Xác định đột biến gen COL1A1, COL1A2 gây bệnh tạo xương bất toàn (Osteogenesis Imperfecta)

ĐẶT VẤN ĐỀ Đột biến gen được xác định là một trong những nguyên nhân gây nên nhiều bệnh, đặc biệt là các bệnh lý di truyền và rối loạn chuyển hóa. Những tổn thương gen thường xảy ra sớm nhất. Các tổn thương này thông qua cơ chế điều hòa gen trong mối tương tác giữa các gen với nhau hoặc các gen với các phân tử nội bào hoặc mối tương tác tế bào - tế bào mà biểu hiện thành các thể bệnh nặng, nhẹ khác nhau. Các nhà khoa học trên thế giới đã đi sâu tìm hiểu cơ chế gây đột biến và kết quả cho thấy: cơ chế gây đột biến gen rất phức tạp, các kiểu/dạng đột biến đa dạng và phong phú tùy thuộc vào từng thể bệnh, mức độ năng nhẹ và có hoặc không đặc hiệu với chủng tộc. Trong giai đoạn hiện nay chúng ta chưa thể sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để can thiệp nhằm ngăn ngừa sự phát sinh đột biến nhưng với mỗi một bệnh lý cụ thể các nhà khoa học hoàn toàn có thể xác định được chính xác các đột biến một cách sớm nhất để đưa ra những giải pháp can thiệp kịp thời hay các lời khuyên di truyền nhằm nâng cao hiệu quả điều trị và phòng bệnh. Bệnh tạo xương bất toàn (osteogenesis imperfecta) còn gọi là bệnh xương thủy tinh hay bệnh giòn xương. Hơn 90% bệnh tạo xương bất toàn là di truyền trội trên nhiễm sắc thể thường. Bệnh bao gồm nhiều thể lâm sàng và có đặc điểm di truyền khác nhau với tần suất mắc bệnh 1/15.000÷1/25.000 [1],[2],[3]. Nguyên nhân của bệnh là do đột biến gen tổng hợp collagen týp I dẫn đến thiếu hụt hoặc bất thường cấu trúc của phân tử collagen týp I gây nên giòn xương, giảm khối lượng xương và bất thường các mô liên kết. Collagen týp I là một loại protein chiếm ưu thế trong chất nền ở khoảng gian bào của hầu hết các mô, được tìm thấy ở xương, màng bọc các cơ quan, giác mạc, củng mạc mắt, cân và dây chằng, mạch máu, da, màng não, là thành phần chính của ngà răng và chiếm 30% trọng lượng cơ thể. Vì vậy, khi bị khiếm khuyết chất cơ bản ngoại bào, bệnh không chỉ biểu hiện bất thường ở xương mà còn bất thường ở các tổ chức khác như củng mạc mắt màu xanh, tạo răng bất toàn, giảm thính lực… [4],[5]. Bệnh tạo xương bất toàn gây đau đớn, tàn phế suốt đời cho trẻ cả về mặt thể chất lẫn tâm thần với thể bệnh nhẹ. Còn với thể bệnh nặng thì gây tỷ lệ tử vong cao. Cho đến nay, vẫn chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu đối với bệnh tạo xương bất toàn. Chủ yếu là điều trị triệu chứng, giảm đau, giảm gãy xương tái phát với mục đích giảm đến mức tối đa tỷ lệ tàn tật và suy giảm các chức năng, giúp cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân [6],[7]. Các nhà khoa học đã phát hiện ra rằng, khoảng trên 90% các trường hợp bệnh tạo xương bất toàn gây nên do đột biến gen COL1A1 và COL1A2 [8]. Từ đó đến nay, khoảng 300 dạng đột biến khác nhau trên COL1A1 và COL1A2 đã được phát hiện, trong đó đột biến phổ biến nhất được mô tả bởi Dalgleish và cộng sự năm 1997 là sự thay đổi các acid amin glycin thành một acid amin khác. Các đột biến này không tập trung ở vùng trọng điểm (hotspot) mà rải rác khắp chiều dài của gen vì vậy quá trình phân tích gen tìm đột biến tương đối khó khăn [9],[10],[11],[12]. Bằng kỹ thuật phân tích gen thì kết quả phân tích gen là tiền đề quan trọng giúp chẩn đoán trước sinh đối với các đối tượng có nguy cơ cao sinh con bị bệnh tạo xương bất toàn để đưa ra những tư vấn di truyền giúp ngăn ngừa và làm giảm tỉ lệ mắc bệnh [13],[14]. Các nghiên cứu bệnh tạo xương bất toàn ở Việt Nam vẫn còn rất ít, chủ yếu nghiên cứu về mặt lâm sàng tại bệnh viện Nhi Trung ương nên số lượng nghiên cứu về bệnh tạo xương bất toàn chưa nhiều, thông tin còn hạn chế. Xuất phát từ thực tiễn đó, nghiên cứu này được tiến hành nhằm mục tiêu: 1. Xác định đột biến gen COL1A1, COL1A2 trên bệnh nhân mắc bệnh tạo xương bất toàn. 2. Xác định đột biến gen COL1A1, COL1A2 ở bố mẹ của bệnh nhân đã phát hiện đột biến gen COL1A1 hoặc COL1A2.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BÙI THỊ HỒNG CHÂU XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN COL1A1, COL1A2 GÂY BỆNH TẠO XƯƠNG BẤT TOÀN (OSTEOGENESIS IMPERFECTA) Chuyên ngành: Hóa sinh Mã số 62720112 LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học GS.TS Tạ Thành Văn HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN Lời cho phép xin bày tỏ lòng tri ân sâu sắc tới GS.TS Tạ Thành Văn, Phó Hiệu Trưởng Trường Đại học Y Hà Nội, Trưởng Bộ môn Hóa sinh Trường Đại học Y Hà Nội, Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Gen- Protein Trường Đại học Y Hà Nội người hướng dẫn khoa học, người thầy tận tình truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu để hoàn thành luận án Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Trần Vân Khánh, Phó Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Gen- Protein Trường Đại học Y Hà Nội, người thầy định hướng, giúp đỡ, động viên suốt trình học tập, tạo thuận lợi cho trình thực đề tài hoàn thành luận án ngày hôm Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Thị Hà, người thầy giúp đỡ, động viên suốt trình học tập hoàn thành luận án Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến: PGS.TS Phạm Thiện Ngọc, nguyên Trưởng Bộ môn Hóa sinh Trường Đại học Y Hà Nội tạo điều kiện, giúp đỡ trình học tập hoàn thành luận án Các CBVC Trung tâm nghiên cứu Gen-Protein trường Đại học Y Hà Nội giúp đỡ, tạo điều kiện, chia sẻ kinh nghiệm quý báu để thực kỹ thuật nghiên cứu hoàn thành đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: - Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau Đại học, Bộ môn Hóa sinh Trường Đại học Y Hà Nội - Ban Giám hiệu, Phòng ban chức năng, CBVC Bộ môn Hóa sinh, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện cho suốt trình học tập nghiên cứu - Xin gửi lời cảm ơn đến gia đình bệnh nhân tạo xương bất toàn giúp đỡ có số liệu luận án - Xin cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp giúp đỡ, động viên nhiều trình học tập Cuối cùng, xin ghi nhớ công ơn sinh thành, nuôi dưỡng tình yêu thương cha mẹ tôi, cha mẹ chồng ủng hộ, giúp đỡ, động viên chồng, hai anh chị em gia đình, người bên tôi, chỗ dựa vững để yên tâm học tập hoàn thành luận án Hà Nội, ngày tháng năm 2015 NCS Bùi Thị Hồng Châu LỜI CAM ĐOAN Tôi Bùi Thị Hồng Châu, nghiên cứu sinh khóa 30 Trường Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Hóa sinh, xin cam đoan: Đây luận án thân trực tiếp thực hướng dẫn GS.TS Tạ Thành Văn Công trình không trùng lặp với nghiên cứu khác công bố Việt Nam Các số liệu thông tin nghiên cứu hoàn toàn xác, trung thực khách quan, xác nhận chấp thuận sở nơi nghiên cứu Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật cam kết Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Người viết cam đoan Bùi Thị Hồng Châu DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT OI Osteogenesis imperfecta (tạo xương bất toàn) COL1A1 Collagen týp I alpha COL1A2 Collagen týp I alpha DNA Deoxyribonucleic acid cDNA Complementary deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleic acid mRNA Messenger ribonucleic acid (RNA thông tin) NST Nhiễm sắc thể Kb Kilo base bp Base pair dNTP deoxyribonucleotide triphosphate ddNTP dideoxyribonucleotide triphosphate PCR Polymerase chain reaction RT-PCR Reverse transcription PCR (PCR mã ngược) EDTA Ethylendiamin tetraacetic acid SDS Sodium dodecyl sulfate TE Tris - EDTA TBE Tris borate EDTA Ala: alanin Gly: glycin Pro: prolin Arg: arginin His: histidin Ser: serin Asn: asparagin Ile: isoleucin Stop: mã kết thúc Asp:aspartic Leu: leucin Thr: threonin Cys: cystein Lys: lysin Trp: tryptophan Gln: glutamin Met: methionin Tyr: tyrorin Glu: acid glutamic Phe: phenylalanin Val: valin MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1 Bệnh tạo xương bất toàn 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh tạo xương bất toàn giới 1.1.2 Đặc điểm cấu tạo trình chuyển hóa xương 1.1.3 Lâm sàng phân loại bệnh tạo xương bất toàn 1.1.4 Cận lâm sàng 11 1.1.5 Tần suất mắc bệnh tạo xương bất toàn 14 1.1.6 Di truyền học bệnh tạo xương bất toàn 14 1.1.7 Chẩn đoán 16 1.1.8 Điều trị bệnh tạo xương bất toàn 17 1.2 Cơ chế phân tử bệnh tạo xương bất toàn 20 1.2.1 Cấu trúc, chức protein collagen týp I 20 1.2.2 Vị trí, cấu trúc, chức gen COL1A1, COL1A2 23 1.3 Phương pháp phát đột biến gen COL1A1, COL1A2 30 1.3.1 Phương pháp PCR 30 1.3.2 Phương pháp giải trình tự gen 31 1.3.3 Kỹ thuật SSCP 33 1.4 Tình hình nghiên cứu giới Việt Nam 33 1.4.1 Trên giới 33 1.4.2 Ở Việt Nam 34 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 2.1 Đối tượng nghiên cứu 35 2.1.1 Nhóm bệnh 35 2.1.2 Nhóm chứng 36 2.2 Trang thiết bị, dụng cụ hóa chất 36 2.2.1 Trang thiết bị nghiên cứu 36 2.2.2 Dụng cụ nghiên cứu 37 2.2.3 Hóa chất nghiên cứu 37 2.3 Phương pháp nghiên cứu 40 2.3.1 Thiết kế nghiên cứu 40 2.3.2 Nội dung nghiên cứu 41 2.3.3 Địa điểm nghiên cứu 41 2.3.4 Quy trình kỹ thuật sử dụng nghiên cứu 41 2.4 Vấn đề đạo đức nghiên cứu 49 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 50 3.1 Kết tách chiết DNA 50 3.2 Kết xác định đột biến gen COL1A1, COL1A2 nhóm bệnh nhân tạo xương bất toàn 52 3.2.1 Kết xác định đột biến gen COL1A1 52 3.2.2 Kết xác định đột biến gen COL1A2 61 3.2.3 Kết đột biến gen COL1A1, COL1A2 63 3.2.4 Kết điểm đột biến vùng exon, intron gen COL1A1, COL1A2 64 3.3 Kết xác định đột biến gen COL1A1, COL1A2 bố mẹ bệnh nhân tạo xương bất toàn phát đột biến gen COL1A1 COL1A2 67 Chƣơng 4: BÀN LUẬN 80 Kết tách chiết DNA 80 Kết xác định đột biến gen COL1A1, COL1A2 nhóm bệnh nhân tạo xương bất toàn 81 Kết xác định đột biến bố mẹ bệnh nhân tạo xương bất toàn phát đột biến gen COL1A1 COL1A2 96 KẾT LUẬN 108 CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ ĐƢỢC CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN NỘI DUNG LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Đặc điểm bệnh tạo xương bất toàn 10 Bảng 1.2 Đột biến gen COL1A1, COL1A2 bệnh nhân tạo xương bất toàn 29 Bảng 3.1 Kết đo nồng độ độ tinh mẫu DNA tách chiết từ máu ngoại vi bệnh nhân 51 Bảng 3.2 Đột biến gen COL1A1 gen COL1A2 63 Bảng 3.3 Tỷ lệ đột biến exon intron gen COL1A1, COL1A2 64 Bảng 3.4 Các điểm đột biến vùng exon gen COL1A1, COL1A2 65 Bảng 3.5 Vùng intron xảy đột biến vị trí nối gen COL1A1, COL1A2 66 Bảng 3.6 Kết xác định vị trí đột biến gen COL1A1, COL1A2 67 Bảng 3.7 Đột biến gen COL1A1, COL1A2 bố mẹ bệnh nhân tạo xương bất toàn 79 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 1.1 Tỉ lệ đột biến gen COL1A1 gây bệnh tạo xương bất toàn 26 Biểu đồ 3.1 Phân bố đột biến gen COL1A1 gen COL1A2 64 Biểu đồ 3.2 Phân bố điểm đột biến vùng exon gen COL1A1 COL1A2 65 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Phần lại xương trẻ bị tạo xương bất toàn với hình ảnh xương sọ Tam O’Shanter, tạo bất toàn, xương mỏng biến dạng Hình 1.2 Chu kỳ tái tạo xương Hình 1.3 Cấu trúc collagen trưởng thành týp I Hình 1.4 Hình ảnh bất thường xương bệnh nhân tạo xương bất toàn Hình 1.5 Hình ảnh củng mạc mắt màu xanh bệnh nhân tạo xương bất toàn Hình 1.6 Hình ảnh tạo bất toàn bệnh nhân tạo xương bất toàn Hình 1.7 Hình ảnh mô bệnh học tạo xương bất toàn 12 Hình 1.8 Sự phân chia bè xương quan sát ánh sáng phân cực 13 Hình 1.9 Sự di truyền trội bệnh tạo xương bất toàn 15 Hình 1.10 Hình ảnh siêu âm thai 20 tuần 17 Hình 1.11 Cấu trúc phân tử collagen bình thường bất thường 21 Hình 1.12 Vị trí gen COL1A1 cánh dài nhiễm sắc thể 17 23 Hình 1.13 Vị trí gen COL1A2 cánh dài nhiễm sắc thể 24 Hình 1.14 Cấu trúc gen COL1A1 24 Hình 1.15 Tỷ lệ đột biến gen gây bệnh tạo xương bất toàn 25 Hình 1.16 Vai trò protein hnRNPs SR trình hoàn thiện mRNA 28 Hình 1.17 Hình ảnh đột biến gen COL1A1 30 Hình 1.18 Các bước phản ứng PCR 31 Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu Error! Bookmark not defined Hình 3.1 Kết xác định nồng độ độ tinh DNA bệnh nhân tạo xương bất toàn mã số OI32 máy Nano-Drop 50 Hình 3.2 Hình ảnh sản phẩm PCR đoạn gen từ exon 39 đến exon 41 gen COL1A1 52 33 Rauch F., Travers R., Parfitt A.M., Glorieux F.H (2000) Static and dynamic bone histomorphometry in children with osteogenesis imperfecta Bone, 26, 581-589 34 Robert D Steiner (2005) Osteogenesis imperfecta GeneReviews.com 35 Anish Kaplani (2005) Osteogenesis imperfecta Pediatrics Emedicine.com 36 Pyung Kil Kim (1970) Osteogenesis imperfecta congenita - Five cases and review of the literature Yonsei medical journal, 11(1) 37 Neish A.S., Winalski et al (1995) Osteogenesis imperfecta Emedicine.com 38 Baldridge D., Schwarze U., Morello R et al (2008) CRTAP and LEPRE1 mutations in recessive osteogenesis imperfecta Hum Mutat., 29, 1435-1442 39 Marini J.C., Cabral W.A., Barnes A.M (2010) Null mutations in LEPRE1 and CRTAP cause severe recessive osteogenesis imperfecta Cell Tissue Res., 339, 59-70 40 Van Dijk F.S., Nesbitt I.M., Zwikstra E.H et al (2009) PPIB mutations cause severe recessive osteogenesis imperfecta Am J Hum Genet., 85, 521-527 41 Trịnh Văn Bảo, Trần Thị Thanh Hương (2014) Di truyền y học Nhà xuất giáo dục Việt Nam, 136-142 42 Marlowe A., Pepin M.G., Byers P.H (2002) Testing for osteogenesis imperfecta in cases of suspected non-accidental injury J Med Genet, 39, 382-386 43 Feng Z.Y., Chen Q., Shi C.Y., Wen H.W., Ma K., Yang H.X (2012) A type IV osteogenesis imperfecta family and pregnancy: a case report and literature review Chin Med J (Engl), 125, 1358-1360 44 Oleksiy Solovyov, Yana O Goncharova, Valeriy Zukin (2010) Osteogenesis imperfecta, type II Clinic of reproductive medicine “NADIYA”, Kyiv, Ukraine 45 Howitz E.M., Prockop D.J (2001) Clinical respones to bone marrow transplantation in children with severe osteogenesis imperfecta Blood, 5, 1227-1231 46 Horwitz E.M., Gordon P.L et al (2002) Isolated allogeneic bone marrow-derived mesenchymal cell engraft and stimulate growth in children with osteogenesis imperfecta: Implication for cell therapy of bone PNAS, 13, 8932-8937 47 Byers P.H (2000) Osteogenesis imperfecta: perspectives and opportunities Curr Opin Pediatr, 12, 603-609 48 Forlino A., Marini J.C (2000) Osteogenesis imperfecta: prospects for molecular therapeutics Mol Genet Metab, 71, 225-232 49 Albright J.A (1981) Systemic treatment of osteogenesis imperfecta Clin rthop, 159, 88-96 50 Brumsen C., Hamdy N.A., Papapoulos S.E (1997) Long-term effects of biphosphonates on the growing skeleton: studies of young patients with severe osteoporosis Medicine (Baltimore), 76, 266-283 51 Zacharin M., Bateman J (2002) Pamidronate treatment of osteogenesis imperfecta: lack of correlation between clinical severity, age at onset of treatment, predicted collagen mutation and treatment response J Pediatr Endocrinol Metab, 15, 163-174 52 Van Dijk F.S., Cobben J.M., Kariminejad A., Maugeri A., Nikkels P.G.J., van Rijn R.R., Pals G (2011.) Osteogenesis Imperfecta: A Review with Clinical Examples Molecular Syndromology, 2, 1-20 53 Kadler K.E., Baldock C., Bella J., Boot-Handford R.P (2007) Collagens at a glance J.Cell Sci, 120 (12), 1955-1958 54 Brodsky B and Persikov A V (2005) Molecular structure of the collagen triple helix Adv Protein Chem, 70, 301-339 55 Sophia Millington-Ward, Helena P McMahon, G Jane Farrar (2005) Emerging therapeutic approaches for osteogenesis imperfect Trends in Molecular Medicine, 11(6), 299-305 56 Gelse K., Poschl E., Aigner T (2003) Collagens-structure, function, and biosynthesis Adv Drug Deliv Rev, 55 (12), 1531–1546 57 Liu S.H., Yang R.S., Al-Shaikh R., Lane J.M (1995) Collagen in tendon, ligament, and bone healing A current review Clin Orthop Relat Res, 318, 265–278 58 Simon M.P., Maire G., Pedeutour F (2001) COL1A1 (collagen, type I alpha 1) Atlas Genet Cytogenet Oncol Haematol, 5(2), 78-82 59 Elizabeth M Perruccio, David D Roberts (2009) COL1A2 (collagen, type I alpha 2) Atlas Genet Cytogenet Oncol Haematol, 13(2), 114-119 60 Chu M.L., Williams C.J., Pepe G et al (1983) Internal deletion in a collagen gene in a perinatal lethal form of osteogenesis imperfecta Nature, 304, 78-80 61 Pihlajaniemi T, Dickson LA, Pope FM et al (1984) Osteogenesis imperfecta: cloning of a pro-alpha 2(I) collagen gene with a frameshift mutation J Biol Chem, 259, 12941-12944 62 Zhang Z.L., Zhang H., Ke Y.H., et al (2012) The identification of novel mutations in COL1A1, COL1A2, and LEPRE1 genes in Chinese patients with osteogenesis imperfect J Bone Miner Metab, 30, 69-77 63 Tạ Thành Văn, Trần Vân Khánh, Trần Huy Thịnh, Lê Minh Khôi, Nguyễn Thị Băng Sương (2011) Bệnh học phân tử Nhà xuất Y học, 208-216 64 Frank Rauch, Liljana Lalic, Peter Roughley, Francis H Glorieux (2010) Genotype–phenotype correlations in nonlethal osteogenesis imperfecta caused by mutations in the helical domain of collagen type I Eur J Hum Genet 18(6): 642-647 65 Hartikka H., Kuurila K., Körkkö J et al (2004) Lack of correlation between the type of COL1A1 or COL1A2 mutation and hearing loss in osteogenesis imperfecta patients Hum Mutat, 24, 147-54 66 Kataoka K., Ogura E., Hasegawa K et al (2007) Mutations in type I collagen genes in Japanese osteogenesis imperfecta patients Pediatr Int, 49, 564-569 67 Dale L Bodian, Ting-Fung Chan, Annie Poon, Ulrike Schwarze, Kathleen Yang, Peter H Byers, Teri E Klein (2009) Mutation and polymorphism spectrum in osteogenesis imperfecta type II: implications for genotype–phenotype relationships Human Molecular Genetics, 18, 463-471 68 Cole W.G (1994) Collagen genes: mutation affecting collagen structure and expression Prog Nucl Acid Res Mol Biol, 47, 29-80 69 Lee Hung (2008) Diverse roles of hnRNP L in mammalian mRNA processing: A combined microarray and RNAi analysis RNA, 14, 284-295 70 Freud M (2003) A novel approach to describe a U1 snRNA binding site Nucleic Acids Research, 31(23), 6963-6975 71 Marini J.C (2007) Consortium for osteogenesis imperfecta mutations in the helical domain of type collagen: regions rich in lethal mutations align with collagen binding sites for integrins and proteoglycans Hum Mutat, 28(3), 209-221 72 Shengdong Ke and Lawrence A Chasin (2010) Intronic Motif pairs cooperate across exons to promote pre-mRNA splicing Genome Biology, 11:R84 73 Dreayfuss G (1993) hnRNP proteins and the biogenesis of mRNA Ann.Rev.Bichem, 62, 289-321 74 Han K (2005) Acombinatorial Code for Splicing Silencing UAGG and GGGG Motifs PLOSBiology, 3(5), 158 75 Tạ Thành Văn (2010) PCR số kỹ thuật y sinh học phân tử Nhà xuất Y học 76 Phạm Hùng Vân (2009) PCR real-time PCR – Các vấn đề áp dụng thường gặp Nhà xuất Y học 77 Hồ Huỳnh Thùy Dương (2003) Sinh học phân tử, lần thứ Nhà xuất Giáo dục 78 Khuất Hữu Thanh (2006) Một số phương pháp sử dụng kỹ thuật gen Cơ sở di truyền phân tử kỹ thuật gen Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, 137-164 79 McPherson M.J., Hames B.D., Taylor G.R (1995) Optimizing PCR PCR 2- A practical approach, Oxford University Press, 1-22 80 Lee H.H., Morse S.A., Olsvik O (1997) Nucleic acid amplification technologies: application to disease diagnosis Eaton Publishing, 49-60 81 Sorscher D.H (1997) DNA amplification techniques Molecular Diagnostics Humana Press, 98-101 82 Reece R.J (2004) Polymerase chain reaction Analysis of Genes and Genomes John Wiley & Sons Ltd, 153-182 83 Sanger F., Nicklen S and Coulson A.R (1977) DNA sequencing with chain-terminating inhibitors Proc Natl Acad Sci 74(12), 5463-5467 84 Koolman J (2005) DNA sequencing Color Atlas of Biochemistry, 2nd edition, 260-262 85 Mackay K., Lund A.M., Raghunath M., Steinmann B., Dalgleish R (1993) SSCP detection of a Gly565Val substitution in the pro alpha 1(I) collagen chain resulting in osteogenesis imperfecta type II Hum Genet, 91(5), 439-444 86 Cấn Thị Bích Ngọc Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng điều trị bệnh tạo xương bất toàn Bệnh viện Nhi Trung ương 20002009 Luận văn thạc sỹ Y học 87 Vũ Chí Dũng, Nguyễn Thị Hoàn cộng (2004) Bệnh tạo xương bất toàn đột biến gen COL1A1 COL1A2: Nhận xét trường hợp chẩn đoán điều trị Bệnh viện Nhi Trung ương Y học thực hành, 495, 42-51 88 Penttinen P.P., Lichtenstein J.R., Martin G.R., McKusick V.A (1975) Abnormal collagen metabolism in cultured cells in Osteogenesis imperfecta Proc Natl Acad Sci, 72, 586-589 89 Trelstad R.L., Rubin D., Gross J (1977) Osteogenesis imperfecta congenita Evidence for a generalized molecular disorder of collagen Lab Invest, 36, 501-508 90 Jutta Becker, Oliver Semler et al (2011) Exome Sequencing Identifies Truncating Mutations in Human SERPINF1 in Autosomal-Recessive Osteogenesis Imperfecta Am J Hum Genet, 88(3), 362-371 91 Prockop D.J (1985) Mutations in collagen genes Consequences for rare and common diseases J Clin Invest., 75(3), 783-787 92 De Wet W.J., Pihlajaniemi T., Myers J., Kelly T.E., Prockop D.J (1983) Synthesis of a shortened pro-alpha (I) chain and decreased synthesis of pro-alpha (I) chains in a proband with osteogenesis imperfecta J Biol Chem., 258(12), 7721-7728 93 Byers P H., Shapiro J R., Rowe D W (1983) Abnormal alpha 2chain in type I collagen from a patient with a form of osteogenesis imperfecta J Clin Invest., 71(3), 689-697 94 Steinmann B., Rao V.H., Vogel A., Bruckner P., Gitzelmann R., Byers P.H (1984) Cysteine in the triple-helical domain of one allelic product of the alpha 1(I) gene of type I collagen produces a lethal form of osteogenesis imperfecta J Biol Chem., 259(17), 11129-11138 95 Steinmann B., Nicholls A., Pope F.M (1986) Clinical variability of osteogenesis imperfecta reflecting molecular heterogeneity: cysteine substitutions in the alpha 1(I) collagen chain producing lethal and mild forms J Biol Chem., 261(19), 8958-8964 96 Cole W.G (1997) The molecular pathology of osteogenesis imperfecta Clin Orthop Relat Res., 343, 235-248 97 Ward L.M., Lalic L., Roughley P.J., Glorieux F.H (2001) Thirty-three novel COL1A1 and COL1A2 mutations in patients with osteogenesis imperfe.cta types I-IV Hum Mutat, 17, 434 98 Benusiené E., Kucinskas V (2003) COL1A1 mutation analysis in Lithuanian patients with osteogenesis imperfecta J Appl Genet, 44(1), 95-102 99 Pollitt R., McMahon R., Nunn J et al (2006) Mutation analysis of COL1A1 and COL1A2 in patients diagnosed with osteogenesis imperfecta type I-IV Hum Mutat, 27, 716 100 Xia X.Y., Cui Y.X., Huang Y.F et al (2008) A novel RNA-splicing mutation in COL1A1 gene causing osteogenesis imperfecta type I in a Chinese family Clin Chim Acta, 398(1-2), 148-151 101 Joshi Stephen, Anju Shukla, Ashwin Dalal et al (2014) Mutation spectrum of COL1A1 and COL1A2 genes in Indian patients with osteogenesis imperfecta AJMG, 164(6), 1482-1489 102 Fuccio A., Iorio M., Amato F., Elce A., Ingino R., Filocamo M., Castaldo G., Salvatore F., Tomaiuolo R (2011) A novel DHPLC-based procedure for the analysis of COL1A1 and COL1A2 mutations in osteogenesis imperfecta J Mol Diagn, 13(6), 648-656 103 Cole W.G (2002) Advances in osteogenesis imperfecta Clin Orthop Relat Res., 401, 6-16 104 Fleur S van Dijk, Margriet Huizer, Ariana Kariminejad et al (2010) Complete COL1A1 allele deletions in osteogenesis imperfecta Genetics in Medicine, 12(11), 736-741 105 Bilezikian J (2008) Principles of Bone Biology, 3rd Ed, AP, 1, 287-289 106 Reuter M.S., Schwabe G.C., Ehlers C., Marschall C., Reis A., Thiel C., Graul-Neumann L (2013) Two novel distinct COL1A2 mutations highlight the complexity of genotype-phenotype correlations in osteogenesis imperfecta and related connective tissue disorders Eur J Med Genet, 56(12), 669-673 107 Yang Z., Ke Z.F., Zeng C., Wang Z., Shi H.J., Wang L.T (2011) Mutation characteristics in type I collagen genes in Chinese patients with osteogenesis imperfecta Genet Mol Res, 10(1), 177-185 108 Zhao X and Yan S.G (2011) Recent progress in osteogenesis imperfecta Orthopaedic Surgery, 3, 127-130 109 Niyibizi C., Smith P., Mi Z., Robbins P., Evans C (2000) Potential of gene therapy for treating osteogenesis imperfecta Clin Orthop Relat Res., 379, 126-133 110 Paterson C.R., McAllion S., Miller R (1983) Osteogenesis imperfecta with dominant inheritance and normal sclerae J Bone Joint Surg Br., 65(1), 35-39 PHỤ LỤC KINH PHÍ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI Đề tài thực sở đề tài cấp Bộ: “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để xác định đột biến gen (COL1A1, COL1A2) gây bệnh tạo xương bất toàn (Osteogenesis Imperfecta: OI) trẻ em Việt Nam” Chủ nhiệm đề tài: TS.TRẦN VÂN KHÁNH Với tài trợ kinh phí từ ngân sách Sự Nghiệp Khoa Học cấp Bộ Y Tế PHỤ LỤC BỆNH ÁN NGHIÊN CỨU Mã số: ……………………… I THÔNG TIN VỀ BỆNH NHÂN: Họ tên: ……………………………Tuổi:………Nam/Nữ: Địa chỉ: Số điện thoại liên lạc: Nghề nghiệp:………………………… Trình độ văn hóa: Chẩn đoán týp lâm sàng: …………………………………… Tình trạng hôn nhân: Chưa lập gia đình:□ Đã lập gia đình: □ Khác: □ Triệu chứng lâm sàng: Chiều cao: .cm - Biến dạng xương dài sau đẻ - Xương sọ mềm sau đẻ - Đầu hình tam giác - Biến dạng lồng ngực - Cong vẹo cột sống - Ngắn chi Cân nặng: kg - Biến dạng xương dài (chỉ cong gập góc) - Gãy xương tự phát tái phát - Chậm phát triển chiều cao - Tạo bất toàn - Củng mạc mắt màu xanh - Giảm thính lực - Số lần gãy xương từ sau đẻ đến khám - Số lần gãy xương từ sau đẻ đến điều trị - Điều trị biphosphonat Tiền sử gia đình: Bố mẹ bị bệnh: Anh (chị) em bị bệnh: PHỤ LỤC Bảng Trình tự mồi khuếch đại gen COL1A1 STT Exon 5’UTR Exon 10 11 Tên mồi Trình tự mồi 5’UTP2_P1 GACGGGAGTTTCTCCTCGGGG 5’UTP2_P2 GAGTCTCCGGATCATCCACGT E1_P1 CGAGGTTGGGGTTGAACG E1_P2 CCGGGTCTAAGAGGCACACT Exon E2-5_P1 CAGGTGGGCATGGCTCTC 2-5 E2-5_P2 TCCTGTAGGATTCTTGCAACT Exon E6-9_P1 CACACCAGGAAGTGCATG 6-9 E6-9_P2 CTGAGTATCGTTCCCAAATGT Exon E10-14_P1 CTGACCTGCAACAATCC 10-14 E10-14_P2 CCCGTTAAGTCCACTGAGCAC Exon E15-18_P1 GATCCCTGAGCTCTGGAAGGG 15-18 E15-18_P2 CTCCTCTTCCTTTCCGGATTTC Exon E19-23_P1 TAAGTATCCTGCCAGGCTTCA 19-23 E19-23_P2 TAGGGAGGCAGAGAGGTATGA Exon E24-25_P1 GTCTGGGATGAGGCGTTCTGG 24-25 E24-25_P2 TAGGGAGGCTGAGGTCCAGAA Exon E26-29_P1 AGGGCCCAGCAAGAAGCACCT 26-29 E26-29_P2 TGGCTGTCTGATTAGCTAGGA Exon E30-32_P1 CAGACCCCAGGAGGAAGGACC E30-32 E30-32_P2 GATTCAAAGCAGGCAAGAATG Exon E33-38_P1 CCTCTCAGGAAACCCAGACAC 33-38 E33-38_P2 GACATAGGAACAGTCAGAGG Kích thƣớc (bp) 320 1227 283 968 1124 1326 1248 491 818 794 1268 12 13 14 15 16 Exon E39-41_P1 GAGTATCACCCGCCTCTCTGT 39-41 E39-41_P2 CCTGCCTGGGTGAAGTCCGAC Exon E42-45_P1 GCGGAGCCAAGGAGAACAGAT 42-45 E42-45_P2 TCGCCCTGTTCGCCTCTTCTCA Exon E46_P1 GTCCTGTCGGCCCTGTT 46 E46_P2 CAGAGAGGGAAGAGAGTGGG Exon E47-49_P1 GCTGGGGTTGCGGGCT 47-49 E47-49_P2 CATGTCCCTTCTGAGCACTGG Exon E50-51_P1 GGACCCTGGACAGGGAGGCC 50-51 E50-51_P2 CAGTTTGGGTTGCTTGTCTGT 1421 1174 1203 927 679 Bảng Trình tự mồi khuếch đại gen COL1A2 Kích STT Exon Tên mồi Trình tự mồi thƣớc (bp) Exon CATTGTAGTTACATCAGTCTTACC E4_P2 GCTTCTTCTGCAGTGCATTACCT E5_P1 TCCACCCTACTTGCACATAGAAAGG E5_P2 GACAGGGCTCACAAAGAGAATGCG E6_P1 GGGAAGTTCTCCATTTCAAAGAGGTGT E6_P2 GCTAAATAAATGGCGTGGTAAAATGTGA Exon E7-9_P1 GTCTGACCCCAGCCAACACCAT 7-9 E7-9_P2 CCACGGATTTGAAAGTCAGTATATGT Exon 10 11 ATGGGTGCCATACTTTTGACCTGC E4_P1 Exon CTGAGAGTCTGCCCTCCAAGTGTA CAAGTCTTTTTTTTTCCTTTTGTATGTA E1_P2 E2-3_P2 Exon CCCCCATTCGCTCCCTCCT Exon 2- E2-3_P1 E1_P1 Exon E10-12_P1 CAGCAAGCATACCATAAGCAAC 10-12 E10-12_P2 GAGGTCATGCGGAATTTCAATCA Exon E13-16_P1 GAATCTAAGGGAGAAATTGGGGAGGA 13-16 E13-16_P2 AACACAGTTCCAATCTTTCACATCACA Exon E17-19_P1 TGCAGATAAAGAGATAATTACGAAACA 17-19 E17-19_P2 TGTTGAAACTCTCTTGCAGACAA Exon E20-23_P1 CTTGAGCTTCTCTTTACCTTGAC 20-23 E20-23_P2 TAAAGAAGGAAGTAATGCCAGGTGTGA Exon E24-26_P1 AAAAAGTCGGGGGAAAAGGTGCCTT 24-26 E24-26_P2 AGTGTGGTTCTTAGATGAATGCTATGTGA 491 1088 294 385 374 1346 833 1316 1304 1073 1229 12 13 14 15 16 Exon E27-29_P1 CTTTGAGACATCTTAAACTACCTGCTT 27-29 E27-29_P2 TGGCTCATTCTCTCCATCAGCAC Exon E30-31_P1 TGCACTCATGTAGATACTGCCAGGT 30-31 E30-31_P2 GGTCCACTGGAATCGGATTGCTGTT Exon E32-33_P1 TCTCCCTCCTTTCAATAGCCCAGCC 32-33 E32-33_P2 TTGACACTAGGAAGTTAGAAAATTCGGAT Exon E34-37_P1 FFAFTACCCTCCTTCTGAGAGTGGC 34-37 E34-37_P2 ACCACCCTTATGAGGTTATCAG Exon E38-39_P1 TGCGGGAATGATCCACTTGAAGAAA 38-39 E38-39_P2 GAAAAGCTGACTTCAGACCAGGAG Exon E40_P1 CATAAAGGAAGACAGGAGTTGC 40 E40_P2 CATCAACAAATAGATGCCACTTG 815 1557 1221 1475 1167 17 18 19 20 21 22 448 Exon E41-42_P1 CTCACAATCTTCAAGCCAACCTGTG 41-42 E41-42_P2 AAAGCCCATTCTTTGGCCTAAGCAA Exon E43-45_P1 AGGGTTCGTTACTGAGCATG 43-45 E43-45_P2 TGAAAATCCTTCTGAGCTGAAGGCC Exon E46-48_P1 GCAGATTACCAGCAGAGGTGAGAGC 46-48 E46-48_P2 TGGGGCTAACTTTAATGGGGTTGTC Exon E49-50_P1 GAACATGCTTCCGTGTGAAGCTC 49-50 E49-50_P2 GTCCAATCAATCCATCTTCTAATGTG Exon E51-52_P1 CCCTTTTCCTAAGCTTGGATCTGAG 51-52 E51-52_P2 TTGCCCACAATTTAAGCAAGTAG 1142 1098 1121 1472 782 [...]... loại bệnh tạo xương bất toàn làm 11 týp [7], [27],[28],[29],[30],[31] Thể bệnh tạo xương bất toàn được phân loại tùy theo mức độ nghiêm trọng của bệnh Đột biến mới gặp ở 60% dạng bệnh nhẹ nhất (chiếm hơn một nửa các ca bệnh tạo xương bất toàn) bao gồm: bệnh tạo xương bất toàn loại cổ điển- không biến dạng (classic – non deforming) với củng mạc mắt màu xanh Hoặc bệnh tạo xương bất toàn thuộc loại biến. .. mắc bệnh [13],[14] Các nghiên cứu bệnh tạo xương bất toàn ở Việt Nam vẫn còn rất ít, chủ yếu nghiên cứu về mặt lâm sàng tại bệnh viện Nhi Trung ương nên số lượng nghiên cứu về bệnh tạo xương bất toàn chưa nhiều, thông tin còn hạn chế Xuất phát từ thực tiễn đó, nghiên cứu này được tiến hành nhằm mục tiêu: 1 Xác định đột biến gen COL1A1, COL1A2 trên bệnh nhân mắc bệnh tạo xương bất toàn 2 Xác định đột biến. .. với các bệnh lý khác về xương tương đối cao Một số bệnh lý xương như bệnh osteomalacia (bệnh nhuyễn xương) có các biểu hiện lâm sàng tương tự bệnh tạo xương bất toàn Bởi vậy, các phương pháp nghiên cứu di truyền và xác định đột biến gen góp phần chẩn đoán xác định và tiên lượng bệnh tạo xương bất toàn [6],[32],[42] Đối với bệnh lý của thai nhi trong đó có bệnh tạo xương bất toàn, hiện nay siêu âm trước... trúc xương gây giòn xương làm xương dễ gãy Hình 1.5 Hình ảnh củng mạc mắt màu xanh ở bệnh nhân tạo xƣơng bất toàn Hình ảnh đột biến gen tổng hợp collagen týp I ảnh hưởng lên củng mạc mắt biểu hiện củng mạc mắt màu xanh Hình 1.6 Hình ảnh tạo răng bất toàn ở bệnh nhân tạo xƣơng bất toàn Hình ảnh đột biến gen tổng hợp collagen týp I ảnh hưởng lên quá trình tạo răng 10 Bảng 1.1 Đặc điểm của bệnh tạo xƣơng... thể phổ biến (common variable) với củng mạc mắt bình thường Hầu hết (100%) bệnh tạo xương bất toàn chết chu sinh (perinatally lethal osteogenesis imperfecta) Gần 100% loại bệnh tạo xương bất toàn tiến triển dạng tăng dần (progressively deforming osteogenesis imperfecta) là do đột biến mới 9 Hình 1.4 Hình ảnh bất thƣờng xƣơng ở bệnh nhân tạo xƣơng bất toàn Hình ảnh đột biến gen tổng hợp collagen týp... biến gen COL1A1, COL1A2 ở bố mẹ của bệnh nhân đã phát hiện đột biến gen COL1A1 hoặc COL1A2 3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN 1.1 Bệnh tạo xƣơng bất toàn 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh tạo xương bất toàn trên thế giới Theo nghiên cứu của Lowenstein E.J ở Ai Cập thì bệnh tạo xương bất toàn đã xuất hiện từ 1.000 năm trước công nguyên (hình 1.1), [15] Tuy nhiên đến năm 1788, những mô tả khoa học đầu tiên về bệnh tạo xương. .. tiến triển bệnh và nâng cao chất lượng cuộc sống của người bệnh cũng đã được hướng dẫn và phổ biến một cách rộng rãi 1.1.3 Lâm sàng và phân loại bệnh tạo xương bất toàn Biểu hiện lâm sàng phụ thuộc vào từng týp của bệnh tạo xương bất toàn Tùy theo từng người, bệnh tạo xương bất toàn có thể biểu hiện nhẹ hoặc nghiêm trọng Xương bị giòn, dễ gãy là đặc điểm của những người mắc bệnh tạo xương bất toàn Một... các bệnh về xương khác như còi xương kháng vitamin D, đái tháo phosphat,… 1.1.5 Tần suất mắc bệnh tạo xương bất toàn Về mặt dịch tễ, tỷ lệ mắc bệnh tạo xương bất toàn khác nhau ở các týp khác nhau: bệnh týp I và týp IV chiếm hơn một nửa trong số tất cả các trường hợp Với týp II, tỷ lệ mắc là 1÷2/100.000 và đều tử vong sớm Tạo xương bất toàn týp III có tỷ lệ khoảng 1÷2/100.000, còn tạo xương bất toàn. .. hoàn toàn có thể xác định được chính xác các đột biến một cách sớm nhất để đưa ra những giải pháp can thiệp kịp thời hay các lời khuyên di truyền nhằm nâng cao hiệu quả điều trị và phòng bệnh Bệnh tạo xương bất toàn (osteogenesis imperfecta) còn gọi là bệnh xương thủy tinh hay bệnh giòn xương Hơn 90% bệnh tạo xương bất toàn là di truyền trội trên nhiễm sắc thể thường Bệnh bao gồm nhiều thể lâm sàng và... bào, bệnh không chỉ biểu hiện bất thường ở xương 2 mà còn bất thường ở các tổ chức khác như củng mạc mắt màu xanh, tạo răng bất toàn, giảm thính lực… [4],[5] Bệnh tạo xương bất toàn gây đau đớn, tàn phế suốt đời cho trẻ cả về mặt thể chất lẫn tâm thần với thể bệnh nhẹ Còn với thể bệnh nặng thì gây tỷ lệ tử vong cao Cho đến nay, vẫn chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu đối với bệnh tạo xương bất toàn ... Kết xác định đột biến gen COL1A1, COL1A2 nhóm bệnh nhân tạo xương bất toàn 52 3.2.1 Kết xác định đột biến gen COL1A1 52 3.2.2 Kết xác định đột biến gen COL1A2 61 3.2.3 Kết đột. .. có đột biến gen COL1A1 Tinh sản phẩm PCR Giải trình tự gen COL1A2 Phân tích đột biến gen COL1A2 bệnh nhân bệnh tạo xương bất toàn Có đột biến gen COL1A2 Nghiên cứu bố mẹ bệnh nhân có đột biến gen. .. bất toàn Xác định đột biến gen COL1A1, COL1A2 bố mẹ bệnh nhân phát đột biến gen COL1A1 COL1A2 3 Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Bệnh tạo xƣơng bất toàn 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh tạo xương bất toàn giới