Đang tải... (xem toàn văn)
(Luận án tiến sĩ) Xác định đột biến gen COL1A1, COL1A2 gây bệnh tạo xương bất toàn (Osteogenesis Imperfecta)(Luận án tiến sĩ) Xác định đột biến gen COL1A1, COL1A2 gây bệnh tạo xương bất toàn (Osteogenesis Imperfecta)(Luận án tiến sĩ) Xác định đột biến gen COL1A1, COL1A2 gây bệnh tạo xương bất toàn (Osteogenesis Imperfecta)(Luận án tiến sĩ) Xác định đột biến gen COL1A1, COL1A2 gây bệnh tạo xương bất toàn (Osteogenesis Imperfecta)(Luận án tiến sĩ) Xác định đột biến gen COL1A1, COL1A2 gây bệnh tạo xương bất toàn (Osteogenesis Imperfecta)(Luận án tiến sĩ) Xác định đột biến gen COL1A1, COL1A2 gây bệnh tạo xương bất toàn (Osteogenesis Imperfecta)(Luận án tiến sĩ) Xác định đột biến gen COL1A1, COL1A2 gây bệnh tạo xương bất toàn (Osteogenesis Imperfecta)(Luận án tiến sĩ) Xác định đột biến gen COL1A1, COL1A2 gây bệnh tạo xương bất toàn (Osteogenesis Imperfecta)(Luận án tiến sĩ) Xác định đột biến gen COL1A1, COL1A2 gây bệnh tạo xương bất toàn (Osteogenesis Imperfecta)(Luận án tiến sĩ) Xác định đột biến gen COL1A1, COL1A2 gây bệnh tạo xương bất toàn (Osteogenesis Imperfecta)(Luận án tiến sĩ) Xác định đột biến gen COL1A1, COL1A2 gây bệnh tạo xương bất toàn (Osteogenesis Imperfecta)(Luận án tiến sĩ) Xác định đột biến gen COL1A1, COL1A2 gây bệnh tạo xương bất toàn (Osteogenesis Imperfecta)(Luận án tiến sĩ) Xác định đột biến gen COL1A1, COL1A2 gây bệnh tạo xương bất toàn (Osteogenesis Imperfecta)(Luận án tiến sĩ) Xác định đột biến gen COL1A1, COL1A2 gây bệnh tạo xương bất toàn (Osteogenesis Imperfecta)(Luận án tiến sĩ) Xác định đột biến gen COL1A1, COL1A2 gây bệnh tạo xương bất toàn (Osteogenesis Imperfecta)(Luận án tiến sĩ) Xác định đột biến gen COL1A1, COL1A2 gây bệnh tạo xương bất toàn (Osteogenesis Imperfecta)
1 ĐẶT VẤN ĐỀ Đột biến gen xác định nguyên nhân gây nên nhiều bệnh, đặc biệt bệnh lý di truyền rối loạn chuyển hóa Những tổn thương gen thường xảy sớm Các tổn thương thông qua chế điều hòa gen mối tương tác gen với gen với phân tử nội bào mối tương tác tế bào - tế bào mà biểu thành thể bệnh nặng, nhẹ khác Các nhà khoa học giới sâu tìm hiểu chế gây đột biến kết cho thấy: chế gây đột biến gen phức tạp, kiểu/dạng đột biến đa dạng phong phú tùy thuộc vào thể bệnh, mức độ nhẹ có khơng đặc hiệu với chủng tộc Trong giai đoạn chưa thể sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử để can thiệp nhằm ngăn ngừa phát sinh đột biến với bệnh lý cụ thể nhà khoa học hồn tồn xác định xác đột biến cách sớm để đưa giải pháp can thiệp kịp thời hay lời khuyên di truyền nhằm nâng cao hiệu điều trị phịng bệnh Bệnh tạo xương bất tồn (osteogenesis imperfecta) gọi bệnh xương thủy tinh hay bệnh giòn xương Hơn 90% bệnh tạo xương bất toàn di truyền trội nhiễm sắc thể thường Bệnh bao gồm nhiều thể lâm sàng có đặc điểm di truyền khác với tần suất mắc bệnh 1/15.000÷1/25.000 [1],[2],[3] Nguyên nhân bệnh đột biến gen tổng hợp collagen týp I dẫn đến thiếu hụt bất thường cấu trúc phân tử collagen týp I gây nên giòn xương, giảm khối lượng xương bất thường mô liên kết Collagen týp I loại protein chiếm ưu chất khoảng gian bào hầu hết mơ, tìm thấy xương, màng bọc quan, giác mạc, củng mạc mắt, cân dây chằng, mạch máu, da, màng não, thành phần ngà chiếm 30% trọng lượng thể Vì vậy, bị khiếm khuyết chất ngoại bào, bệnh không biểu bất thường xương mà bất thường tổ chức khác củng mạc mắt màu xanh, tạo bất tồn, giảm thính lực… [4],[5] Bệnh tạo xương bất toàn gây đau đớn, tàn phế suốt đời cho trẻ mặt thể chất lẫn tâm thần với thể bệnh nhẹ Cịn với thể bệnh nặng gây tỷ lệ tử vong cao Cho đến nay, chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu bệnh tạo xương bất toàn Chủ yếu điều trị triệu chứng, giảm đau, giảm gãy xương tái phát với mục đích giảm đến mức tối đa tỷ lệ tàn tật suy giảm chức năng, giúp cải thiện chất lượng sống cho bệnh nhân [6],[7] Các nhà khoa học phát rằng, khoảng 90% trường hợp bệnh tạo xương bất toàn gây nên đột biến gen COL1A1 COL1A2 [8] Từ đến nay, khoảng 300 dạng đột biến khác COL1A1 COL1A2 phát hiện, đột biến phổ biến mô tả Dalgleish cộng năm 1997 thay đổi acid amin glycin thành acid amin khác Các đột biến không tập trung vùng trọng điểm (hotspot) mà rải rác khắp chiều dài gen trình phân tích gen tìm đột biến tương đối khó khăn [9],[10],[11],[12] Bằng kỹ thuật phân tích gen kết phân tích gen tiền đề quan trọng giúp chẩn đốn trước sinh đối tượng có nguy cao sinh bị bệnh tạo xương bất toàn để đưa tư vấn di truyền giúp ngăn ngừa làm giảm tỉ lệ mắc bệnh [13],[14] Các nghiên cứu bệnh tạo xương bất toàn Việt Nam cịn ít, chủ yếu nghiên cứu mặt lâm sàng bệnh viện Nhi Trung ương nên số lượng nghiên cứu bệnh tạo xương bất toàn chưa nhiều, thơng tin cịn hạn chế Xuất phát từ thực tiễn đó, nghiên cứu tiến hành nhằm mục tiêu: Xác định đột biến gen COL1A1, COL1A2 bệnh nhân mắc bệnh tạo xương bất toàn Xác định đột biến gen COL1A1, COL1A2 bố mẹ bệnh nhân phát đột biến gen COL1A1 COL1A2 Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Bệnh tạo xƣơng bất toàn 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh tạo xương bất toàn giới Theo nghiên cứu Lowenstein E.J Ai Cập bệnh tạo xương bất tồn xuất từ 1.000 năm trước cơng ngun (hình 1.1), [15] Tuy nhiên đến năm 1788, mơ tả khoa học bệnh tạo xương bất toàn Olaus Jakob Ekman đưa Năm 1833, Lobstein mơ tả trường hợp bệnh đầu tiên, bệnh nhân nữ 35 tuổi đến bệnh viện New Sussex biến dạng cột sống từ 10 tuổi, phát củng mạc mắt xanh dần 8÷10 năm, đau lưng trước vài tháng, điếc tai phải năm sau điếc tai trái Bệnh nhân bị gãy xương cánh tay trái lúc 12 tuổi bị ngã trường sau thời gian ngắn lại bị gãy xương trụ trái hai lần liên tiếp ngã Khi đến khám, bệnh nhân cao 1,5 m; yếu ớt, điếc, gãy nhiều trên, cửa hàm nhỏ mảnh, men xấu, biến dạng cột sống, biến dạng xương dài hộp sọ, ngón tay vận động mức Bệnh nhân chẩn đoán bệnh “osteopsathyrosis”, bệnh tạo xương bất toàn hay bệnh Lobstein [16] Sau Lobstein mô tả trường hợp bệnh này, nhiều trường hợp có biểu bệnh tương tự báo cáo Năm 1849, bệnh Vrolik mô tả gọi hội chứng Vrolik hay bệnh xương thủy tinh Trong kỷ XX, nhiều nghiên cứu báo cáo biến đổi lâm sàng mức độ nặng nhẹ khác bệnh tạo xương bất toàn Looser tiến hành phân loại bệnh lần vào năm 1906 Năm 1963 có 120 trường hợp bệnh báo cáo y văn, sau Silence đề xuất phân loại bệnh thành bốn týp vào năm 1979 [17] Tuy chỉnh sửa nhiều lần cách phân loại áp dụng Tên gọi bệnh tạo xương bất toàn xác định từ năm 1985 sử dụng đến ngày [18] Hình 1.1 Phần cịn lại xƣơng trẻ bị tạo xƣơng bất tồn với hình ảnh xƣơng sọ Tam O’Shanter, tạo bất toàn, xƣơng mỏng biến dạng [15] 1.1.2 Đặc điểm cấu tạo q trình chuyển hóa xương 1.1.2.1 Cấu tạo xương Bộ xương người có khoảng 80% xương đặc (cortical bone) 20% xương xốp (trabecular bone) Tuy nhiên, bề mặt xương đặc chiếm khoảng 1/5 bề mặt xương xốp Do đó, phương diện chuyển hóa, xương xốp hoạt hóa (active) xương đặc Tỷ lệ chuyển hóa xương (remodeling) xương xốp khoảng 20% đến 30% tỷ lệ cho xương đặc từ 3% đến 10% Cấu tạo xương gồm có thành phần hữu vô Thành phần hữu chiếm 35% bao gồm chất tạo keo, glucoprotein, phosphoprotein, mucopolysacarid glycosaminoglycan (GAG) lipid Thành phần vô chiếm 65% gồm chủ yếu tinh thể hydroxyapatit (Ca.10(PO4).6(OH)2) có tính chất vật lý gốm sứ thành tố quan trọng calci Tại vị trí xương, quy trình chu chuyển xương (xương bị đào thải thay xương mới) xảy khoảng ba năm lần Khối xương (bone mass) tích lũy nhanh độ tuổi dậy đạt mức độ tối đa vào khoảng tuổi 20 đến 30 Độ khác biệt khối xương cá nhân dao động khoảng 10% đến 20% Phần lớn độ khác biệt khối xương cao (peak bone mass) yếu tố di truyền định Việc giảm chất xương ảnh hưởng đến xương xốp xương đặc Điều thay đổi hoàn toàn cấu trúc xương Tuy nhiên, thành phần cấu tạo hóa học xương khơng thay đổi [19],[20],[21],[22],[23] 1.1.2.2 Q trình chuyển hóa xương Xương vật chất "chết" mà trái lại có hoạt động chuyển hóa tích cực gồm hai trình tạo xương hủy xương với tham gia tế bào tạo xương gọi tạo cốt bào tế bào hủy xương gọi hủy cốt bào Hai trình diễn song song suốt đời Ở trẻ em, trình tạo xương hoạt động mạnh trình hủy xương Khi trưởng thành, điều kiện bình thường, hai trình tạo xương hủy xương hoạt động nhịp nhàng bổ sung cho Khối lượng xương đào thải luôn với khối lượng xương tạo Để đạt quân bình này, hệ thống sinh học gồm hormon yếu tố trung gian phải tương tác với môi trường điều khiển hàng trăm gen Các hormon bao gồm hormon cận giáp, vitamin D hormon thuộc steroid Các yếu tố trung gian tham gia vào việc kiểm sốt q trình tạo xương hủy xương bao gồm cytokin yếu tố tăng trưởng (hình 1.2), [19],[20],[23],[24],[25] Hình 1.2 Chu kỳ tái tạo xƣơng (nguồn: Roche, 1998) Q trình chuyển hóa bình thường xương giúp trì ổn định cấu tạo xương bao gồm khoáng chất, khung hữu cơ, tế bào nước Thành phần khoáng chất chiếm khoảng 2/3 tổng trọng lượng khô, chủ yếu apatit calci Khung hữu chiếm khoảng 35% trọng lượng xương, collagen týp I chiếm khoảng 90% Phần lớn dấu ấn sinh học q trình hủy xương sản phẩm thối hóa collagen týp I Cấu trúc collagen týp I gồm ba chuỗi polypeptid xoắn ốc (hai chuỗi α1 chuỗi α2) Các phân tử collagen nối liên kết chéo pyridinium Prolin hydroxyl hóa phần thành hydroxyprolin Cuối cùng, chuỗi phụ chứa nitơ prolin lysin tác dụng lysyl oxidase hình thành vịng pyridinium Nhờ mà hình thành mạng lưới chặt chẽ phân tử collagen týp I (hình 1.3) Những biến đổi thành phần cấu trúc chức collagen týp I làm rối loạn cấu tạo q trình chuyển hố xương gây nên bệnh lý xương Đó bệnh lý phát sinh đời sống bệnh di lý truyền qua hệ gây nên đột biến gen Trong đột biến gen COL1A1 COL1A2 gây thiếu hụt bất thường cấu trúc phân tử collagen týp I gây nên bệnh tạo xương bất tồn với đặc điểm giịn xương, giảm khối lượng xương bất thường mô liên kết, [26] Hình 1.3 Cấu trúc collagen trƣởng thành týp I (nguồn: Roche, 1998) Cho đến nay, nhiều cơng trình nghiên cứu bệnh tạo xương bất tồn thực nhiều quốc gia giới Cơ chế phân tử, đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng dần sáng tỏ Các phương pháp điều trị, chăm sóc nhằm hạn chế tiến triển bệnh nâng cao chất lượng sống người bệnh hướng dẫn phổ biến cách rộng rãi 1.1.3 Lâm sàng phân loại bệnh tạo xương bất toàn Biểu lâm sàng phụ thuộc vào týp bệnh tạo xương bất toàn Tùy theo người, bệnh tạo xương bất tồn biểu nhẹ nghiêm trọng Xương bị giòn, dễ gãy đặc điểm người mắc bệnh tạo xương bất toàn Một số biểu người mắc bệnh tạo xương bất toàn xương tạo bất thường, người thấp, bé Khớp lỏng lẻo Củng mạc mắt có màu xanh da trời màu xám Khn mặt có hình tam giác Lồng ngực hình thùng Cong vẹo cột sống Răng bị giòn, dễ gãy (tạo bất tồn) Giảm thính lực Bất thường kết cấu da (da nhẵn mịn mỏng) Những dấu hiệu đặc trưng khác phổ biến nhiều týp bệnh chảy máu tạng (dễ gây nên vết thâm tím) suy hơ hấp Sillence cộng (1979) chia bệnh tạo xương bất toàn thành bốn týp [17]: 1.1.3.1 Týp I: thể nhẹ hay gặp Người bệnh có tầm vóc bình thường tương đối bình thường, có biểu yếu cơ, cột sống bị cong, củng mạc mắt có màu xanh hay màu tím, gãy xương thường xảy trước tuổi dậy 1.1.3.2 Týp II: thể nặng Bệnh nhân thường chết sau sinh sống thời gian ngắn rối loạn chức hô hấp (thiểu sản phổi, gãy xương sườn), người bệnh có vóc dáng nhỏ, gãy nhiều xương 1.1.3.3 Týp III: thể tương đối nặng, trẻ thường sinh có gãy xương Củng mạc mắt thường trắng có màu xám, màu xanh, giảm chức hơ hấp, giảm thính lực bất thường 1.1.3.4 Týp IV: thể trung gian týp I III Các biến dạng xương mức nhẹ đến trung bình Xếp theo thứ tự từ nhẹ đến nặng týp I, týp IV, týp III, týp II Một số nghiên cứu phân loại bệnh tạo xương bất toàn làm 11 týp [7], [27],[28],[29],[30],[31] Thể bệnh tạo xương bất toàn phân loại tùy theo mức độ nghiêm trọng bệnh Đột biến gặp 60% dạng bệnh nhẹ (chiếm nửa ca bệnh tạo xương bất toàn) bao gồm: bệnh tạo xương bất tồn loại cổ điển- khơng biến dạng (classic – non deforming) với củng mạc mắt màu xanh Hoặc bệnh tạo xương bất toàn thuộc loại biến thể phổ biến (common variable) với củng mạc mắt bình thường Hầu hết (100%) bệnh tạo xương bất tồn chết chu sinh (perinatally lethal osteogenesis imperfecta) Gần 100% loại bệnh tạo xương bất toàn tiến triển dạng tăng dần (progressively deforming osteogenesis imperfecta) đột biến Hình 1.4 Hình ảnh bất thƣờng xƣơng bệnh nhân tạo xƣơng bất tồn Hình ảnh đột biến gen tổng hợp collagen týp I ảnh hưởng lên cấu trúc xương gây giịn xương làm xương dễ gãy Hình 1.5 Hình ảnh củng mạc mắt màu xanh bệnh nhân tạo xƣơng bất tồn Hình ảnh đột biến gen tổng hợp collagen týp I ảnh hưởng lên củng mạc mắt biểu củng mạc mắt màu xanh Hình 1.6 Hình ảnh tạo bất toàn bệnh nhân tạo xƣơng bất tồn Hình ảnh đột biến gen tổng hợp collagen týp I ảnh hưởng lên trình tạo 10 Bảng 1.1 Đặc điểm bệnh tạo xƣơng bất toàn [17] Týp I II-A II-B Trội Trội Trội/lặn NST NST NST thường thường thường Tử vong Nghiêm trước sinh trọng Khơng Có Hiếm gặp III IV Đặc điểm Di truyền Mức độ nghiêm trọng Nhẹ Biến dạng xương Củng mạc mắt Tầm vóc Sự dịch chuyển khớp NST thường NST thường Vừa Có Thường xuyên Hiếm gặp Rất nặng Nặng Nặng vừa Nhẹ vừa Xanh Đen Đen Bình Đặc biệt Đặc biệt thường nhỏ nhỏ Có Có Có Có Chưa rõ Chưa rõ Phổ biến Xanh/ xám/ trắng Rất nhỏ 60% Mất chức nghe Trội/lặn Nhẹ vừa Gãy xương bẩm sinh Trội/lặn trường hợp Bình thường Nhỏ có thay đổi Có thể 42% trường hợp Tạo bất tồn Có thể Chưa rõ Chưa rõ Có Có thể Biến chứng hơ hấp Khơng Có Có Có Khơng Khơng Chưa rõ Chưa rõ Có Khơng Biến chứng thần kinh Bảng 1.1 trình bày khác số đặc điểm di truyền, mức độ nghiêm trọng bệnh mức độ biểu khác số triệu chứng bệnh tạo xương bất toàn týp khác PHỤ LỤC Bảng Trình tự mồi khuếch đại gen COL1A1 STT Exon 5’UTR Exon 10 11 Tên mồi Trình tự mồi 5’UTP2_P1 GACGGGAGTTTCTCCTCGGGG 5’UTP2_P2 GAGTCTCCGGATCATCCACGT E1_P1 CGAGGTTGGGGTTGAACG E1_P2 CCGGGTCTAAGAGGCACACT Exon E2-5_P1 CAGGTGGGCATGGCTCTC 2-5 E2-5_P2 TCCTGTAGGATTCTTGCAACT Exon E6-9_P1 CACACCAGGAAGTGCATG 6-9 E6-9_P2 CTGAGTATCGTTCCCAAATGT Exon E10-14_P1 CTGACCTGCAACAATCC 10-14 E10-14_P2 CCCGTTAAGTCCACTGAGCAC Exon E15-18_P1 GATCCCTGAGCTCTGGAAGGG 15-18 E15-18_P2 CTCCTCTTCCTTTCCGGATTTC Exon E19-23_P1 TAAGTATCCTGCCAGGCTTCA 19-23 E19-23_P2 TAGGGAGGCAGAGAGGTATGA Exon E24-25_P1 GTCTGGGATGAGGCGTTCTGG 24-25 E24-25_P2 TAGGGAGGCTGAGGTCCAGAA Exon E26-29_P1 AGGGCCCAGCAAGAAGCACCT 26-29 E26-29_P2 TGGCTGTCTGATTAGCTAGGA Exon E30-32_P1 CAGACCCCAGGAGGAAGGACC E30-32 E30-32_P2 GATTCAAAGCAGGCAAGAATG Exon E33-38_P1 CCTCTCAGGAAACCCAGACAC 33-38 E33-38_P2 GACATAGGAACAGTCAGAGG Kích thƣớc (bp) 320 1227 283 968 1124 1326 1248 491 818 794 1268 12 13 14 15 16 Exon E39-41_P1 GAGTATCACCCGCCTCTCTGT 39-41 E39-41_P2 CCTGCCTGGGTGAAGTCCGAC Exon E42-45_P1 GCGGAGCCAAGGAGAACAGAT 42-45 E42-45_P2 TCGCCCTGTTCGCCTCTTCTCA Exon E46_P1 GTCCTGTCGGCCCTGTT 46 E46_P2 CAGAGAGGGAAGAGAGTGGG Exon E47-49_P1 GCTGGGGTTGCGGGCT 47-49 E47-49_P2 CATGTCCCTTCTGAGCACTGG Exon E50-51_P1 GGACCCTGGACAGGGAGGCC 50-51 E50-51_P2 CAGTTTGGGTTGCTTGTCTGT 1421 1174 1203 927 679 Bảng Trình tự mồi khuếch đại gen COL1A2 Kích STT Exon Tên mồi Trình tự mồi thƣớc (bp) Exon CATTGTAGTTACATCAGTCTTACC E4_P2 GCTTCTTCTGCAGTGCATTACCT E5_P1 TCCACCCTACTTGCACATAGAAAGG E5_P2 GACAGGGCTCACAAAGAGAATGCG E6_P1 GGGAAGTTCTCCATTTCAAAGAGGTGT E6_P2 GCTAAATAAATGGCGTGGTAAAATGTGA Exon E7-9_P1 GTCTGACCCCAGCCAACACCAT 7-9 E7-9_P2 CCACGGATTTGAAAGTCAGTATATGT Exon 10 11 ATGGGTGCCATACTTTTGACCTGC E4_P1 Exon CTGAGAGTCTGCCCTCCAAGTGTA CAAGTCTTTTTTTTTCCTTTTGTATGTA E1_P2 E2-3_P2 Exon CCCCCATTCGCTCCCTCCT Exon 2- E2-3_P1 E1_P1 Exon E10-12_P1 CAGCAAGCATACCATAAGCAAC 10-12 E10-12_P2 GAGGTCATGCGGAATTTCAATCA Exon E13-16_P1 GAATCTAAGGGAGAAATTGGGGAGGA 13-16 E13-16_P2 AACACAGTTCCAATCTTTCACATCACA Exon E17-19_P1 TGCAGATAAAGAGATAATTACGAAACA 17-19 E17-19_P2 TGTTGAAACTCTCTTGCAGACAA Exon E20-23_P1 CTTGAGCTTCTCTTTACCTTGAC 20-23 E20-23_P2 TAAAGAAGGAAGTAATGCCAGGTGTGA Exon E24-26_P1 AAAAAGTCGGGGGAAAAGGTGCCTT 24-26 E24-26_P2 AGTGTGGTTCTTAGATGAATGCTATGTGA 491 1088 294 385 374 1346 833 1316 1304 1073 1229 12 13 14 15 16 Exon E27-29_P1 CTTTGAGACATCTTAAACTACCTGCTT 27-29 E27-29_P2 TGGCTCATTCTCTCCATCAGCAC Exon E30-31_P1 TGCACTCATGTAGATACTGCCAGGT 30-31 E30-31_P2 GGTCCACTGGAATCGGATTGCTGTT Exon E32-33_P1 TCTCCCTCCTTTCAATAGCCCAGCC 32-33 E32-33_P2 TTGACACTAGGAAGTTAGAAAATTCGGAT Exon E34-37_P1 FFAFTACCCTCCTTCTGAGAGTGGC 34-37 E34-37_P2 ACCACCCTTATGAGGTTATCAG Exon E38-39_P1 TGCGGGAATGATCCACTTGAAGAAA 38-39 E38-39_P2 GAAAAGCTGACTTCAGACCAGGAG Exon E40_P1 CATAAAGGAAGACAGGAGTTGC 40 E40_P2 CATCAACAAATAGATGCCACTTG 815 1557 1221 1475 1167 17 18 19 20 21 22 448 Exon E41-42_P1 CTCACAATCTTCAAGCCAACCTGTG 41-42 E41-42_P2 AAAGCCCATTCTTTGGCCTAAGCAA Exon E43-45_P1 AGGGTTCGTTACTGAGCATG 43-45 E43-45_P2 TGAAAATCCTTCTGAGCTGAAGGCC Exon E46-48_P1 GCAGATTACCAGCAGAGGTGAGAGC 46-48 E46-48_P2 TGGGGCTAACTTTAATGGGGTTGTC Exon E49-50_P1 GAACATGCTTCCGTGTGAAGCTC 49-50 E49-50_P2 GTCCAATCAATCCATCTTCTAATGTG Exon E51-52_P1 CCCTTTTCCTAAGCTTGGATCTGAG 51-52 E51-52_P2 TTGCCCACAATTTAAGCAAGTAG 1142 1098 1121 1472 782 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NI BI TH HNG CHU XáC ĐịNH Đột biến gen col1a1, col1a2 gây bệnh tạo x-ơng bất toàn (osteogenesis imperfecta) Chuyên ngành: Hóa sinh Mã số: 62720112 LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC Ng-êi h-íng dÉn khoa häc: GS.TS Tạ Thành Văn HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN Lời cho phép tơi xin bày tỏ lịng tri ân sâu sắc tới GS.TS Tạ Thành Văn, Phó Hiệu Trưởng Trường Đại học Y Hà Nội, Trưởng Bộ môn Hóa sinh Trường Đại học Y Hà Nội, Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Gen- Protein Trường Đại học Y Hà Nội người hướng dẫn khoa học, người thầy tận tình truyền đạt kiến thức kinh nghiệm q báu để tơi hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Trần Vân Khánh, Phó Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Gen- Protein Trường Đại học Y Hà Nội, người thầy định hướng, giúp đỡ, động viên tơi suốt q trình học tập, tạo thuận lợi cho tơi q trình thực đề tài hồn thành luận án ngày hơm Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Thị Hà, người thầy giúp đỡ, động viên tơi suốt q trình học tập hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành đến: PGS.TS Phạm Thiện Ngọc, nguyên Trưởng Bộ môn Hóa sinh Trường Đại học Y Hà Nội tạo điều kiện, giúp đỡ tơi q trình học tập hoàn thành luận án Các CBVC Trung tâm nghiên cứu Gen-Protein trường Đại học Y Hà Nội giúp đỡ, tạo điều kiện, chia sẻ kinh nghiệm quý báu để thực kỹ thuật nghiên cứu hồn thành đề tài Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: - Ban Giám hiệu, Phịng Đào tạo Sau Đại học, Bộ mơn Hóa sinh Trường Đại học Y Hà Nội - Ban Giám hiệu, Phịng ban chức năng, CBVC Bộ mơn Hóa sinh, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện cho suốt trình học tập nghiên cứu - Xin gửi lời cảm ơn đến gia đình bệnh nhân tạo xương bất tồn giúp đỡ tơi có số liệu luận án - Xin cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp giúp đỡ, động viên nhiều q trình học tập Cuối cùng, tơi xin ghi nhớ cơng ơn sinh thành, ni dưỡng tình yêu thương cha mẹ tôi, cha mẹ chồng ủng hộ, giúp đỡ, động viên chồng, hai anh chị em gia đình, người bên tôi, chỗ dựa vững để tơi n tâm học tập hồn thành luận án Hà Nội, ngày tháng năm 2015 NCS Bùi Thị Hồng Châu LỜI CAM ĐOAN Tôi Bùi Thị Hồng Châu, nghiên cứu sinh khóa 30 Trường Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Hóa sinh, xin cam đoan: Đây luận án thân trực tiếp thực hướng dẫn GS.TS Tạ Thành Văn Cơng trình khơng trùng lặp với nghiên cứu khác công bố Việt Nam Các số liệu thông tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan, xác nhận chấp thuận sở nơi nghiên cứu Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm trước pháp luật cam kết Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Người viết cam đoan Bùi Thị Hồng Châu DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT OI Osteogenesis imperfecta (tạo xương bất toàn) COL1A1 Collagen týp I alpha COL1A2 Collagen týp I alpha DNA Deoxyribonucleic acid cDNA Complementary deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleic acid mRNA Messenger ribonucleic acid (RNA thông tin) NST Nhiễm sắc thể Kb Kilo base bp Base pair dNTP deoxyribonucleotide triphosphate ddNTP dideoxyribonucleotide triphosphate PCR Polymerase chain reaction RT-PCR Reverse transcription PCR (PCR mã ngược) EDTA Ethylendiamin tetraacetic acid SDS Sodium dodecyl sulfate TE Tris - EDTA TBE Tris borate EDTA Ala: alanin Gly: glycin Pro: prolin Arg: arginin His: histidin Ser: serin Asn: asparagin Ile: isoleucin Stop: mã kết thúc Asp:aspartic Leu: leucin Thr: threonin Cys: cystein Lys: lysin Trp: tryptophan Gln: glutamin Met: methionin Tyr: tyrorin Glu: acid glutamic Phe: phenylalanin Val: valin MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1 Bệnh tạo xương bất toàn 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh tạo xương bất toàn giới 1.1.2 Đặc điểm cấu tạo trình chuyển hóa xương 1.1.3 Lâm sàng phân loại bệnh tạo xương bất toàn 1.1.4 Cận lâm sàng 11 1.1.5 Tần suất mắc bệnh tạo xương bất toàn 14 1.1.6 Di truyền học bệnh tạo xương bất toàn 14 1.1.7 Chẩn đoán 16 1.1.8 Điều trị bệnh tạo xương bất toàn 17 1.2 Cơ chế phân tử bệnh tạo xương bất toàn 20 1.2.1 Cấu trúc, chức protein collagen týp I 20 1.2.2 Vị trí, cấu trúc, chức gen COL1A1, COL1A2 23 1.3 Phương pháp phát đột biến gen COL1A1, COL1A2 30 1.3.1 Phương pháp PCR 30 1.3.2 Phương pháp giải trình tự gen 31 1.3.3 Kỹ thuật SSCP 33 1.4 Tình hình nghiên cứu giới Việt Nam 33 1.4.1 Trên giới 33 1.4.2 Ở Việt Nam 34 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 2.1 Đối tượng nghiên cứu 35 2.1.1 Nhóm bệnh 35 2.1.2 Nhóm chứng 36 2.2 Trang thiết bị, dụng cụ hóa chất 36 2.2.1 Trang thiết bị nghiên cứu 36 2.2.2 Dụng cụ nghiên cứu 37 2.2.3 Hóa chất nghiên cứu 37 2.3 Phương pháp nghiên cứu 40 2.3.1 Thiết kế nghiên cứu 40 2.3.2 Nội dung nghiên cứu 41 2.3.3 Địa điểm nghiên cứu 41 2.3.4 Quy trình kỹ thuật sử dụng nghiên cứu 41 2.4 Vấn đề đạo đức nghiên cứu 49 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 50 3.1 Kết tách chiết DNA 50 3.2 Kết xác định đột biến gen COL1A1, COL1A2 nhóm bệnh nhân tạo xương bất toàn 52 3.2.1 Kết xác định đột biến gen COL1A1 52 3.2.2 Kết xác định đột biến gen COL1A2 61 3.2.3 Kết đột biến gen COL1A1, COL1A2 63 3.2.4 Kết điểm đột biến vùng exon, intron gen COL1A1, COL1A2 64 3.3 Kết xác định đột biến gen COL1A1, COL1A2 bố mẹ bệnh nhân tạo xương bất toàn phát đột biến gen COL1A1 COL1A2 67 Chƣơng 4: BÀN LUẬN 80 Kết tách chiết DNA 80 Kết xác định đột biến gen COL1A1, COL1A2 nhóm bệnh nhân tạo xương bất toàn 81 Kết xác định đột biến bố mẹ bệnh nhân tạo xương bất toàn phát đột biến gen COL1A1 COL1A2 96 KẾT LUẬN 108 CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ ĐƢỢC CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN ĐẾN NỘI DUNG LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Đặc điểm bệnh tạo xương bất toàn 10 Bảng 1.2 Đột biến gen COL1A1, COL1A2 bệnh nhân tạo xương bất toàn 29 Bảng 3.1 Kết đo nồng độ độ tinh mẫu DNA tách chiết từ máu ngoại vi bệnh nhân 51 Bảng 3.2 Đột biến gen COL1A1 gen COL1A2 63 Bảng 3.3 Tỷ lệ đột biến exon intron gen COL1A1, COL1A2 64 Bảng 3.4 Các điểm đột biến vùng exon gen COL1A1, COL1A2 65 Bảng 3.5 Vùng intron xảy đột biến vị trí nối gen COL1A1, COL1A2 66 Bảng 3.6 Kết xác định vị trí đột biến gen COL1A1, COL1A2 67 Bảng 3.7 Đột biến gen COL1A1, COL1A2 bố mẹ bệnh nhân tạo xương bất toàn 79 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 1.1 Tỉ lệ đột biến gen COL1A1 gây bệnh tạo xương bất toàn 26 Biểu đồ 3.1 Phân bố đột biến gen COL1A1 gen COL1A2 64 Biểu đồ 3.2 Phân bố điểm đột biến vùng exon gen COL1A1 COL1A2 65 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Phần lại xương trẻ bị tạo xương bất tồn với hình ảnh xương sọ Tam O’Shanter, tạo bất toàn, xương mỏng biến dạng Hình 1.2 Chu kỳ tái tạo xương Hình 1.3 Cấu trúc collagen trưởng thành týp I Hình 1.4 Hình ảnh bất thường xương bệnh nhân tạo xương bất toàn Hình 1.5 Hình ảnh củng mạc mắt màu xanh bệnh nhân tạo xương bất tồn Hình 1.6 Hình ảnh tạo bất tồn bệnh nhân tạo xương bất tồn Hình 1.7 Hình ảnh mơ bệnh học tạo xương bất tồn 12 Hình 1.8 Sự phân chia bè xương quan sát ánh sáng phân cực 13 Hình 1.9 Sự di truyền trội bệnh tạo xương bất tồn 15 Hình 1.10 Hình ảnh siêu âm thai 20 tuần 17 Hình 1.11 Cấu trúc phân tử collagen bình thường bất thường 21 Hình 1.12 Vị trí gen COL1A1 cánh dài nhiễm sắc thể 17 23 Hình 1.13 Vị trí gen COL1A2 cánh dài nhiễm sắc thể 24 Hình 1.14 Cấu trúc gen COL1A1 24 Hình 1.15 Tỷ lệ đột biến gen gây bệnh tạo xương bất tồn 25 Hình 1.16 Vai trị protein hnRNPs SR q trình hồn thiện mRNA 28 Hình 1.17 Hình ảnh đột biến gen COL1A1 30 Hình 1.18 Các bước phản ứng PCR 31 Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu Error! Bookmark not defined Hình 3.1 Kết xác định nồng độ độ tinh DNA bệnh nhân tạo xương bất toàn mã số OI32 máy Nano-Drop 50 Hình 3.2 Hình ảnh sản phẩm PCR đoạn gen từ exon 39 đến exon 41 gen COL1A1 52 Hình 3.3 Hình ảnh đột biến thay nucleotid G thành nucleotid T 54 Hình 3.4 Hình ảnh đột biến thay nucleotid G thành nucleotid A 55 Hình 3.5 Hình ảnh đột biến tạo mã kết thúc sớm 57 Hình 3.6 Hình ảnh đột biến nucleotid 58 Hình 3.7 Hình ảnh đột biến vị trí nối bệnh nhân mã số OI20 59 Hình 3.8 Hình ảnh đột biến vị trí nối bệnh nhân mã số OI43 60 Hình 3.9 Hình ảnh đột biến vị trí nối bệnh nhân mã số OI46 60 Hình 3.10 Hình ảnh sản phẩm PCR đoạn gen từ exon 46 đến exon 48 gen COL1A2 61 Hình 3.11 Hình ảnh đột biến thay nucleotid C thành nucleotid T 62 Hình 3.12 Sơ đồ gia đình bệnh nhân mã số OI04, OI08 (trước phân tích gen) 68 Hình 3.13 Hình ảnh giải trình tự gen COL1A1 bố mẹ gia đình bệnh nhân mã số OI04, OI08 69 Hình 3.14 Sơ đồ gia đình bệnh nhân mã số OI04, OI08 (sau phân tích gen) 70 Hình 3.15 Sơ đồ gia đình mã số OI20 (trước phân tích gen) 71 Hình 3.16 Hình ảnh giải trình tự gen COL1A1 bố mẹ bệnh nhân mã số OI20 72 Hình 3.17 Sơ đồ gia đình mã số OI20 (sau phân tích gen) 73 Hình 3.18 Sơ đồ gia đình mã số OI43 (trước phân tích gen) 74 Hình 3.19 Hình ảnh giải trình tự gen COL1A1 bố mẹ bệnh nhân mã số OI43 75 Hình 3.20 Sơ đồ gia đình mã số OI43 (sau phân tích gen) 76 Hình 3.21 Sơ đồ gia đình mã số OI03 (trước phân tích gen) 77 Hình 3.22 Hình ảnh giải trình tự gen COL1A1 bố mẹ bệnh nhân mã số OI03 78 Hình 3.23 Sơ đồ gia đình mã số OI03 (sau phân tích gen) 79 4,6,7,9,12,13,15,17,21,23-26,28,30,31,40,50,52-62,64,65,68-79 1-3,5,8,10,11,14,16,18-20,22,27,29,32-39,41-49,51,63,66,67,80138 - 43 ... Tỷ lệ đột biến gen gây bệnh tạo xƣơng bất toàn (nguồn: https://oi.gene.le.ac.uk) 26 Các đột biến gen COL1A1 gây bệnh tạo xương bất toàn gồm đột biến thay nucleotid, đột biến nucleotid, đột biến. .. có đột biến gen COL1A1 Tinh sản phẩm PCR Giải trình tự gen COL1A2 Phân tích đột biến gen COL1A2 bệnh nhân bệnh tạo xương bất tồn Có đột biến gen COL1A2 Nghiên cứu bố mẹ bệnh nhân có đột biến gen. .. bất toàn Xác định đột biến gen COL1A1, COL1A2 bố mẹ bệnh nhân phát đột biến gen COL1A1 COL1A2 3 Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Bệnh tạo xƣơng bất toàn 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh tạo xương bất toàn giới