÊN CỨU ĐƯỢC GIẢI TRÌNH TỰ TOÀN BỘ HỆ GEN CỦA MỤC TIÊU 2

PHỤ LỤC 3: BẢNG PHIÊN GIẢI KẾT QUẢ MIC THEO TIÊU CHUẨN CLSI 2017

4

CÁC TỪ VIẾT TẮT Viết đầy đủ tiếng Anh Giải nghĩa tiếng Việt

A baumannii Acinetobacter baumannii Vi khuẩn Acinetobacter

baumannii

ATCC American Type Culture

DDD/100 Define daily dose/100 bed

days

Liều xác định trong ngày/100 ngày nằm viện

EDTA Ethylene diamine tetra acetic

Kháng sinh IMP Imipenem Kháng sinh Imipenem

Concentration

Nồng độ kháng sinh tối thiểu

ức chế sự phát triển của vi

khuẩn MLST Multi Locus Sequence

Typing

Phân loại trình tự đa locus

NCBI National Center for

Biotechnology Information

Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia, Hoa

Kỳ

carbapenem PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi

PFGE Pulsed-field Gel

Electrophoresis

Điện di xung trường

P aeruginosa Pseudomonas aeruginosa Trực khuẩn mủ xanh

SHV Sulphydryl variable enzyme Enzyme sulphydryl ly giải

kháng sinh phổ rộng SIM Seoul imipenemase Enzyme ly giải imipenem đặt

theo tên thủ đô Seoul

SME Serratia marcescens enzyme Enzyme Serratia marcescens

ly giải carbapenem SPM Sao Paulo metallo-beta-

lactamase

Enzyme lactamase-1 được đặt theo tên của thủ đô Sao Paulo

TEM β-lactamase named after a

Greek patient Temoneira

Enzyme beta-lactamase được đặt theo tên của bệnh nhân người Hy Lạp

tiến bổ sung Triton

VIM Verona integron-encoded

Metallo-lactamase

Enzyme Verona encoded Metallo-lactamase WGS Whole genome sequence Giải trình tự toàn bộ hệ gen vi

integron-khuẩn

7

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Đích tác động của các nhóm kháng sinh phổ biến ở tế bào vi khuẩn 17

Hình 1.2: Các cơ chế kháng kháng sinh phổ biến của các vi khuẩn Gram âm 17

Hình 1.3: Các cơ chế truyền gen ngang: tiếp hợp (A), biến nạp (B), tải nạp (C) và thông qua các yếu tố truyền gen (D) 23

Hình 1.4: Cấu trúc cơ bản của IS và transposon 24

Hình 1.5: Cấu trúc cơ bản của integron 25

Hình 1.6: Cấu trúc phân tử của carbapenem so với penicillin và cephalosporin 26

Hình 1.7: Các cơ chế đề kháng carbapenem chủ yếu của vi khuẩn Gram âm 29

Hình 1.8: Quá trình thuỷ phân carbapenem của họ enzyme carbapenemase sử dụng serine ở vị trí hoạt động (nhóm A và nhóm D) xúc tác cho quá trình thuỷ phân 30

Hình 1.9: Cấu trúc transposon Tn4410 chứa gen blaKPC 33

Hình 1.10: Cấu trúc di truyền của transposon chứa gen blaNDM-1 36

Hình 1.11: Cấu trúc của các dạng transposon Tn1999 mang gen blaOXA-48 40

Hình 1.12: Phân bố các chủng sinh enzyme KPC trên thế giới 47

Hình 1.13: Phân bố các chủng sinh enzyme NDM trên thế giới 48

Hình 1.14: Sự phân bố của các chủng sinh enzyme họ OXA-48-like trên thế giới 50 Hình 2.1: Các bước phân tích dữ liệu WGS để xác định các đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn mang gen mã hoá carbapenemase 69

Hình 3.1: Tỉ lệ phân bố các chủng vi khuẩn kháng carbapenem thu thập từ 2 bệnh viện 72

Hình 3.2: Tỉ lệ phân bố các chủng vi khuẩn theo loại mẫu thu thập từ 2 bệnh viện. 73

Hình 3.3: Hình ảnh đại diện cho phản ứng PCR phát hiện các gen mã hoá carbapenemase sử dụng các cặp mồi đặc hiệu 74

Hình 3.4: Hình ảnh đại diện cho kết quả xác định các biến thể của gen mã hoá carbapenemase và một số chủng mang đồng thời nhiều gen mã hoá carbapenemase 79

Hình 3.5: Hình ảnh đại diện cho thử nghiệm khả năng sinh enzyme carbapenemase của các chủng vi khuẩn mang gen kháng bằng phương pháp CarbaNP cải tiến 81

Hình 3.6: Mối liên hệ về kiểu gen giữa các chủng E coli mang gen mã hoá carbapenemase phân lập từ 2 bệnh viện 92

Hình 3.7: Mối liên hệ về kiểu gen giữa các chủng K pneumoniae mang gen kháng mã hóa carbapenemase phân lập từ 2 bệnh viện 94

Hình 3.8: Mối liên hệ về kiểu gen giữa các chủng A baumannii mang gen kháng mã hóa carbapenemase phân lập từ 2 bệnh viện 96

8

Hình 3.9: Cây phân loại kiểu gen của các chủng vi khuẩn E coli mang gen mã hoá

carbapenemase phân lập tại 2 bệnh viện nghiên cứu 98

Hình 3.10: Cây phân loại kiểu gen của các chủng vi khuẩn E coli mang gen mã hoá

carbapenemase phân lập tại 4 bệnh viện lớn của Hà Nội 100

Hình 3.11: Biểu đồ mối liên hệ và phân bố sequence type của vi khuẩn E coli mang

gen mã hoá carbapenemase theo các châu lục 102

Hình 3.12: Cây phân loại kiểu gen của các chủng vi khuẩn K pneumoniae mang gen

mã hoá carbapenemase phân lập tại 2 bệnh viện nghiên cứu 104

Hình 3.13: Cây phân loại kiểu gen của các chủng vi khuẩn K pneumoniae mang gen

mã hoá carbapenemase phân lập tại 4 bệnh viện lớn của Hà Nội 106

Hình 3.14: Biểu đồ mối liên hệ và phân bố sequence type của vi khuẩn K

pneumoniae mang gen mã hoá carbapenemase theo các châu lục 109

Hình 3.15: Kết quả phát hiện plasmid mang gen blaKPC của một số chủng vi khuẩn phân lập tại Bệnh viện TƯQĐ 108 và Việt Đức bằng kỹ thuật S1-PFGE và Southern blot 112

Hình 3.16: Kết quả phát hiện plasmid mang gen blaNDM của một số chủng vi khuẩn phân lập tại Bệnh viện TƯQĐ 108 và Việt Đức bằng kỹ thuật S1-PFGE và Southern blot 114

Hình 3.17: Kết quả phát hiện plasmid mang gen blaOXA-48-like của một số chủng vi khuẩn phân lập tại Bệnh viện TƯQĐ 108 và Việt Đức bằng kỹ thuật S1-PFGE và Southern blot 117

Hình 3.18: Các dạng cấu trúc của yếu tố di truyền di động mang gen blaKPC-2 121

Hình 3.19: Các dạng cấu trúc của yếu tố di truyền di động mang gen blaNDM-1 124

Hình 3.20: Cấu trúc của yếu tố di truyền di động mang gen blaOXA-48 127

Hình 3.21: Cấu trúc của yếu tố di truyền di động mang gen blaIMP-1 127

Hình 3.22: Cấu trúc của yếu tố di truyền di động mang gen blaOXA-23 129

Bảng 3.4: Kết quả thử nghiệm khả năng sinh carbapenemase của các chủng kháng

bằng phương pháp CarbaNP cải tiến 82

Bảng 3.5: Kết quả thử nghiệm nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế sự phát triển của

Bảng 3.8: Kết quả thử nghiệm nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế sự phát triển của

vi khuẩn A baumannii (n=90) (tiếp) 87

Bảng 3.9: Số lượng và loại plasmid chiếm ưu thế mang các gen mã hoá

carbapenemase 111

Bảng 3.10: Kết quả thử nghiệm tiếp hợp truyền plasmid giữa các chủng vi khuẩn

mang gen mã hoá carbapenemase và chủng vi khuẩn nhận E coli J53 118

10

MỞ ĐẦU

Vi khuẩn kháng kháng sinh là một vấn đề quan trọng và ảnh hưởng trực tiếp đến công tác chăm sóc, bảo vệ sức khoẻ cho con người Tổ chức Y tế thế giới cũng như các quốc gia phát triển như Anh, Mỹ đều đã gióng những hồi chuông cảnh báo về tốc

độ gia tăng tình trạng kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn gây bệnh thường gặp trên lâm sàng hiện nay Điều này nghiêm trọng tới mức một số nhà lãnh đạo nổi tiếng như nguyên thủ tướng Anh David Cameron, tổng giám đốc Tổ chức Y tế thế giới Margaret Chan hay nguyên tổng thống Mỹ Barack Obama đã phải lên tiếng cảnh báo

về tác động to lớn của nó đến đời sống, sức khoẻ con người, kinh tế và xã hội [218] Tình trạng vi khuẩn kháng kháng sinh càng nguy hiểm khi có sự xuất hiện và lây lan nhanh chóng của các chủng vi khuẩn kháng carbapenem, vì nhóm kháng sinh này vốn

được coi là kháng sinh thuộc “nhóm lựa chọn cuối cùng” sử dụng trong bệnh viện

để điều trị các trường hợp nhiễm trùng do vi khuẩn đa kháng thuốc hoặc kháng

colistin, là kháng sinh được khuyến cáo sử dụng trở lại như là liệu pháp điều trị cho

các trường hợp nhiễm khuẩn do vi khuẩn kháng carbapenem gây ra [104, 114] Với tốc độ lan rộng nhanh chóng và mức độ kháng của các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh hiện nay sẽ dẫn tới hậu quả là không còn kháng sinh điều trị hiệu quả trong 5-10 năm tới Do vậy tình trạnh vi khuẩn kháng kháng sinh đang giành được sự quan tâm đặc biệt của nhiều nhà khoa học trên thế giới với số lượng các nghiên cứu về vi khuẩn kháng kháng sinh ngày một tăng

Vi khuẩn kháng lại kháng sinh là một hiện tượng tự nhiên, tuy nhiên việc lạm dụng kháng sinh trong các lĩnh vực chăm sóc sức khoẻ, nông nghiệp và môi trường

là nguyên nhân hàng đầu tạo áp lực cho vi khuẩn kháng lại kháng sinh Sự lây lan nhanh chóng của vi khuẩn gây bệnh kháng kháng sinh có liên quan mật thiết đến năng lực chẩn đoán, kiểm soát nhiễm khuẩn trong các bệnh viện, điều kiện vệ sinh, khả năng tiếp cận nguồn nước sạch của người dân (đặc biệt là tại các quốc gia đang phát triển) và sự gia tăng đi lại, thông thương trong thời đại toàn cầu hoá Trong số các nguyên nhân hàng đầu dẫn đến sự lan rộng nhanh chóng của vi khuẩn kháng kháng sinh, sự lan truyền trong các cơ sở y tế đứng hàng thứ 3 [90]

11

Việt Nam nằm trong khu vực châu Á được xem là "điểm nóng" của vi khuẩn kháng kháng sinh Nhận thức sâu sắc được tầm quan trọng của vấn đề này, trong những năm vừa qua, Bộ Y tế cùng các ban ngành liên quan đang phối hợp với các tổ chức, quốc gia trên thế giới triển khai các hoạt động các hoạt động phòng chống vi khuẩn kháng kháng sinh với các tổ chức, quốc gia trên thế giới Hiện nay các báo cáo cho thấy tại Việt Nam vi khuẩn Gram âm đã kháng lại carbapenem trong các bệnh

viện ở mức độ cao Hai căn nguyên gây nhiễm khuẩn bệnh viện thường gặp là P

aeruginosa và A baumannii được đánh giá ở 6 bệnh viện năm 2008 cho thấy: 20%

các chủng P aeruginosa và 50% các chủng A baumannii kháng kháng sinh nhóm carbapenem [80] Một số nghiên cứu đã chỉ ra vai trò của các gen blaNDM-1, blaKPC,

blaOXA-23 và blaOXA-58 trong cơ chế kháng carbapenem của vi khuẩn Gram âm được phân lập tại một số bệnh viện ở Việt Nam và bước đầu xác định được một số đặc điểm dịch tễ học phân tử của các vi khuẩn kháng carbapenem được phân lập [16, 200, 201] Các kết quả nghiên cứu này đã từng bước giúp chúng ta có được những thông tin hữu ích về các khía cạnh: dịch tễ học, lâm sàng, các yếu tố nguy cơ, đặc điểm về

vi sinh và sinh học phân tử của vi khuẩn kháng carbapenem tại Việt Nam

Tuy nhiên các nghiên cứu trên cho thấy còn một số vấn đề cần được làm sáng

tỏ bao gồm: (i) Số lượng chủng kháng carbapenem được xác định mang gen bla

NDM-1, blaKPC, blaOXA-23 và blaOXA-58 thấp hơn nhiều so với tổng số chủng kháng carbapenem phát hiện được [7, 8, 193]; (ii) Những điểm tương đồng hoặc khác biệt giữa các chủng mang gen kháng phân lập tại các bệnh viện Việt Nam với các chủng kháng trên thế giới cũng chưa được làm rõ nhất là trong bối cảnh giao thông và du lịch phát triển mạnh, tạo cơ hội cho sự lây lan của các chủng kháng trên phạm vi toàn cầu; (iii) đặc biệt chưa đi sâu tìm hiểu đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn kháng carbapenem phân lập tại Việt Nam Ngoài ra trong 5 năm trở lại đây, với sự ra đời của các kỹ thuật tiên tiến như giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS) và các phần mềm tin sinh học phân tích hệ gen đã trở thành những công cụ đắc lực cho các nhà nghiên cứu, cung cấp những bằng chứng khoa học có độ tin cậy rất cao

12

Do đó, việc xác định sự tồn tại của các gen mã hoá sinh tổng hợp enzyme carbapenemase (gọi tắt là gen mã hoá carbapenemase) khác, làm rõ mối liên hệ về kiểu gen, sequence type (ST) giữa các chủng mang gen kháng ở Việt Nam và trên thế giới cũng như tìm hiểu rõ hơn về đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn Gram âm kháng carbapenem phân lập trong những bệnh viện lớn đã trở thành nhu cầu cấp thiết

và là cơ sở để chúng tôi thực hiện đề tài: "Nghiên cứu ở mức độ phân tử khả năng

kháng carbapenem của một số vi khuẩn Gram âm phân lập từ bệnh nhân tại Bệnh viện Việt Đức và Bệnh viện Trung ương Quân đội 108" Kết quả nghiên cứu này sẽ

giúp bổ sung các thông tin quan trọng về cơ chế kháng phổ biến nhất là sinh enzyme carbapenemase ở mức độ phân tử, sự lây lan của các chủng vi khuẩn Gram âm kháng carbapenem theo cơ chế này tại Việt Nam và mối liên hệ với các chủng vi khuẩn kháng carbapenem trên thế giới, làm cơ sở khoa học để đưa ra các biện pháp kiểm soát nhiễm khuẩn hiệu quả trong bệnh viện, đồng thời góp phần giảm gánh nặng và nguy cơ lan truyền vi khuẩn kháng thuốc ra ngoài cộng đồng

Mục tiêu của đề tài:

1 Phát hiện sự có mặt của các gen mã hoá carbapenemase ở các chủng vi

khuẩn E coli, K pneumoniae, A baumannii kháng carbapenem phân lập tại Bệnh

viện Việt Đức và Bệnh viện Trung ương Quân đội 108

2 Xác định được một số đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn mang gen

mã hoá carbapenemase phân lập tại Bệnh viện Việt Đức và Bệnh viện Trung ương Quân đội 108

Nội dung của đề tài:

1 Phát hiện sự có mặt của gen mã hoá carbapenemase ở các chủng vi khuẩn

E coli, K pneumoniae, A baumannii kháng carbapenem phân lập tại 2 bệnh viện;

2 Xác định khả năng sinh enzyme carbapenemase và mức độ nhạy cảm kháng sinh của các chủng mang gen mã hoá carbapenemase;

Những đóng góp mới của đề tài:

1 Là nghiên cứu có hệ thống đầu tiên ở Việt Nam áp dụng kỹ thuật giải trình

tự toàn bộ hệ gen của vi khuẩn để xác định cơ chế kháng carbapenem ở mức độ phân

tử bằng con đường sinh tổng hợp enzyme carbapenemase của một số chủng vi khuẩn Gram âm gây nhiễm trùng phổ biến phân lập từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng

2 Kết quả nghiên cứu bước đầu cho thấy mối liên hệ về kiểu gen, sequence type giữa các chủng vi khuẩn kháng carbapenem trong nghiên cứu này với các chủng

vi khuẩn kháng carbapenem trên thế giới, qua đó cung cấp các thông tin hữu ích về nguồn gốc và sự lây lan của các chủng vi khuẩn Gram âm kháng carbapenem tại các địa điểm nghiên cứu, làm cơ sở đề xuất các biện pháp kiểm soát nhiễm khuẩn để giảm nguy cơ lây truyền vi khuẩn kháng thuốc ra cộng đồng

3 Nghiên cứu đầu tiên về đặc điểm phân tử của các plasmid và yếu tố di truyền di động mang gen mã hoá carbapenemase

14

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 VI KHUẨN GRAM ÂM VÀ TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH

1.1.1 Vi khuẩn Gram âm

Vi khuẩn Gram âm là một nhóm vi khuẩn có lớp màng kép: trong cùng là màng sinh chất, tiếp theo là một lớp peptidoglycan mỏng nằm trong khoang chu chất và sau

đó tới màng ngoài Lớp màng ngoài là phức hợp lipidpolysaccharide nội độc tố gồm lipoprotein và lipopolysaccharide Màng ngoài có cấu trúc gần giống màng tế bào chất nhưng phospholipid hầu như chỉ gặp ở lớp trong, còn ở lớp ngoài là lipopolysaccharide dày khoảng 8-10 nm gồm 3 thành phần: Lipid A, Polysaccharide lõi và kháng nguyên O [2] Màng ngoài còn có thêm các protein:

Protein cơ chất: porin ở vi khuẩn còn gọi là protein lỗ xuyên màng với chức năng cho phép một số loại phân tử đi qua chúng như dipeptide, disaccharide, các ion

vô cơ…;

- Protein màng ngoài: chức năng vận chuyển một số phân tử riêng biệt và đưa qua

màng ngoài như: nucleotide, vitamin B12…;

- Lipoprotein: đóng vai trò liên kết lớp peptidoglycan bên trong với lớp màng

ngoài

Ở mặt ngoài của một số vi khuẩn Gram âm có những sợi nhỏ và ngắn gọi là pili, được chia thành 2 loại là pili chung và pili giới tính Pili chung giúp vi khuẩn bám lên các bề mặt qua đó quyết định tính chất ngưng kết hồng cầu của vi khuẩn Pili giới tính lại đóng vai trò quan trọng là cầu nối truyền ADN từ tế bào vi khuẩn cho sang tế bào vi khuẩn nhận trong quá trình tiếp hợp [2]

Cũng như nhiều loại sinh vật, trong hệ gen của vi khuẩn có nhiều gen chịu trách nhiệm tổng hợp nhiều loại sản phẩm khác nhau cho quá trình sống, sinh trưởng và phát triển của chúng Điều đặc biệt là có nhiều gen cực kỳ quan trọng của vi khuẩn lại không nằm trong hệ gen của chúng mà định vị trên những ADN vòng tách biệt, nằm rải rác trong nguyên sinh chất của vi khuẩn gọi là các plasmid

Plasmid là một phân tử ADN, có cấu trúc khép lại thành vòng tròn độc lập, có khả năng tồn tại và nhân lên một cách độc lập với hệ gen của tế bào chủ và tương tác,

15

hoạt động vững bền với tế bào chủ Giữa chúng và hệ gen của tế bào vật chủ có sự tương tác cộng sinh và chi phối lẫn nhau Do vậy plasmid của loại vi khuẩn nào thường chỉ thích nghi với loại vi khuẩn đó Tương tự, vi khuẩn chỉ tiếp nhận những plasmid mà chúng là tế bào vật chủ của các loại plasmid đó [2]

Plasmid thường chứa các gen mã hoá khả năng sinh tổng hợp kháng sinh, đồng thời cũng mang các gen sinh tổng hợp sản phẩm kháng lại kháng sinh Ở một số vi sinh vật gây bệnh cho người và động vật, chúng còn là chủ nhân của một số gen sinh tổng hợp các loại độc tố và các protein có hoạt tính cao có chức năng tăng cường độc lực cho vi khuẩn Do plasmid là một công cụ giúp vận chuyển ADN từ cá thể này sang cá thể khác thông qua hiện tượng truyền gen ngang nên chúng đóng vai trò cực

kỳ quan trọng trong lĩnh vực y, sinh, nông, dược và môi trường Tuy nhiên vi khuẩn Gram âm cũng là căn nguyên phổ biến của các bệnh nhiễm trùng phổ biến trong cộng đồng và trong môi trường bệnh viện, gây ra những tổn thất to lớn cả về sức khỏe, kinh tế và xã hội

1.1.2 Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn Gram âm

Cho đến nay biện pháp điều trị chủ yếu cho các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn gây ra là sử dụng kháng sinh Kháng sinh là những chất kháng khuẩn do các chủng

vi sinh vật (vi khuẩn, nấm…) sản sinh ra hoặc được tổng hợp nhân tạo, có tác dụng

ức chế sự phát triển hoặc tiêu diệt vi khuẩn ngay ở nồng độ thấp Có thể phân loại kháng sinh theo cấu trúc phân tử hoặc hóa học (ví dụ: betalactam, macrolides, tetracycline, quinolones, aminoglycosides, sulphonamides…), theo cơ chế tác dụng (ví dụ: ức chế tổng hợp thành tế bào, ức chế tổng hợp protein…) hoặc theo phổ tác dụng (ví dụ: kháng sinh phổ hẹp, phổ rộng) [6]

Những chủng vi khuẩn kháng thuốc đầu tiên được phát hiện trong các bệnh viện

là nơi sử dụng rất nhiều kháng sinh Chủng vi khuẩn Streptoccoccus pyogenes kháng

sulfonamide được phát hiện trong một bệnh viện quân đội vào những năm 1930 Theo

sau là chủng Staphylococcus aureus kháng penicillin hoành hành ở các bệnh viện

London vào những năm 1940, không lâu sau khi đưa penicillin vào sử dụng trong điều trị Các chủng đa kháng (kháng lại nhiều loại kháng sinh) được phát hiện đầu

16

tiên ở vi khuẩn đường ruột như Escherichia coli (E coli), Shigella và Salmonella vào

cuối những năm 1950 đến đầu những năm 1960 [109] Từ đó, tình trạng kháng kháng sinh nhanh chóng lan rộng ra khắp các quốc gia trên thế giới, cho thấy một mối đe dọa nghiêm trọng với sức khỏe cộng đồng (với nhiều ca tử vong do điều trị thất bại các vi khuẩn kháng thuốc) và những phí tổn về mặt kinh tế và xã hội [47, 110] Ở

Mỹ, ước tính thiệt hại do các vi sinh vật kháng thuốc gây ra dao động trong khoảng

$150 triệu tỉ đến $30 tỉ đô la mỗi năm nhưng con số thực tế còn gấp nhiều lần nếu tính cả mức độ ảnh hưởng tới cộng đồng [110]

Tính đề kháng của vi khuẩn có thể bắt nguồn từ hai yếu tố: yếu tố di truyền quy định tính đề kháng của vi sinh vật và hoạt tính của kháng sinh đã ức chế các vi khuẩn nhạy và chọn lọc những vi khuẩn kháng Tính đề kháng sẽ phát triển khi có mặt đồng thời 2 yếu tố này trong môi trường hoặc vật chủ Các gen quy định đặc tính kháng và

tế bào vi khuẩn sẽ cùng nhân lên và lan rộng dưới áp lực chọn lọc của kháng sinh có trong môi trường [110] Mặc dù có hơn 15 nhóm kháng sinh tác động vào tế bào vi khuẩn theo nhiều cơ chế khác nhau (Hình 1.1) nhưng tất cả đều không tránh khỏi các

cơ chế kháng của vi khuẩn

17

Hình 1.1: Đích tác động của các nhóm kháng sinh phổ biến ở tế bào vi khuẩn [121]

1.1.3 Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn Gram âm

Nhìn chung, cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn Gram âm khá đa dạng (Hình 1.2) và thường được phân chia thành 3 nhóm cơ chế chính: làm giảm sự hấp thụ kháng sinh vào bên trong tế bào vi khuẩn; thay đổi đích tác động của kháng sinh và sản sinh

ra các enzyme để ức chế hoặc biến đổi kháng sinh [36]

Hình 1.2: Các cơ chế kháng kháng sinh phổ biến của các vi khuẩn Gram âm [154]

1.1.3.1 Làm giảm sự hấp thụ kháng sinh

Vi khuẩn Gram âm có thể làm giảm sự hấp thụ kháng sinh bằng cách hạn chế kháng sinh chui vào bên trong tế bào, tăng cường việc bơm đẩy kháng sinh ra ngoài

tế bào hoặc kết hợp cả 2 phương thức này

So với vi khuẩn Gram dương, lớp màng ngoài của vi khuẩn Gram âm tạo nên một lớp hàng rào bảo vệ cho tế bào vi khuẩn Vì vậy đa số các nhóm kháng sinh kỵ nước như aminoglycosides, rifamycins và macrolides sẽ khuếch tán qua màng lipid kép của tế bào vi khuẩn còn nhóm β-lactams sẽ đi vào bên trong qua protein lỗ màng

18

(porins) nằm trên màng ngoài tế bào [57] Bằng việc thay đổi cấu trúc của lỗ màng hoặc loại bỏ lỗ màng, vi khuẩn Gram âm sẽ hạn chế được kháng sinh đi vào bên trong

tế bào Ví dụ việc mất lỗ màng ở A baumannii được cho là căn nguyên của tính đề

kháng với imipenem and meropenem [82] Kết quả một nghiên cứu khác cũng chỉ ra

tính kháng carbapenem của Enterobacteriaceae tăng đáng kể do xuất hiện đột biến

làm giảm quá trình tổng hợp lỗ màng hoặc thay đổi sang loại lỗ màng khác [220]

Cơ chế chủ động bơm đẩy kháng sinh ra ngoài tế bào giúp vi khuẩn Gram âm

đề kháng với hầu hết các loại kháng sinh (trừ polymyxin) Một số loại bơm đẩy đặc hiệu với một nhóm kháng sinh (ví dụ bơm Tet đặc hiệu với tetracycline), nhưng đa

số các loại bơm đẩy có tác dụng với nhiều nhóm kháng sinh (bơm đẩy đa kháng) khác

nhau như bơm AcrB-TolC ở E coli có thể đẩy fluoroquinolones, β-lactams,

tetracycline, chloramphenicol, acriflavine, trimethoprim ra ngoài tế bào vi khuẩn [82] Mặc dù ban đầu các gen mã hóa bơm đẩy đa kháng đều nằm trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn nhưng gần đây đã có bằng chứng khoa học cho thấy các gen này di chuyển sang plasmid, qua đó có thể lan truyền sang các cá thể cùng loài hay thậm chí khác loài [64]

1.1.3.2 Thay đổi đích tác động

Thành tế bào đóng một vai trò quan trọng trong sự tồn tại và sinh trưởng của vi khuẩn, vì thế các enzyme tham gia vào quá trình tổng hợp thành tế bào trở thành đích tác động của nhiều loại kháng sinh Thay đổi phổ biến nhất trong kiểu kháng này là đột biến ở protein gắn penicillin (Penicillin-Binding Proteins - PBP), làm giảm ái lực với kháng sinh β-lactam Hoặc để hạn chế nhóm kháng sinh polymyxin gắn vào màng,

vi khuẩn, đặc biệt là họ Acinetobacter spp., có thể thay đổi cấu trúc lipid A của màng

ngoài tế bào vi khuẩn [154]

Đối với quá trình tổng hợp protein, các đột biến ở rARN 23S của tiểu phần ribosome 50S đã làm giảm ái lực gắn với các kháng sinh nhóm macrolides, lincosamides và streptogramin B [82] Nếu đột biến ở gen mã hóa rARN 16S giúp vi

khuẩn kháng lại aminoglycosides thì các đột biến ở gen gyrA và parC (mã hóa ADN

1.1.3.3 Sinh tổng hợp enzyme ức chế hoặc biến đổi kháng sinh

Vi khuẩn có thể sinh tổng hợp các enzyme nhằm biến đổi kháng sinh thông qua

3 hình thức: ly giải, chuyển nhóm và oxi-hóa khử

1.1.3.3.1 Các enzyme ly giải kháng sinh

Nhiều loại kháng sinh thông dụng có các liên kết hóa học ở dạng ester hay amide, dễ dàng bị ly giải dưới tác dụng của các enzyme làm đứt gẫy các liên kết này Loại enzyme ly giải phổ biến nhất là β-lactamase, cắt liên kết amide trong vòng β-lactam của kháng sinh nhóm β-lactam để ngăn không cho kháng sinh tiếp cận với PBP Có thể phân loại β-lactamase theo đặc điểm cấu trúc phân tử hoặc theo chức năng, nhưng cách phân loại phổ biến nhất là theo cấu trúc phân tử với 4 nhóm A, C,

D (sử dụng serine ở vị trí 70 để ly giải vòng β-lactam) và nhóm B, hay còn gọi là metallo-β-lactamase (sử dụng ion để làm mất hoạt tính vòng β-lactam) [52] Cấu trúc tinh thể của các β-lactamase nhóm A, C và D cũng như các transpeptidases khá tương đồng cho thấy 3 nhóm này có thể tiến hóa từ cùng một nguồn gốc là các enzyme ly giải penicillin Tuy nhiên cấu trúc của các enzyme nhóm B lại chỉ ra sự tiến hóa từ một nguồn gốc độc lập với các nhóm còn lại [219]

Các loại enzyme β-lactamase có ý nghĩa nhất trong lâm sàng thường do các gen nằm trên nhiễm sắc thể hoặc plasmid mã hóa Các gen này có thể truyền giữa các vi khuẩn cùng loài hoặc giữa các loài khác nhau thông qua plasmid, transposon hoặc integron [22] Đặc điểm này làm cho cơ chế kháng kháng sinh thông qua sản sinh β-

Ngoài β-lactamase có thể làm đứt gãy các liên kết amide, các esterases như erythromycin esterase II lại phá vỡ các liên kết ester và các epoxidases mở vòng giúp

vi khuẩn kháng lại các kháng sinh macrolide và fosfomycin [75]

1.1.3.3.2 Các enzyme chuyển nhóm

Các enzyme ức chế kháng sinh aminoglycosides, chloramphenicol, streptogramin, macrolides hoặc rifampicin được gọi là các transferases (chuyển nhóm) sẽ gắn thêm các nhóm adenylyl, phosphoryl hoặc acetyl vào vùng ngoại vi của phân tử kháng sinh, qua đó biến đổi khả năng gắn vào đích tác động của kháng sinh

Vi khuẩn có thể chuyển nhóm theo nhiều phương thức khác nhau bao gồm acylation và N-acylation, O-phosphorylation, O-nucleotidylation, O-ribosylation, O-glycosylation và thiol [70] Do tất cả các biến đổi cộng hóa trị này đều cần sự có mặt của ATP, acetyl-CoA, NAD+, UDP-glucose, hoặc glutathione nên các enzyme này chỉ có hoạt tính trong tế bào chất Các enzyme phổ biến của loại này là phosphoryltransferases, nucleotidyltransferases hoặc adenylyltransferases và acetyltransferases làm giảm ái lực gắn, qua đó ngăn tác động của kháng sinh nhóm aminoglycosides và fluoroquinolones [120, 190]

O-1.1.3.3.3 Các enzyme oxi hóa khử

Mặc dù hiếm gặp nhưng kết quả của các nghiên cứu vẫn chứng minh được vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp ra các enzyme thực hiện phản ứng oxi hóa khử, làm

mất hoạt tính của kháng sinh Ví dụ enzyme TetX được vi khuẩn kị khí Bacteroides

fragilis sinh tổng hợp để oxi hóa kháng sinh tetracycline TetX sẽ xúc tác quá trình

21

monohydroxylation của tetracycline tại vị trí 11a, làm biến đổi vị trí gắn với đích tác động của kháng sinh này [228]

1.1.4 Cơ sở di truyền học của cơ chế kháng kháng sinh

Đặc tính kháng kháng sinh của vi khuẩn có thể là đề kháng tự nhiên hoặc đề kháng thu được

Đề kháng tự nhiên là đặc điểm sinh học của một loài, thường có được do yếu

tố di truyền với mục đích bảo vệ vi khuẩn khỏi tác động của kháng sinh Đặc điểm này xuất hiện ở tất cả các cá thể của loài một cách tự nhiên thay vì là kết quả của áp lực chọn lọc từ môi trường hoặc hiện tượng truyền gen ngang (Horizontal gene tranfers) Ví dụ điển hình của đề kháng tự nhiên là vi khuẩn Gram âm đề kháng với nhiều loại kháng sinh có hiệu lực với vi khuẩn Gram dương nhờ cấu trúc tế bào có thêm lớp màng ngoài do đó làm giảm tính thấm của màng tế bào [6] Ngoài ra các lỗ màng cũng hạn chế sự xâm nhập của kháng sinh thông qua sự sàng lọc về kích cỡ, tính chất kỵ nước [48]

Mặt khác, đề kháng thu được là đề kháng có được nhờ đột biến gen, nhận được

gen đề kháng từ bên ngoài thông qua truyền gen ngang hoặc kết hợp cả 2 cơ chế này

Đề kháng thu được không xảy ra ở tất cả các cá thể của loài mà chỉ giới hạn ở một số dòng vi khuẩn chịu áp lực chọn lọc kháng sinh [170]

thông qua việc tăng cường biểu hiện của bơm đẩy lại do đột biến ở promoter gây ra

Điển hình là ở P.aeruginosa, với đột biến ở gen điều hòa (mexR) trong hệ thống bơm

đẩy MexAB-OprM đã dẫn đến việc tăng cường biểu hiện của MexAB-OprM, qua đó tăng đáng kể tính kháng với nhóm kháng sinh β-lactams [161] Các đột biến này cũng

22

đóng vai trò quan trọng trong các cơ chế đề kháng khác như thay đổi đích tác động, hay thay đổi khả năng xâm nhập của kháng sinh qua màng tế bào

Trong tự nhiên, tần suất đột biến được duy trì ở mức rất thấp là nhờ cơ chế bảo

vệ và sửa chữa ADN cũng như cơ chế sửa chữa lỗi sai trong quá trình sao chép ADN của vi khuẩn Tuy nhiên cũng có những loài có tỉ lệ đột biến cao hơn đáng kể so với

các loài thông thường như E coli, P aeruginosa và một số vi khuẩn Gram dương

khác [58] Chúng đóng một vai trò rất quan trọng trong sự tiến hóa của tính đề kháng kháng sinh

Ngoài ra sự xuất hiện của các yếu tố chọn lọc nhưng không tiêu diệt vi khuẩn trong môi trường cũng góp phần sản sinh ra các “đột biến thích nghi” Loại đột biến này là một trong những nguyên nhân chính dẫn đến tình trạng kháng kháng sinh của

vi khuẩn trong tự nhiên, ví dụ như E coli và Enterobacter spp đã nhanh chóng tạo

ra các đột biến trong các gen mã hóa protein lỗ màng cũng như các protein điều hòa biểu hiện của protein lỗ màng dưới áp lực chọn lọc trong môi trường có carbapenem [137, 198]

1.1.4.2 Truyền gen ngang

Cơ chế chủ yếu lan truyền gen kháng kháng sinh là thông qua việc “truyền ngang” các vật liệu di truyền từ một vi khuẩn này sang một vi khuẩn khác theo bốn phương thức: tiếp hợp, biến nạp, tải nạp và thông qua các yếu tố truyền gen (Hình 1.3) Các gen kháng kháng sinh có thể đi vào tế bào vi khuẩn ở dạng cả plasmid mang gen kháng kháng sinh hoặc chỉ có đoạn gen kháng kháng sinh để rồi sau đó tồn tại như 1 plasmid độc lập hoặc tích hợp vào plasmid/ nhiễm sắc thể của tế bào vi khuẩn nhận [82]

23

Hình 1.3: Các cơ chế truyền gen ngang: tiếp hợp (A), biến nạp (B), tải nạp (C) và thông

qua các yếu tố truyền gen (D) [207]

Tiếp hợp (conjugation) là quá trình truyền ADN từ tế bào cho đến tế bào nhận thông qua tiêm mao trên bề mặt tế bào (pili) hoặc yếu tố bám (adhesin) Quá trình này được hỗ trợ nhờ các gen trên các plasmid tự nhân lên hoặc các yếu tố tiếp hợp tích hợp vào nhiễm sắc thể, qua đó cho phép truyền plasmid giữa các cá thể [207] Biến nạp (transformation) là quá trình vi khuẩn hấp thụ, tích hợp và biểu hiện các đoạn ADN trần ngoại bào Đây cũng là cách nhiều gen kháng kháng sinh đi vào tế bào vi khuẩn Mặt khác, bacteriophage (thực khuẩn thể) cũng đóng vai trò quan trọng trong cơ chế tải nạp (transduction), giúp cho tế bào vật chủ cũng như chính bản thân chúng có thể sống sót và nhân lên Trong quá trình nhân lên của phage, các tiểu thể (particle) bao gồm ADN của tế bào vật chủ có thể được tích hợp vào bộ gen của phage, do đó sẽ được truyền từ tế bào vật chủ này sang tế bào vật chủ khác Ở một số

ít loài vi khuẩn (ví dụ: Desulfovibrio desulfuricans) ADN còn được truyền thông qua

các yếu tố truyền gen (Gene transfer agents – GTA) GTA mang một đoạn ADN ngẫu nhiên của tế bào vật chủ, nhưng không mang ADN mã hóa cho các protein cần thiết cho việc tự nhân lên của nó hay nói cách khác là nó không truyền trọn vẹn toàn bộ các gen cấu trúc của nó sang tế bào mới [207] Đây là điểm khác biệt chủ yếu giữa

IS là các yếu tố di truyền di động, thường có kích thước dao động trong khoảng

từ 0,5 kbp đến 2 kbp, mang 1 hoặc 2 gen mã hóa enzyme transposase (tnp) và có đoạn lặp đảo ngược (Inverted Repeats - IR) ở 2 đầu là điểm gắn của transposase Transposase nhận biết các đoạn lặp đảo ngược, từ đó thực hiện việc “cắt – dán” để di chuyển đoạn IS sang vị trí mới [148] Khi di chuyển sang vị trí mới IS sẽ tạo ra các trình tự lặp xuôi (Direct Repeats - DR) thường có kích thước từ 2 -14 bp ở 2 đầu của

vị trí mới Trước đây, điểm khác biệt dùng để phân biệt giữa IS và transposon là ở chỗ IS chỉ chứa gen mã hóa cho chức năng di chuyển mà không chứa các gen có chức năng khác trong khi transposon sẽ chứa thêm các gen mã hóa đặc tính khác ví dụ gen kháng kháng sinh [83]

Trong nhiều trường hợp, một cặp IS có thể di chuyển cùng nhau kèm theo một hoặc một vài gen (ví dụ gen kháng kháng sinh) nằm ở giữa sẽ tạo thành một transposon (composit transposon), thường ký hiệu là Tn Ở 2 đầu của transposon cũng

sẽ có trình tự lặp DR (Hình 1.4)

IS Transposon

Hình 1.4: Cấu trúc cơ bản của IS và transposon [148]

Gene cassette là yếu tố di động nhỏ nhất, có kích thước dao động từ 500 – 1000

bp vừa đủ để mang một gen thường là gen kháng kháng sinh, một vị trí gắn ribosome (nhưng không kèm với promoter) và một vị trí tái tổ hợp attC Mặc dù gen cassette

có thể tồn tại ở dạng phân tử mạch vòng nhưng nó lại không thể tự di chuyển và do vậy thường chèn vào các integron (Hình 1.5) Cấu trúc của integron bao gồm một vị

25

trí tái tổ hợp attI, một gen intI (mã hóa cho enzyme integrase IntI xúc tác quá trình tái

tổ hợp đặc hiệu giữa vị trí attI1 và vị trí attC trên gen cassette hoặc giữa 2 vị trí attC

để chèn thêm hoặc loại bỏ gen cassette) và một promoter [148] Khi một gen cassette chèn vào một integron tại vị trí attI, vị trí tái tổ hợp này sẽ được tái tạo để cassette thứ hai, thứ ba có thể tiếp tục chèn vào Các cassette này sẽ tách biệt nhau bởi vị trí attC, và tạo thành gene array đóng vai trò như các operon (Hình 1.5) [83]

Hình 1.5: Cấu trúc cơ bản của integron [83]

1.2 KHÁNG SINH NHÓM CARBAPENEM VÀ CƠ CHẾ KHÁNG KHÁNG SINH NHÓM CARBAPENEM CỦA VI KHUẨN GRAM ÂM

I Qua quá trình phát triển, nhiều kháng sinh khác thuộc nhóm này cũng hình thành với việc bổ sung một nhóm methyl vào vị trí 1-β, giúp bảo vệ chúng khỏi sự thủy phân (như meropenem, biapenem, ertapenem và doripenem…) Như vậy, tương tự

26

các nhóm kháng sinh β-lactam khác, nhóm carbapenem cũng chứa vòng β-lactam nhưng có một số thay đổi trong cấu trúc phân tử như: nguyên tố lưu huỳnh được thay thế bằng nguyên tố các-bon ở vị trí số 1, sắp xếp chuỗi hydroxyethyl ở vị trí “chiến

lược” R2 và cấu hình trans ở vị trí các-bon số 5 và 6 (Hình 1.6) Chính đặc điểm này

đã giúp các kháng sinh nhóm này có thể tiêu diệt vi sinh vật phổ rộng hơn (vi khuẩn Gram âm, Gram dương và cả vi khuẩn kị khí) và bền hơn trước sự tác động của các enzyme β-lactamase so với penicillin và cephalosporin [146]

Hình 1.6: Cấu trúc phân tử của carbapenem so với penicillin và cephalosporin [146]

Cơ chế tác động của kháng sinh nhóm carbapenem là gắn và bất hoạt PBP, qua

đó ức chế quá trình hình thành peptidoglycan của thành tế bào vi khuẩn [131] Quá trình bất hoạt này diễn ra ở gần bề mặt tế bào vi khuẩn Gram dương Tuy nhiên, đối với vi khuẩn Gram âm, carbapenem phải chui qua màng tế bào thông qua lỗ màng để vào bên trong khoang chu chất, acylate hóa PBP Chính khả năng chui qua lỗ màng

tế bào vi khuẩn, sở hữu ái lực cao với nhiều loại PBP khác nhau và có thể kháng lại nhiều loại β-lactamase là cơ sở tạo nên hiệu lực cao của carbapenem đối với phổ rộng các vi sinh vật [131]

Hiện nay, hơn một nửa số kháng sinh đang lưu hành trên thị trường thuộc nhóm β-lactam, trong đó carbapenem là nhóm kháng sinh được xem là “sự lựa chọn cuối cùng” thường được chỉ định điều trị các trường hợp nhiễm trùng nặng hoặc nhiễm trùng do vi khuẩn kháng kháng sinh phổ rộng Các kháng sinh thuộc nhóm carbapenem sử dụng phổ biến trong lâm sàng bao gồm: imipenem, meropenem, doripenem và ertapenem Mặc dù cùng thuộc nhóm carbapenem nhưng đặc điểm của

4 loại kháng sinh này cũng có những điểm khác biệt (Bảng 1.1)

27

Bảng 1.1: Đặc điểm của các loại kháng sinh thuộc nhóm carbapenem được sử dụng trong lâm sàng [131]

Tiêm tĩnh mạch

Tiêm tĩnh mạch/tiêm bắp;

Ít sử dụng trong điều trị do kém hiệu quả với các vi khuẩn kháng kháng sinh phổ rộng

Cơ chế tác động Chủ yếu gắn vào PBP2, PBP1a và 1b,

có ái lực yếu với PBP3.

Chủ yếu gắn vào PBP2, PBP3 và PBP4.

Vi khuẩn Gram dương;

Vi khuẩn Gram âm;

Vi khuẩn kị khí

Vi khuẩn Gram dương;

Vi khuẩn Gram âm;

Vi khuẩn kị khí

Vi khuẩn Gram dương;

Vi khuẩn Gram âm;

Vi khuẩn kị khí

Vi khuẩn Gram dương;

Vi khuẩn Gram âm;

Giảm ái lực với PBP;

Giảm hoạt động của lỗ màng

Carbapenemases/

metallo-β-lactamases;

Giảm ái lực với PBP;

Giảm hoạt động của lỗ màng kết hợp với tăng biểu hiện của bơm đẩy

Carbapenemases/

metallo-β-lactamases;

Giảm ái lực với PBP;

Giảm tích lũy nội bào.

Carbapenemases/

metallo-β-lactamases;

Giảm ái lực với PBP;

Giảm hoạt động của lỗ màng kết hợp với tăng biểu hiện của bơm đẩy

28

Tình trạng sử dụng kháng sinh carbapenem trong điều trị hiện nay tại các bệnh viện của Việt Nam có xu hướng tăng theo thời gian Giai đoạn 2009-2010, số liệu tổng kết của Hiệp hội kháng kháng sinh toàn cầu về thực trạng sử dụng kháng sinh tại Việt Nam cho thấy immipenem nằm trong nhóm kháng sinh được sử dụng phổ biến nhất tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương, ở mức 22,58 DDD/100 (2008-2009) hoặc tại bệnh viện Việt Đức (2010) 16,46 DDD/100 [80] Còn tại bệnh viện Bạch Mai, số liều DDD/100 tăng dần trong 5 năm, đạt mức gấp đôi vào năm 2016 so với năm 2012 Trong đó, meropenem được sử dụng nhiều nhất, tiếp đến là imipenem

và ertapenem, tập trung chủ yếu ở Khoa Hồi sức tích cực ở mức 54,75 DDD/100 [80]

1.2.2 Cơ chế đề kháng kháng sinh nhóm carbapenem của vi khuẩn Gram

âm

Trong một thập kỷ trở lại đây sự đề kháng với kháng sinh nhóm carbapnem đã gia tăng rất nhanh ở vi khuẩn Gram âm ở phạm vi toàn cầu Ba cơ chế đề kháng carbapenem phổ biến ở vi khuẩn Gram âm bao gồm: các gen nằm trên nhiễm sắc thể hoặc plasmid mã hóa sinh tổng hợp các enzyme carbapenemase (một nhóm β-lactamase) phân giải phân tử carbapenem; tạo các đột biến làm giảm tính thấm của màng tế bào thông qua việc thay đổi biểu hiện và/ hoặc hoạt động của các lỗ màng và phân tử PBP; và sử dụng bơm đẩy để bơm kháng sinh ra ngoài tế bào vi khuẩn (Hình 1.7) [133] Trong các cơ chế này, cơ chế sinh tổng hợp enzyme carbapenemase là cơ chế phổ biến và được nghiên cứu sâu rộng nhất

Carbapenemase về bản chất là enzyme β-lactamases có khả năng ly giải kháng sinh carbapenem và các kháng sinh nhóm β-lactam khác [169] Cơ chế tác động của chúng là xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết amide trong vòng β-lactam để tạo nên các sản phẩm không còn tác dụng diệt khuẩn Các enzyme carbapenemase được chia thành 2 họ dựa trên sự khác biệt trong cơ chế thuỷ phân kháng sinh carbapenem: một

họ là các enzyme sử dụng serine ở vị trí hoạt động bao gồm nhóm A (ví dụ như enzyme KPC và GES); nhóm D (ví dụ các enzyme họ OXA như OXA-23, OXA-48, OXA-51, OXA-58, OXA-181) và họ còn lại gồm các enzyme sử dụng kẽm ở vị trí hoạt động thuộc nhóm B metallo-β-lactamase (ví dụ như enzyme VIM, IMP và NDM)

29

để xúc tác quá trình thuỷ phân [127, 166] Đối với các vi khuẩn đường ruột

Enterobacteriaceae, carbapenemase có ý nghĩa lâm sàng nhiều nhất bao gồm KPC

(nhóm A); VIM, IMP, NDM (nhóm B); và OXA-48 (nhóm D) [166]

Hình 1.7: Các cơ chế đề kháng carbapenem chủ yếu của vi khuẩn Gram âm [133]

tử nước deacyl bảo tồn trước khi giải phóng sản phẩm thuỷ phân ra khỏi vị trí hoạt động [94, 127]

30

Hình 1.8: Quá trình thuỷ phân carbapenem của họ enzyme carbapenemase sử dụng

serine ở vị trí hoạt động (nhóm A và nhóm D) xúc tác cho quá trình thuỷ phân E: là kí hiệu của enzyme [127]

Carbapenemase nhóm A bao gồm một số họ như enzyme Serratia marcescens

(SME), imipenemase (IMI), non-metallocarbapenemase-A (NMC-A), Serratia

fonticola carbapenemase (SFC), SHV-38, Guiana extended spectrum (GES) và K pneumoniae carbapenemase (KPC) (Bảng 1.2) Carbapenemase nhóm A đầu tiên

(SME-1) được công bố vào năm 1990 ở chủng vi khuẩn Serratia marcescens phân

lập tại Anh từ năm 1982 [108] Các enzyme nhóm A bị ức chế khi có mặt axit clavulanic, tazobactam, sulbactam, NXL-104 Trong khi một số enzyme nhóm A (IMI-1, NCM-A, SME, SHV-38, SFC-1) do gen trên nhiễm sắc thể mã hóa, thì các enzyme khác (KPC, GES và IMI-2) lại do gen trên plasmid mã hóa [108]

Các enzyme SME gồm 5 biến thể (SME-1 đến SME-5) được phát hiện ở

Serratia marcescens khác biệt nhau ở 1 đến 3 axit amin Trong số các biến thể, mới

chỉ có SME-1 có bằng chứng về gen mã hóa enzyme đi kèm với gen điều hòa lysR

(protein điều hòa quá trình phiên mã) [128] Hiện nay có rất ít nghiên cứu về các biến thể của SME

NMC-A chỉ khác 8 axit amin so với 2 biến thể của IMI Hiện nay đã phát hiện được 9 biến thể của IMI rải rác ở các mẫu lâm sàng (tại Mỹ, Trung Quốc) và mẫu môi trường tại Mỹ [129, 211]

SFC-1 và SHV-38 được phân lập từ S fonticola và

K pneumoniae là 2 biến thể có khả năng kháng carbapenem trong nhóm các enzyme

này SFC-1 chỉ được phát hiện duy nhất trong chủng phân lập từ môi trường còn SHV-38 chỉ khác biến thể SHV-1 kháng kháng sinh phổ rộng ở duy nhất một axit amin [211]

31

Tính đến thời điểm này, họ enzyme GES đã có 31 biến thể, khác nhau từ 1 đến

4 axit amin [129] Dù đa số biến thể của GES được xếp vào nhóm ESBL nhưng với

sự xuất hiện của một số biến thể mang đột biến làm tăng khả năng phân giải kháng sinh carbapenem, nên tới nay một số biến thể của GES cũng được xếp vào nhóm carbapenemase như GES-2, GES-4, GES-5, GES-6, GES-14, GES-14, GES-18

[211] Trong đó, GES-2 và GES-5 có hoạt tính kháng carbapenem mạnh nhất

KPC lần đầu được phát hiện ở K pneumoniae năm 1996 tại Mỹ và cũng là căn nguyên chủ yếu của các trường hợp nhiễm vi khuẩn Enterobacteriacae kháng

carbapenem ở khu vực Tây bán cầu [78] KPC có khả năng ly giải carbapenem cao nên dù khi vắng mặt các cơ chế kháng khác như thay đổi tính thấm của màng hay đồng biểu hiện các ESBL thì nó vẫn đủ giúp chủng vi khuẩn đề kháng carbapenem ở mức độ cao [159] Trong số 24 biến thể của KPC có trong cơ sở dữ liệu của Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia, Hoa Kỳ (National Center for Biotechnology Information – NCBI) thì KPC-2 là biến thể được phát hiện phổ biến nhất trong các chủng vi khuẩn đường ruột kháng carbapenem [129]

Các enzyme KPC có khả năng ly giải phổ rộng kháng sinh trong đó bao gồm tất

cả các nhóm kháng sinh beta-lactam, hiệu quả nhất là nitrocefin, cephalothin, cephaloridine, benzylpenicillin, ampicillin và piperacillin Không những vậy, các chủng mang gen KPC còn có thể đồng thời mang các gen mã hóa carbapenemase khác như VIM, NDM, IMP [108] Mặc dù KPC chủ yếu được phát hiện trong các

chủng K pneumoniae phân lập từ các trường hợp nhiễm trùng bệnh viện nhưng nó cũng được ghi nhận ở các chủng vi khuẩn đường ruột khác như E coli, Citrobacter,

Enterobacter spp và gần đây là Acinobacter spp [169, 172]

SME 5 Nhiễm sắc thể S marcescens + + + +

Axit clavulanic

IMI 9 Nhiễm sắc thể / Plasmid E cloacae + + + +

NMC-A 1 Nhiễm sắc thể E cloacae + + + +

KPC 24 Plasmid/ Nhiễm sắc thể K pneumoniae, E coli, A baumannii, E

IMP 58 Plasmid Enterobacteriaceae, A baumannii, P aeruginosa + + - +

VIM 51 Plasmid Enterobacteriaceae, A baumannii, P aeruginosa + + - +

GIM 2 Plasmid Enterobacteriaceae, P aeruginosa + + - +

SPM-1 1 Plasmid P aeruginosa + + - +

Carbapenemase nhóm D

OXA-23-like 19 Nhiễm sắc thể / Plasmid A baumannii, A junii, K pneumoniae + +  +

NaCl

OXA-24/40-like 7 Nhiễm sắc thể / Plasmid A baumannii, P aeruginosa, K pneumoniae + + - 

OXA-51-like 95 Nhiễm sắc thể / Plasmid A baumannii, E cloacae, E coli, K pneumoniae + + - 

OXA-58-like 4 Nhiễm sắc thể / Plasmid A baumannii, E cloacae, E coli, K pneumoniae + + - 

OXA-143-like 5 Plasmid A baumannii, A pittii + + - 

OXA-48-like 11 Nhiễm sắc thể / Plasmid

E cloacae, K pneumoniae, E coli,

C freundii, S marcescens, K.oxytoca, A

33

1.2.2.1.2 Cấu trúc di truyền của các gen mã hóa carbapenemase nhóm A

Các gen blaSME, blaNMC-A và blaIMI nằm trên nhiễm sắc thể và thường không đi

kèm với các yếu tố di truyền di động nên rất hiếm được phát hiện ở Enterobacteriacae

và A baumannii [61] Tương tự như gen blaNMC-A nằm trên nhiễm sắc thể luôn đi kèm

với gen điều hòa nmc-R, gen blaIMI-1 cũng có gen điều hòa imi-R mã hóa protein LysR

Trong khi đó tổ hợp gen imi-R– blaIMI-2 lại là một phần của transposon nằm trên

plasmid của E cloacae và Enterobacter asburiae Ở E cloacae transposon này có đoạn IS2 và gen tnp mã hóa transpose giống với gen tnpA của transposon Tn2501

Các transposon này có thể là căn nguyên của việc chuyển gen blaIMI sang nhiễm sắc thể hoặc plasmid khác [211]

Ngược lại, gen blaKPC và blaGES lại nằm trên các plasmid có thể lan truyền nên xuất hiện rất phổ biến ở các vi khuẩn Gram âm [135] Gen blaKPC nằm trên rất nhiều nhóm plasmid khác nhau như IncF, IncI2, IncX, IncA/C, IncR, IncL/M, ColE1 [41], trong đó phổ biến nhất là nhóm IncF/FIIK [155] Plasmid nhóm IncF thường mang thêm một số gen kháng các loại kháng sinh khác như aminoglycosides, tetracyclines,

quinolones, trimethoprim, và sulfonamides [155] Gen blaKPC nằm trên transposon

Tn4401 có kích thước khoảng 10kb, cùng với gen mã hóa tranposase Tn3 (tnpA), resolvase Tn3 (tnpR) và 2 trình tự chèn ISKpn6 và ISKpn7 (Hình 1.9) Hiện nay đã

có 5 biến thể của transposon Tn4410 khác biệt ở một đoạn khuyết giữa ISKpn7 và gen blaKPC

Hình 1.9: Cấu trúc transposon Tn4410 chứa gen blaKPC [108]

Chú giải: IRL, IRR: trình tự lặp đảo ngược ở 2 đầu của transposon Các mũi tên là hướng khung đọc mở của

các gen tnpR: mã hoá enzyme resolvase, tnpA: mã hoá enzyme transposase, ISKpn7, ISKpn6: trình tự chèn So với trình tự của Tn4410b: Tn4401a: khuyết một đoạn 99 bp, Tn4401c: khuyết một đoạn 215 bp, Tn4401d: khuyết một đoạn 68 bp, Tn4401a: khuyết một đoạn 255 bp.

có được khả năng này là do carbapenemase nhóm B sử dụng ion Zn2+ để hoạt hoá và phá vỡ vòng β-lactam Khác với các carbapenemase chứa serine ở vị trí hoạt động, enzyme nhóm này không tạo thành sản phẩm trung gian enzyme-acyl, mà tấn công trực tiếp vào phân tử nước nhờ ion Zn2+ qua đó phá vỡ liên kết amide của vòng β-lactam [52, 94] Nhưng cũng chính vì vậy mà enzyme nhóm này bị ức chế bởi các chất tác động đến liên kết giữa ion kim loại và các phân tử khác như axit Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) và axit dipicolinic (Bảng 1.2) [155]

Các enzyme nhóm B thường gặp là “active on imipenem” (IMP), Verona integron-encoded MBLs (VIM), “German imipenemase” (GIM), “Seoul imipenemase” (SIM) và New Delhi Metallo-beta-lactamase (NDM) Gen mã hóa các enzyme này thường được tìm thấy trên các plasmid có thể lan truyền ở

Enterobacteriaceae, P aeruginosa và A baumannii [61]

IMP được phát hiện lần đầu trong chủng S marcescens phân lập từ mẫu lâm

sàng tại Nhật Bản năm 1991, trước khi được phát hiện ở các chủng

Enterobacteriaceae, P aeruginosa và A baumannii [46] Các enzyme IMP có ái lực

cao với nhiều loại kháng sinh bao gồm cephalosporins và carbapenems, nhưng lại có hoạt tính yếu với temocillin Đến nay đã có 58 biến thể của IMP trong cơ sở dữ liệu của NCBI

VIM được phát hiện chủ yếu ở P aeruginosa và các vi khuẩn Gram âm khác như Enterobacteriaceae (Bảng 1.2) So với IMP, các enzyme VIM có phổ ly giải

rộng hơn bao gồm cả temocillin cùng ái lực cao với carbapenem [46] Trong số các biến thể của VIM, VIM-2 là biến thể phổ biến nhất [210]