(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng xạ khuẩn ưa nhiệt thu thập tại Buôn Ma Thuột

(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng xạ khuẩn ưa nhiệt thu thập tại Buôn Ma Thuột(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng xạ khuẩn ưa nhiệt thu thập tại Buôn Ma Thuột(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng xạ khuẩn ưa nhiệt thu thập tại Buôn Ma Thuột(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng xạ khuẩn ưa nhiệt thu thập tại Buôn Ma Thuột(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng xạ khuẩn ưa nhiệt thu thập tại Buôn Ma Thuột(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng xạ khuẩn ưa nhiệt thu thập tại Buôn Ma Thuột(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng xạ khuẩn ưa nhiệt thu thập tại Buôn Ma Thuột(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng xạ khuẩn ưa nhiệt thu thập tại Buôn Ma Thuột(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng xạ khuẩn ưa nhiệt thu thập tại Buôn Ma Thuột(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng xạ khuẩn ưa nhiệt thu thập tại Buôn Ma Thuột(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng xạ khuẩn ưa nhiệt thu thập tại Buôn Ma Thuột(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng xạ khuẩn ưa nhiệt thu thập tại Buôn Ma Thuột(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng xạ khuẩn ưa nhiệt thu thập tại Buôn Ma Thuột(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng xạ khuẩn ưa nhiệt thu thập tại Buôn Ma Thuột(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng xạ khuẩn ưa nhiệt thu thập tại Buôn Ma Thuột(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng xạ khuẩn ưa nhiệt thu thập tại Buôn Ma Thuột(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng xạ khuẩn ưa nhiệt thu thập tại Buôn Ma Thuột(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng xạ khuẩn ưa nhiệt thu thập tại Buôn Ma Thuột(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng xạ khuẩn ưa nhiệt thu thập tại Buôn Ma Thuột(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng xạ khuẩn ưa nhiệt thu thập tại Buôn Ma Thuột(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng xạ khuẩn ưa nhiệt thu thập tại Buôn Ma Thuột(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng xạ khuẩn ưa nhiệt thu thập tại Buôn Ma Thuột(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng xạ khuẩn ưa nhiệt thu thập tại Buôn Ma Thuột

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN =======***======= ĐẬU THỊ DUNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CELLULASE CỦA CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN ƯA NHIỆT THU THẬP TẠI BUÔN MA THUỘT LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Buôn Ma Thuột, năm 2010 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN =======***======= ĐẬU THỊ DUNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CELLULASE CỦA CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN ƯA NHIỆT THU THẬP TẠI BUÔN MA THUỘT Chuyên Ngành Sinh Học Thực Nghiệm Mã Số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Người hướng dẫn: TS.Võ Thị Phương Khanh Buôn Ma Thuột, năm 2010 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Khưu Phương Yến Anh (2007), Nghiên cứu khả enzyme cellulase số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn cần giờ, Luận văn thạc sĩ sinh học, Trường Đại học sư phạm TP Hồ Chí Minh [2] Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa (2007), Công nghệ sinh học, tập : Enzyme ứng dụng, Nxb Giáo dục, trang 45 – 94 [3] Nguyễn Thị Kim Cúc, Phạm Việt Cường, Nguyễn Thị Tuyết Mai, Lê Văn Nhương (1999), Phân lập định loại số tính chất chủng vi nấm, xạ khuẩn có tiềm ứng dụng quy trình xử lý vỏ cà phê , Báo cáo khoa học Hội Nghị Cơng Nghệ Sinh Học Tồn Quốc; NXB KHKT; tr 206-213 [4] Tăng Thị Chính, Lý Kim Bảng, Lê Gia Hy (1999), Nghiên cứu sản xuất enzyme cellulase số chủng vi sinh vật ưa nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải, Báo cáo khoa học Hội Nghị Cơng Nghệ Sinh Học Tồn Quốc, NXB KHKT; tr 790-796 [5] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyền, Phạm Văn Ty (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật, tập 2,3, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật [6] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2007), Vi sinh vật học, Nhà xuất Giáo dục [7] Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty (1972), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Nhà xuất Khoa học kĩ thuật [8] Nguyễn Lân Dũng (1976), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập 2, NXB khoa học kỹ thuật [9] Lê Gia Hy, (1994), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh đạo ơn thối cổ rễ phân lập Việt Nam, Luận án Phó tiến sĩ sinh học [10] Nguyễn Lan Hương, Lê Văn Nhương, Hồng Đình Hồ (1999); Phân lập hoạt hóa vi sinh vật ưa nhiệt có hoạt tính cellulase cao để bổ sung lại vào khối ủ, rút ngắn chu kỳ xử lý rác thải sinh hoạt, Báo cáo khoa học Hội Nghị Công Nghệ Sinh Học Toàn Quốc, NXB KHKT, tr 531-535 [11] Phạm Thị Ngọc Lan, Phạm Thị Hoà, Lý Kim Bảng (1999), Tuyển chọn số chủng xạ khuẩn có khả phân giải cellulose từ mùn rác, Báo cáo khoa học Hội Nghị Cơng Nghệ Sinh Học Tồn Quốc, NXB KHKT; tr 177-182 [12] Nguyễn Đức Lượng, Đặng Vũ Bích Hạnh (1999), Khả sinh tổng hợp Cellulase Atinomyces griseus, Báo cáo khoa học Hội Nghị Cơng Nghệ Sinh Học Tồn Quốc, NXB KHKT; tr 804- 809 [13] Nguyễn Đức Lượng, Đặng Vũ Bích Hạnh (1999), Một số tính chất enzyme cellulase xạ khuẩn Actinomyces griseus, Báo cáo khoa học Hội Nghị Cơng Nghệ Sinh Học Tồn Quốc, NXB KHKT, tr 580-583 [14] Đinh Thị Kim Nhung (2005), Ảnh hưởng nguồn cacbon nitơ cho việc tạo thành xenlulase Acetobacter xylinum, Đại học Sư Phạm Hà Nội 2; Những vấn ñề nghiên cứu khoa học sống, NXB KHKT [15] Ngơ Đại Nghiệp (2009), Giáo trình enzyme học, Trường Đại học Quốc gia TP.Hồ Chí Minh [16] Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Phạm Trân Châu, Nguyễn Lân Dũng (1982), Enzyme vi sinh vật, Nxb KH&KT [17] Trần Cẩm Vân (2001), Giáo trình vi sinh vật học môi trường, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội [18] Lê Thị Thanh Xuân, Phan Thị Tuyết Minh Viện Công Nghệ Sinh Học, Viện KH&CNVN Trần Hà Ninh, Tăng Thị Chính Viện Cơng Nghệ Mơi Trường, Viện KH&CNVN (2005), Phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn ưa nhiệt sinh tổng hợp xenlulaza cao, Những vấn ñề nghiên cứu khoa học sống, NXB KHKT; tr 872-875 [19] Lương Đức Phẩm, Hồ Sường (1978), Vi sinh tổng hợp, NXB khoa học kỹ thuật Hà Nội [20] GS.TS Nguyễn Xuân Thành (2007), Giáo trình vi sinh vật học công nghiệp, NXB Giáo dục [21] Trần Thanh Thủy (1998), Hướng dẫn thực hành vi sinh vật học, Nhà xuất giáo dục [22] Hồ Sĩ Tráng (2004), Cơ sở hoá học gỗ cellulose tập 1,2, NXB khoa học kỹ thuật Hà Nội [23] Allister J Lyons, JR., and Thomas G Pridham (1965), Colorimetric Determination of Color of Aerial Mycelium of Streptomycetes, Journal of bacteriology, American Society for Microbiology, 89(1), pp 159-169 [24] Bergey’s Mannual of Systematic bacteriology (1989), Vol [25] Becker, B., M.P Lechevalier and H.A.Lechevalier (1965), Chemical composition of cell wall preparations from Strains of various form – genera of aerobic Actinomyce, J.Appl Microbiol., 13, pp 236-243 [26] Eberhard Kuster (1972), Simple working key for the classification and identification of named taxe included in the International Stepmyces project, Inter.J Syst Bac., 3, pp.139-148 [27] Faiez Alani, William A Anderson, Murray Moo-Young (2007), New isolate of Streptomyces sp with novel thermoalkalotolerant cellulases, Biotechnol Lett DOI 10.1007/s10529-007-9500-9 Original research paper [28] Hung-Der Jang and Kuo-Shu Chen (2002), Production and characterization of thermostable cellulases from Streptomyces transformant T31, World Journal of Microbiology & Biotechnology 19: 263–268, 2003 Kluwer Academic Publishers Printed in the Netherlands [29] John G Holt, Noel R Krieg, Peter H A Sneath, James T Staley , Stanley T Wikkiams, 1994, Bergey’s Mannual of determinative bacteriology, Ninth Edition, Lippincott Williams & Wilkins, p 605-703 [30] Lechevalier, M P and H.A.Lechevalier (1970) Chemical composition as a criterion in the classification of aerobic Actinomycetes, Int J System Bact., 20, pp 435-443 [31] Sherling, E.B and D.Gottlieb (1966), Methods for characterization of Streptomyces species, Intern J Syst Bact., 16(3), pp 313-340 [32] Thomas G Pridham (1965), Color and Streptomycetes - Report of an International Workshop on Determination of Color of Streptomycetes, Applied microbiology, American Society for Microbiology., 13(1), pp 43-61 TP.Hồ Chí Minh [33] Tresner, H.D., E.J.Buckus (1963), System of color wheels for Streptomyces taxonomy, Appl.Microbiol, 11, pp 335-338 [34] Waksman, S.A (1961), The Actinomycetes, vol.2 Classification, idetification and description of the genera and species, The Williams and Wilkins Co., Baltimore [35] Williams, S.T., M.Goodfellow, G.Alderson, E.M Wellington, P.H.A.Sneath and M.J Sackin (1983), Numerical classification of Streptomyces and related genera, J.Gen Microbiol., 129, pp.1743-1813 [36] Witt, D., W Liesack and E Stackebbandt (1989), Identification of Streptomyces by 16S RNA Sequences and oligonucleotide probes, Recent advances in microbial ecology, Tokyo, Japan Scientific Press [37] Witt, D and E Stackebbandt (1990), Unification of the genera Streptomyces and Streptoverticillium and amendation of Streptomyces Waksman and Henrici 1443, System.Appl Microbiol., 13, pp 361- 371 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Đường chuẩn CMCase Nồng ñộ glucose (IU/ml) OD540nm 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.103 0.224 0.365 0.451 0.604 0.7 Đường chuẩn CMCase y = 1.2317x - 0.0066 R2 = 0.9789 O D 540n m 0.8 0.6 OD 540nm 0.4 Linear (OD 540nm) 0.2 0 0.2 0.4 0.6 Nồng ñộ glucose (mg/ml) 0.8 Phụ lục 2: Tương quan hàm lượng glucose(mg/ml) số OD540n.m Nồng ñộ glucose (IU/ml) 0.100 0.200 0.300 0.400 Chỉ số OD 0.103 0.106 0.100 0.224 0.226 0.222 0.368 0.363 0.364 0.551 Trung bình OD Sai số 0.103 0.00001 0.224 0.00029 0.365 0.0021 0.451 0.0114 0.604 0.0054 0.700 0.005 0.550 0.552 0.500 0.606 0.602 0.604 0.600 0.700 0.698 0.702 Phụ lục 3: Đường kính vịng phân giải nồng độ đường khử mơi trường ni cấy 12 chủng phân lập STT Chủng 10 11 12 C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C12 Chỉ số OD 540n.m 0.718 0.695 0.702 0.744 0.924 0.903 0.876 0.996 0.987 0.826 0.741 0.891 0.785 0.775 0.750 1.124 1.193 1.081 1.060 1.046 1.090 0.705 0.624 0.684 0.905 0.980 0.960 0.692 0.622 0.602 0.576 0.656 0.568 0.545 0.525 0.616 Trung bình OD Nồng độ đường khử(IU/ml) 0.705 0.579 0.857 0.702 0.953 0.780 0.819 0.672 0.770 0.632 1.132 0.926 1.065 0.871 0.671 0.551 0.948 0.776 0.638 0.525 0.601 0.495 0.562 0.463 Đường kính vịng thủy phân (mm) 32.0 29.0 26.0 33.0 30.0 30.0 30.0 28.0 29.0 31.0 28.0 30.0 37.0 30.0 25.0 32.0 31.0 30.0 35.0 36.0 31.0 18.0 23.0 22.0 20.0 22.0 20.0 28.0 30.0 25.0 29.0 25.0 20.0 20.0 18.0 20.0 Mức ñộ phân giải Mạnh Mạnh Mạnh Mạnh Mạnh Mạnh Mạnh Khá Khá Mạnh Mạnh Mạnh Phụ lục 4: Khả chịu nhiệt chủng xạ khuẩn Chủng Nhiệt ñộ 450C 500C A2 550C 600C 650C 450C 500C C2 550C 600C 650C 450C 500C C3 550C 600C Chỉ số OD 540n.m 0.858 0.910 0.920 0.775 0.826 0.756 0.536 0.436 0.551 0.379 0.324 0.327 0.392 0.445 0.438 0.750 0.706 0.739 0.920 0.786 0.776 0.773 0.758 0.782 0.611 0.478 0.531 0.781 0.753 0.774 0.903 0.740 0.757 0.756 0.749 0.805 0.532 0.556 0.536 0.365 0.381 0.290 Trung bình Sai số Nồng độ đường khử(IU/ml) 0.890 0.00110 0.729 0.786 0.00131 0.645 0.508 0.00390 0.419 0.343 0.00100 0.285 0.425 0.00080 0.352 0.731 0.00052 0.600 0.827 0.00647 0.678 0.771 0.00015 0.633 0.540 0.00448 0.445 0.769 0.00021 0.631 0.800 0.00803 0.656 0.770 0.00093 0.632 0.541 0.00017 0.446 0.345 0.00236 0.287 51 Bảng 3.5 Ảnh hưởng tỉ lệ ñường bổ sung ñến tốc ñộ sinh trưởng khả phân giải cellulose chủng xạ khuẩn tuyển chọn sau ngày nuôi cấy Ký hiệu chủng A2 C2 C3 C4 C6 Tỷ lệ ñường bổ sung (%) 0% 0.05%G 0.1%G 0.15%G 0.05%S 0.1%S 0.15%S 0% 0.05%G: 0.1%G: 0.15%G 0.05%S 0.1%S 0.15%S 0% 0.05%G: 0.1%G: 0.15%G 0.05%S 0.1%S 0.15%S 0% 0.05%G: 0.1%G: 0.15%G 0.05%S 0.1%S 0.15%S 0% 0.05%G: 0.1%G: 0.15%G 0.05%S 0.1%S Đường kính vịng thủy Tốc độ sinh trưởng phân (mm) sau ngày nuôi cấy (lần) 28.7 6.519 29.0 2.359 29.7 6.522 32.7 3.508 29.0 4.931 30.7 2.279 28.7 2.757 34.3 2.082 33.0 5.349 34.2 12.633 30.1 2.531 29.7 2.592 28.0 3.598 30.8 2.854 34.5 2.062 32.0 3.653 31.3 2.719 34.8 7.385 36.7 1.986 30.7 3.974 33.5 3.812 34.5 31.7 32.7 33.5 32.7 32.5 31.0 28.0 27.2 29.7 29.5 27.3 31.0 5.400 4.169 5.016 3.312 4.262 2.160 2.088 1.037 3.712 3.068 6.316 2.465 2.653 52 C7 Ctm 0.15%S 0% 0.05%G: 0.1%G: 0.15%G 0.05%S 0.1%S 0.15%S 0% 0.05%G: 0.1%G: 0.15%G 0.05%S 0.1%S 0.15%S 31.7 27.3 25.7 26.7 27.7 27.7 27.5 29.2 34,3 34.0 21.3 20.6 24.3 17.6 16.8 2.438 2.720 4.541 2.333 3.010 1.159 1.796 5.879 17,000 3.310 2.267 3.673 2.308 3.766 6.579 Kết bảng 3.5 cho thấy: - Đối với chủng C2, đường kính vịng thủy phân nghiệm thức bổ sung 0,1% glucose tương ñương ( 30,1 – 34,2 mm) so với môi trường khơng bổ sung (34,3mm) Nhưng tốc độ sinh trưởng xạ khuẩn vượt trội, tăng 12,633 lần so với môi trường không bổ sung tăng 5,068 lần Khi bổ sung nồng độ saccharose, đường kính vịng thủy phân thấp (28,0 – 30,8mm) Tốc ñộ sinh trưởng tăng 0,371 lần so với không bổ sung - Ở chủng C3, đường kính vịng thủy phân 34.8 mm mơi trường bổ sung 0,15% glucose, tương đương so với mơi trường khơng bổ sung (34.5mm) Tốc độ sinh trưởng xạ C2 tăng 7.385 lần tỉ lệ bổ sung này, so với môi trường không bổ sung, sinh trưởng tăng 2.581 lần Khi bổ sung nồng độ saccharose, đường kính vịng thủy phân biến động từ 30.7 – 36.7mm tốc ñộ sinh trưởng tăng 0,927 lần so với mức độ tăng mơi trường khơng bổ sung - Chủng C6 có đường kính vịng thủy phân 29.5 mm nồng ñộ ñường bổ sung 0,15% glucose, cao so với môi trường không bổ sung (28.0mm) Tốc ñộ sinh trưởng xạ khuẩn tăng 6.316 lần tỉ lệ bổ sung 53 này, cao gấp 0,432 lần so với môi trường không bổ sung Ở nồng độ saccharose bổ sung, đường kính vịng thủy phân biến động nhiều (27.3 – 31.7mm), tốc ñộ sinh trưởng so với không bổ sung tăng 1,558 lần - Đối với chủng C7, môi trường bổ sung 0,05% glucose, đường kính vịng thủy phân 25,7 mm so với môi trường không bổ sung 27.3mm Nhưng tốc ñộ sinh trưởng C7 so với môi trường không bổ sung glucose tăng 0.669 lần Khi bổ sung nồng độ saccharose, đường kính vịng thủy tương đương với khơng bổ sung, tốc độ sinh trưởng tăng so với khơng bổ sung 1,161 lần Ngồi ra, chủng Ctm thương mại hóa, đường kính vịng thủy phân môi trường bổ sung 0,05% glucose 34,0 mm tương đương với mơi trường khơng bổ sung (34,3mm) Ở nồng ñộ bổ sung khác glucose saccharose, đường kính vịng thủy phân thấp hẳn, biến ñộng từ 16,8 – 24,3mm tốc ñộ sinh trưởng ñều thấp hẳn, biến ñộng từ 2,267 – 6,579 lần sau ngày nuôi cấy Trong đó, tốc độ sinh trưởng chủng thương mại Ctm mơi trường khơng bổ sung đường tăng 17,0 lần sau ngày Nhìn chung, trừ chủng C4, khả phân giải cellulose chủng C2, C3, C6, C7 tương đương mơi trường bổ sung không bổ sung glucose tỉ lệ 0,1 – 0,15% , tốc độ sinh trưởng khơng tương đương Sau ngày nuôi cấy, sinh trưởng chủng hầu hết cao hẳn so với mơi trường khơng bổ sung Điều khẳng định vai trị glucose, nguồn cacbon dễ sử dụng cho vi sinh vật Các chủng xạ khuẩn ñã sử dụng glucose ñể tăng sinh khối Sau nguồn glucose cạn kiệt, xạ khuẩn sử dụng ñến nguồn cellulose từ CMC Do đó, thời gian ni cấy ngày, tốc độ sinh trưởng cao hoạt tính enzyme khơng cao, tương đương với mơi trường khơng bổ sung đường 54 Đối với nguồn cacbon bổ sung saccharose, biến động đường kính vịng phân giải khơng có điểm chung, nhiên, hầu hết chủng, đường kính vịng thủy phân nhỏ tương ñương so với môi trường không bổ sung Tốc ñộ sinh trưởng tăng so với môi trường không bổ sung không cao bổ sung glucose Nguyên nhân glucose ñường ñơn nên vi sinh vật sử dụng dễ dàng Saccharose đường đơi gồm glucose liên kết với fructose liên kết α 1-2 Cellulose polymer glucose, phân tử glucose liên kết với liên kết β 1-4 Do để phân giải, địi hỏi phải có enzyme phân giải liên kết saccharose việc đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng cho xạ khuẩn chậm hơn, từ xạ khuẩn sinh trưởng chậm Chủng A2 ñược Lệ Hà phân lập Cư Just cho kết tương tự chủng ñã tuyển chọn Đối chiếu với chủng vi sinh vật phân giải cellulose chế phẩm thương mại cho kết khác hẳn Trong mơi trường khơng bổ sung đường, chủng thương mại Ctm có đường kính vịng thủy phân 34,4mm, tốc độ sinh trưởng tăng 17,00 sau ngày nuôi cấy Ngược lại, mơi trường có bổ sung đường, chủng thương mại có hoạt tính enzyme tốc độ sinh trưởng thấp hẳn Đây chủng xạ khuẩn có khả phân giải cellulose tốt, khơng cần bổ sung đường mơi trường ni cấy 55 Hình 3.6 Khả phân giải cellulose ñĩa thạch chủng xạ khuẩn tuyển chọn với tỷ lệ nguồn cacbon khác Dựa vào bảng số liệu kết OD xác ñịnh khả sinh trưởng ngày sau cấy vào mơi trường có bổ sung glucose chủng xạ khuẩn khảo sát, nhận thấy: mơi trường có bổ sung đường, chủng có vượt trội mức độ tăng trưởng sau ngày ngày sau có giai ñoạn tốc ñộ tăng trưởng không biến ñộng sau lại tăng cao Như vậy, ñã diễn pha lag chuyển qua log 2, tức sau sử dụng ñường glucose ñể tăng trưởng theo hàm số log log1, tốc ñộ sinh trưởng không tăng vi sinh vật chuyển qua pha lag 2, sau tăng mạnh 56 chuyển qua log Điều chứng tỏ, đến ngày thứ ni cấy thứ 5, nguồn glucose mơi trường sử dụng hết, xạ khuẩn chuyển sang sử dụng cellulose nên có pha lag log Trong đó, tăng trưởng chúng mơi trường khơng bổ sung glucose ngày sau với tốc ñộ tăng đều, khơng có tượng dừng lại tăng vọt Như chúng tăng ñều theo hàm số log pha log sử dụng nguồn cacbon Bảng 3.6 Ảnh hưởng tỉ lệ bổ sung gluose ñến sinh trưởng chủng xạ khuẩn tuyển chọn Kết OD Kết Tỷ lệ ñường (từ ñến ngày) Tỷ lệ ñường OD Chủng Chủng bổ sung Bổ sung (từ ñến ngày) 0.049 0.097 0.110 0.099 0.132 0.124 % glucose % glucose 0.139 0.162 0.146 0.198 0.151 0.297 0.043 0.072 0.173 0.148 0.05% 0.201 0.264 0.05%G 0.209 0.269 Glucose 0.214 0.272 0.283 0.335 C3 C2 0.030 0.089 0.121 0.102 0.181 0.148 0.1%G 0.1% Glucose 0.230 0.192 0.238 0.203 0.409 0.331 0.081 0.039 0.181 0.104 0.15% 0.218 0.119 0.15%G 0.249 Glucose 0.265 0.256 0.308 0.286 0.327 0.045 0.081 C4 C6 0% glucose % glucose 0.095 0.088 57 0.05% glucose 0.1% Glucose 0.15% Glucose % glucose 0.05%G C7 0.1%G 0.15%G 0.101 0.164 0.185 0.288 0.059 0.108 0.134 0.151 0.209 0.305 0.062 0.156 0.286 0.341 0.358 0.373 0.106 0.197 0.299 0.387 0.426 0.438 0.050 0.070 0.112 0.123 0.138 0.186 0.061 0.112 0.113 0.177 0.238 0.338 0.081 0.103 0.112 0.243 0.256 0.270 0.099 0.144 0.05% Glucose 0.1% Glucose 0.15% Glucose % glucose 0.05%G Ctm 0.1%G 0.15%G 0.099 0.104 0.109 0.165 0.059 0.129 0.190 0.257 0.263 0.278 0.073 0.183 0.247 0.271 0.283 0.297 0.079 0.128 0.219 0.236 0.302 0.578 0.012 0.087 0.106 0.167 0.186 0.216 0.042 0.139 0.153 0.173 0.179 0.181 0.086 0.189 0.215 0.243 0.262 0.281 0.052 0.115 0.182 58 0.213 0.223 0.243 0.207 0.213 0.226 0.397 Như sau ngày ni cấy mơi trường có bổ sung gluose, chúng tơi xác định hoạt tính enzyme cellulase phương pháp so màu với DNS glucose sử dụng hết, xạ khuẩn chuyển sang sử dụng cellulose Kết xác ñịnh hoạt tính enzyme cellulase chủng xạ khuẩn tuyển chọn mơi trường có bổ sung đường với tỉ lệ khác ñược thể qua bảng 3.6 Bảng 3.7: Ảnh hưởng tỉ lệ ñường bổ sung ñến hoạt tính enzyme cellulase chủng xạ khuẩn Chủng Tỷ lệ nguồn Hoạt tính Chủng Tỷ lệ nguồn Hoạt tính xạ cacbon enzyme Xạ khuẩn cacbon enzyme khuẩn (%) cellulase (%) cellulase (IU/ml) C2 C3 (IU/ml) 0% 0.079 0% 0.108 0.05%G 0.074 0.05%G 0.102 0.1%G 0.155 0.1%G 0.124 0.15%G 0.051 0.15%G 0.102 0.05%S 0.054 0.05%S 0.099 0.1%S 0.056 0.1%S 0.224 0.15%S 0.212 0.15%S 0.214 0% 0.107 0% 0.115 0.05%G: 0.112 0.05%G: 0.164 0.1%G: 0.161 0.1%G: 0.165 0.15%G 0.215 0.15%G 0.182 C6 C7 59 0.05%S 0.090 0.05%S 0.129 0.1%S 0.188 0.1%S 0.165 0.15%S C4 0.131 0.15%S 0.141 0% 0.046 0% 0.166 0.05%G: 0.075 0.05%G: 0.124 0.1%G: 0.088 0.1%G: 0.213 0.15%G 0.096 0.15%G 0.044 0.05%S 0.052 0.05%S 0.349 0.1%S 0.068 0.1%S 0.230 0.15%S 0.052 0.15%S 0.130 Ctm Bảng 3.7 cho thấy, nhu cầu bổ sung nồng ñộ glucose saccharose khác chủng xạ khuẩn khác Trong chủng, nhu cầu nồng ñộ glucose khác với nhu cầu saccharose Điều thể ñặc thù chủng giống vi sinnh vật nói chung, xạ khuẩn nói riêng Tuy nhiên có ñiểm chung bổ sung glucose saccharose nồng độ 0,05%, sau ngày ni cấy, hoạt tính enzyme khơng có biến động rõ ràng so với nuôi cấy môi trường không bổ sung Nhưng bổ sung nồng ñộ 0,1% glucose, chủng tuyển chọn có hoạt tính enzyme cao hẳn so với nuôi môi trường không bổ sung tăng khơng đáng kể, từ 0,148 lần (chủng C6) ñến 0,962 lần (chủng C2) Khi bổ sung saccharose, ña số chủng xạ khuẩn tuyển chọn thích hợp nồng ñộ bổ sung 0,1%, làm hoạt tính enzyme tăng từ 0,435 lần (chủng C7) ñến 1,074 lần (chủng C6) Chủng C2 thích hợp với bổ sung saccharose 1,5% làm tăng hoạt tính enzyme 1,684 lần so với mơi trường khơng bổ sung Chủng thương mại thích hợp bố sung 0,5% saccharose, hoạt tính enzyme tăng so với mơi trường khơng bổ sung 1,102 lần 60 Thí nghiệm tiếp tục tiến hành khảo sát hoạt tính enzyme cellulase tốc ñộ sinh trưởng chủng xạ khuẩn phát triển ưu mơi trường có bổ sung glucose 1% Mục đích thí nghiệm: xác định ảnh hưởng việc bổ sung đường glucose 1% vào mơi trường ni cấy đến sinh trưởng hoạt tính enzyme theo thời gian ni cấy Chủng C2 chủng có hoạt tính enzyme biến động cao mơi trường ni cấy nên chọn để khảo sát Kết ñược ghi nhận bảng 3.8 Bảng 3.8: Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy với tỉ lệ bổ sung glucose 1% đến hoạt tính enzyme cellulase chủng xạ khuẩn C2 Tỉ lệ Thời gian Tốc ñộ sinh trưởng sau Hoạt tính glucose bổ ni cấy (ngày) ngày (lần) enzyme cellulase sung (%) 0,1 (IU/ml) 0,987 0,042 1,170 0,089 1,168 0,083 1,152 0,074 11 1,149 0,075 2,913 0,056 3,509 0,155 3,887 0,231 3,925 0,279 11 3,872 0,267 Kết nghiên cứu cho thấy, 11 ngày khảo sát, ảnh hưởng việc bổ sung glucose 0,1% thể cách rõ rệt ñến sinh trưởng sinh tổng hợp enzyme cellulase chủng xạ khuẩn C2 so với môi trường có CMC 61 Trong mơi trường khơng bổ sung glucose, sau ngày ni cấy, tốc độ sinh trưởng tăng 0,185 lần, hoạt tính enzyme tăng 1,119 lần so với ngày trước đạt kết cao Tốc độ sinh trưởng hoạt tính enzyme lại giảm dần ñến ngày thứ 11 tốc độ giảm thấp Ở mơi trường có bổ sung glucose 0,1%, ngày thứ 5, tốc ñộ sinh trưởng tăng 0,205 lần hoạt tính enzyme tăng 1,768 lần so với ngày trước Tại ngày nuôi cấy, tốc độ sinh trưởng tăng 0,108 lần, hoạt tính enzyme tăng 0,490 lần so với ngày thứ Từ ngày thứ 7, 9, 11 tốc ñộ sinh trưởng biến ñộng không rõ ràng, không tăng Hoạt tính enzyme cao vào ngày thứ 0,279 IU/ml Như theo bổ sung glucose 0,1%, xạ khuẩn sử dụng glucose ñể tăng sinh khối nên hoạt tính enzyme cellulase dịch ni chưa cao cho ñến ngày thứ Khi nguồn glucose cạn kiệt, xạ khuẩn chuyển qua sử dụng cellulose với lượng sinh khối ñã lớn so với thời ñiểm mơi trường khơng bổ sung Do vào ngày thứ 9, hoạt tính cao mơi trường ni cấy có bổ sung glucose 0,1% 3.3 Định danh chủng xạ khuẩn ưu Dựa vào khóa phân loại Bergey, chủng xạ khuẩn ưu chủng C2, C6, chúng bước ñầu ñịnh danh chủng cụ thể sau: - Chủng C2: Actinoplanes philippinensis thuộc chi Actinoplanes họ Actinoplanetes Khuẩn lạc màu xanh nâu, bề mặt xù xì, mép khuẩn lạc phẳng, cấu trúc khuẩn lạc dạng rễ, khuẩn ty chất màu vàng đục, tạo sắc tố nâu nâu mơi trường Túi sinh bào tử có dạng cầu đến ovan, kích thước từ – 25 µm, bào tử cuộn xoắn, hình cầu 1- 1,2µm Nguồn dinh dưỡng cacbon cellulose, saccharose, nhiệt độ thích hợp 45 – 550C, pH = 5,0 – 6,0 - Chủng C6: Thermomonospora fusca chi Thermomonospora fusca họ Thermomonospora 62 Khuẩn lạc màu vàng ñục, bề mặt nhẵn, mép khuẩn lạc dạng lồi cong, cấu trúc khuẩn lạc phẳng Khuẩn ty chất trắng ñục Khuẩn lạc chuyển màu thành vàng nhạt Khuẩn ty khí sinh mang bào tử thành đám, cụm Sinh trưởng mơi trường cellulose, saccharose, lactose Nhiệt độ mơi trường thích hợp 50 – 550C, pH= 7,0 – 8,0 63 PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ I Kết luận Từ kết thí nghiệm trên, chúng tơi ñưa số kết luận sau: Đã phân lập mơ tả đặc điểm hình thái, khuẩn ty 12 chủng xạ khuẩn chịu nhiệt phân giải cellulose từ ñống ủ vỏ cà phê, rơm rạ, mùn cưa ký hiệu: C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12 Dựa vào hoạt tính enzym cellulase chủng xạ khuẩn phân lập ñã tuyển chọn chủng xạ khuẩn chịu nhiệt có hoạt tính enzym cao chủng: C2, C3, C4, C6 C7 Một số yếu tố ảnh hưởng ñến hoạt tính enzym cellulase chủng xạ khuẩn tuyển chọn sau: - Nhiệt độ thích hợp chủng C2, C3, C4, C6, C7 : 450C – 500C - pH thích hợp cho chủng: C2: 5,5 - 6,0; C3: 5,5 – 7,5; C4: 5,5 – 6,5; C6: 7,0 – 8,0; C7: 6,5 – 8,0 - Bổ sung glucose 0,05% saccharose 0,05 % vào môi trường ni cấy khơng có ảnh hưởng rõ rệt hoạt tính enzyme cellulase so với khơng bổ sung - Đa số chủng tuyển chọn thích hợp với nồng ñộ saccharose 0,1 % bổ sung , riêng chủng C2 thích hợp với việc bổ sung 0,15% - Đối với chủng C2, mơi trường khơng bổ sung đường , hoạt tính enzyme cellulase cao vào ngày thứ ni cấy, sau giảm chậm dần - Ở nồng độ bổ sung 0,1% hoạt tímh enzyme cellulase chủng C2 cao vào ngày thứ 9; tốc ñộ sinh trưởng tăng khơng đáng kể sau ngày ni cấy chủng xạ khuẩn ưu tuyển chọn chủng C2, C6 định danh theo khóa phân loại Bergey sau: - Chủng C2: Actinoplanes philippinensis - Chủng C6: Thermomonospora fusca 64 II Kiến nghị Tiếp tục phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn chịu nhiệt tự nhiên Đắk Lăk ñể bảo tồn nguồn gen vi sinh vật ñịa phương Bước ñầu thử nghiệm sử dụng chủng xạ khuẩn ñã tuyển chọn vào nguồn chất phế thải nơng lâm nghiệp chứa nhiều cellulose để kiểm tra khả hiệu phân giải Nghiên cứu thu nhận bảo quản enzyme cellulase từ môi trường nuôi cấy chủng xạ khuẩn tuyển chọn 65 Người hướng dẫn khoa học BMT, ngaỳ 12 tháng 01 năm 2011 Người thực TS Võ Thị Phương Khanh Đậu Thị Dung Chủ tịch hội ñồng TS Phan Văn Tân ... hành nghiên cứu đề tài "Nghiên cứu khả sinh tổng hợp cellulase chủng xạ khuẩn ưa nhiệt thu thập Buôn Ma Thu? ??t" Mục tiêu ñề tài Tuyển chọn tự nhiên Buôn Ma thu? ??t chủng xạ khuẩn chịu nhiệt có khả sinh. .. ĐẬU THỊ DUNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CELLULASE CỦA CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN ƯA NHIỆT THU THẬP TẠI BUÔN MA THU? ??T Chuyên Ngành Sinh Học Thực Nghiệm Mã Số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Người... thập tuyển chọn chủng xạ khuẩn ưa nhiệt phân giải cellulose ñể bảo tồn nguồn gen quý vi sinh vật tự nhiên Buôn Ma thu? ??t - Ý nghĩa thực tiễn Các chủng vi sinh vật có khả phân giải hợp chất hữu phức