B� GIÁO D C VÀ ĐÀO T�O TRƯ�NG Đ I H�C TÂY NGUYÊN =======***======= Đ�U TH� DUNG NGHIÊN C�U KH� NĂNG SINH T�NG H�P CELLULASE C"A CÁC CH"NG X KHU%N ƯA NHI&T THU TH�P T I BUÔN MA THU*T LU�N VĂN TH C S, S[.]
B GIÁO D C VÀ ĐÀO T O TRƯ NG Đ I H C TÂY NGUYÊN =======***======= Đ U TH DUNG NGHIÊN C U KH NĂNG SINH T NG H P CELLULASE C"A CÁC CH"NG X KHU%N ƯA NHI&T THU TH P T I BUÔN MA THU*T LU N VĂN TH C S, SINH H C Buôn Ma Thu2t, năm 2010 B GIÁO D C VÀ ĐÀO T O TRƯ NG Đ I H C TÂY NGUYÊN =======***======= Đ U TH DUNG NGHIÊN C U KH NĂNG SINH T NG H P CELLULASE C"A CÁC CH"NG X KHU%N ƯA NHI&T THU TH P T I BUÔN MA THU*T Chuyên Ngành Sinh H c Th c Nghi m Mã S": 60.42.30 LU N VĂN TH C S, SINH H C Ngưng d@n: TS.Võ ThD Phương Khanh Buôn Ma Thu2t, năm 2010 TÀI LI&U THAM KH O [1] Khưu Phương Y2n Anh (2007), Nghiên c u kh enzyme cellulase c a m t s ch ng n m s i phân l p t r ng ng p m n c!n gi", Lu9n văn th=c sĩ sinh h c, TrưAng Đ=i h c sư ph=m TP HC Chí Minh [2] Ph=m ThE Trân Châu, Phan TuHn Nghĩa (2007), Công ngh% sinh h&c, t p : Enzyme ng d-ng, Nxb Giáo dNc, trang 45 – 94 [3] NguyRn ThE Kim Cúc, Ph=m Vi t CưAng, NguyRn ThE Tuy2t Mai, Lê Văn Nhương (1999), Phân l p ñ0nh lo2i m t s tính ch t c a ch ng vi n m, x2 khu6n có ti8m ng d-ng quy trình x; lý v= cà phê , Báo cáo khoa h c HUi NghE Công Ngh Sinh H c Toàn Qu"c; NXB KHKT; tr 206Z213 [4] Tăng ThE Chính, Lý Kim B\ng, Lê Gia Hy (1999), Nghiên c u s n xu t enzyme cellulase c a m t s ch ng vi sinh v t ưa nhi%t phân l p t b@ rác th i, Báo cáo khoa h c HUi NghE Công Ngh Sinh H c Toàn Qu"c, NXB KHKT; tr 790Z796 [5] NguyRn Lân Dũng, NguyRn Đình Quy_n, Ph=m Văn Ty (1978), M t s phương pháp nghiên c u vi sinh v t, t9p 2,3, Nhà xuHt b\n Khoa h c ka thu9t [6] NguyRn Lân Dũng, NguyRn Đình Quy2n, Ph=m Văn Ty (2007), Vi sinh v t h&c, Nhà xuHt b\n Giáo dNc [7] NguyRn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mưbu, NguyRn Phùng Ti2n, Đdng Đec Tr=ch, Ph=m Văn Ty (1972), M t s phương pháp nghiên c u vi sinh v t h&c, Nhà xuHt b\n Khoa h c kĩ thu9t [8] NguyRn Lân Dũng (1976), M t s phương pháp nghiên c u vi sinh v t h&c, t9p 2, NXB khoa h c ka thu9t [9] Lê Gia Hy, (1994), Nghiên c u x2 khu6n thu c chi streptomyces sinh ch t kháng sinh ch ng n m gây b%nh ñ2o ôn th i cE rF phân l p G Vi%t Nam, Lu9n án Phó ti2n sĩ sinh h c [10] NguyRn Lan Hương, Lê Văn Nhương, Hoàng Đình Hồ (1999); Phân l p ho2t hóa vi sinh v t ưa nhi%t có ho2t tính cellulase cao ñ@ bE sung l2i vào kh i , rút ngKn chu kỳ x; lý rác th i sinh ho2t, Báo cáo khoa h c HUi NghE Công Ngh Sinh H c Toàn Qu"c, NXB KHKT, tr 531Z535 [11] Ph=m ThE Ng c Lan, Ph=m ThE Hoà, Lý Kim B\ng (1999), Tuy@n ch&n m t s ch ng x2 khu6n có kh phân gi i cellulose t mùn rác, Báo cáo khoa h c HUi NghE Công Ngh Sinh H c Toàn Qu"c, NXB KHKT; tr 177Z182 [12] NguyRn Đec Lưbng, Đdng Vũ Bích H=nh (1999), Kh sinh tEng h p Cellulase c a Atinomyces griseus, Báo cáo khoa h c HUi NghE Cơng Ngh Sinh H c Tồn Qu"c, NXB KHKT; tr 804Z 809 [13] NguyRn Đec Lưbng, Đdng Vũ Bích H=nh (1999), M t s tính ch t enzyme cellulase c a x2 khu6n Actinomyces griseus, Báo cáo khoa h c HUi NghE Công Ngh Sinh H c Toàn Qu"c, NXB KHKT, tr 580Z583 [14] Đinh ThE Kim Nhung (2005), Qnh hưGng c a nguRn cacbon nitơ cho vi%c t2o thành xenlulase c a Acetobacter xylinum, Đ=i h c Sư Ph=m Hà NUi 2; Nhgng vHn ñ_ nghiên ceu b\n khoa h c s s"ng, NXB KHKT [15] Ngô Đ=i Nghi p (2009), Giáo trình enzyme h&c, TrưAng Đ=i h c Qu"c gia TP.HC Chí Minh [16] Lê Ng c Tú, La Văn Che, Ph=m Trân Châu, NguyRn Lân Dũng (1982), Enzyme vi sinh v t, Nxb KH&KT [17] Trjn Ckm Vân (2001), Giáo trình vi sinh v t h&c mơi trư"ng, NXB Đ=i h c Qu"c gia Hà NUi [18] Lê ThE Thanh Xuân, Phan ThE Tuy2t Minh Vi n Công Ngh Sinh H c, Vi n KH&CNVN Trjn Hà Ninh, Tăng ThE Chính Vi n Cơng Ngh Mơi TrưAng, Vi n KH&CNVN (2005), Phân l p tuy@n ch&n ch ng x2 khu6n ưa nhi%t sinh tEng h p xenlulaza cao, Nhgng vHn ñ_ nghiên ceu b\n khoa h c s s"ng, NXB KHKT; tr 872Z875 [19] Lương Đec Phkm, HC SưAng (1978), Vi sinh tEng h p, NXB khoa h c ka thu9t Hà NUi [20] GS.TS NguyRn Xuân Thành (2007), Giáo trình vi sinh v t h&c công nghi%p, NXB Giáo dNc [21] Trjn Thanh Thly (1998), HưVng dWn thXc hành vi sinh v t h&c, Nhà xuHt b\n giáo dNc [22] HC Sĩ Tráng (2004), Cơ sG hoá h&c gY cellulose t9p 1,2, NXB khoa h c ka thu9t Hà NUi [23] Allister J Lyons, JR., and Thomas G Pridham (1965), Colorimetric Determination of Color of Aerial Mycelium of Streptomycetes, Journal of bacteriology, American Society for Microbiology, 89(1), pp 159Z169 [24] Bergey’s Mannual of Systematic bacteriology (1989), Vol [25] Becker, B., M.P Lechevalier and H.A.Lechevalier (1965), Chemical composition of cell wall preparations from Strains of various form – genera of aerobic Actinomyce, J.Appl Microbiol., 13, pp 236Z243 [26] Eberhard Kuster (1972), Simple working key for the classification and identification of named taxe included in the International Stepmyces project, Inter.J Syst Bac., 3, pp.139Z148 [27] Faiez Alani, William A Anderson, Murray MooZYoung (2007), New isolate of Streptomyces sp with novel thermoalkalotolerant cellulases, Biotechnol Lett DOI 10.1007/s10529Z007Z9500Z9 Original research paper [28] HungZDer Jang and KuoZShu Chen (2002), Production and characterization of thermostable cellulases from Streptomyces transformant T3Z 1, World Journal of Microbiology & Biotechnology 19: 263–268, 2003 Kluwer Academic Publishers Printed in the Netherlands [29] John G Holt, Noel R Krieg, Peter H A Sneath, James T Staley , Stanley T Wikkiams, 1994, Bergey’s Mannual of determinative bacteriology, Ninth Edition, Lippincott Williams & Wilkins, p 605Z703 [30] Lechevalier, M P and H.A.Lechevalier (1970) Chemical composition as a criterion in the classification of aerobic Actinomycetes, Int J System Bact., 20, pp 435Z443 [31] Sherling, E.B and D.Gottlieb (1966), Methods for characterization of Streptomyces species, Intern J Syst Bact., 16(3), pp 313Z340 [32] Thomas G Pridham (1965), Color and Streptomycetes a Report of an International Workshop on Determination of Color of Streptomycetes, Applied microbiology, American Society for Microbiology., 13(1), pp 43Z61 TP.HC Chí Minh [33] Tresner, H.D., E.J.Buckus (1963), System of color wheels for Streptomyces taxonomy, Appl.Microbiol, 11, pp 335Z338 [34] Waksman, S.A (1961), The Actinomycetes, vol.2 Classification, idetification and description of the genera and species, The Williams and Wilkins Co., Baltimore [35] Williams, S.T., M.Goodfellow, G.Alderson, E.M Wellington, P.H.A.Sneath and M.J Sackin (1983), Numerical classification of Streptomyces and related genera, J.Gen Microbiol., 129, pp.1743Z1813 [36] Witt, D., W Liesack and E Stackebbandt (1989), Identification of Streptomyces by 16S RNA Sequences and oligonucleotide probes, Recent advances in microbial ecology, Tokyo, Japan Scientific Press [37] Witt, D and E Stackebbandt (1990), Unification of the genera Streptomyces and Streptoverticillium and amendation of Streptomyces Waksman and Henrici 1443, System.Appl Microbiol., 13, pp 361Z 371 PHH LHC PhN lNc 1: ĐưAng chukn CMCase NCng ñU glucose (IU/ml) OD540nm 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.103 0.224 0.365 0.451 0.604 0.7 O D 540n m Đư ng chu n CMCase N ng ñ glucose (mg/ml) PhN lNc 2: Tương quan hàm lưbng glucose(mg/ml) ch{ s" OD540n.m NCng ñU glucose (IU/ml) 0.100 0.200 0.300 0.400 Ch{ s" OD 0.103 0.106 0.100 0.224 0.226 0.222 0.368 0.363 0.364 0.551 Trung bình OD Sai s" 0.103 0.00001 0.224 0.00029 0.365 0.0021 0.451 0.0114 0.604 0.0054 0.700 0.005 0.550 0.552 0.500 0.606 0.602 0.604 0.600 0.700 0.698 0.702 PhN lNc 3: ĐưAng kính vịng phân gi\i nCng đU đưAng kh} mơi trưAng ni cHy 12 chlng phân l9p đưbc STT Chlng 10 11 12 C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C12 Ch{ s" OD 540n.m 0.718 0.695 0.702 0.744 0.924 0.903 0.876 0.996 0.987 0.826 0.741 0.891 0.785 0.775 0.750 1.124 1.193 1.081 1.060 1.046 1.090 0.705 0.624 0.684 0.905 0.980 0.960 0.692 0.622 0.602 0.576 0.656 0.568 0.545 0.525 0.616 Trung bình OD NCng đU ñưAng kh}(IU/ml) 0.705 0.579 0.857 0.702 0.953 0.780 0.819 0.672 0.770 0.632 1.132 0.926 1.065 0.871 0.671 0.551 0.948 0.776 0.638 0.525 0.601 0.495 0.562 0.463 ĐưAng kính vịng thly phân (mm) 32.0 29.0 26.0 33.0 30.0 30.0 30.0 28.0 29.0 31.0 28.0 30.0 37.0 30.0 25.0 32.0 31.0 30.0 35.0 36.0 31.0 18.0 23.0 22.0 20.0 22.0 20.0 28.0 30.0 25.0 29.0 25.0 20.0 20.0 18.0 20.0 Mec ñU phân gi\i M=nh M=nh M=nh M=nh M=nh M=nh M=nh Khá Khá M=nh M=nh M=nh PhN lNc 4: Kh\ chEu nhi t cla chlng x= khukn Chlng Nhi t ñU 450C 500C A2 550C 600C 650C 450C 500C C2 550C 600C 650C 450C 500C C3 550C 600C Ch{ s" OD 540n.m 0.858 0.910 0.920 0.775 0.826 0.756 0.536 0.436 0.551 0.379 0.324 0.327 0.392 0.445 0.438 0.750 0.706 0.739 0.920 0.786 0.776 0.773 0.758 0.782 0.611 0.478 0.531 0.781 0.753 0.774 0.903 0.740 0.757 0.756 0.749 0.805 0.532 0.556 0.536 0.365 0.381 0.290 Trung bình Sai s" NCng đU ñưAng kh}(IU/ml) 0.890 0.00110 0.729 0.786 0.00131 0.645 0.508 0.00390 0.419 0.343 0.00100 0.285 0.425 0.00080 0.352 0.731 0.00052 0.600 0.827 0.00647 0.678 0.771 0.00015 0.633 0.540 0.00448 0.445 0.769 0.00021 0.631 0.800 0.00803 0.656 0.770 0.00093 0.632 0.541 0.00017 0.446 0.345 0.00236 0.287 51 B\ng 3.5 ~nh hư•ng cla t{ l đưAng b€ sung đ2n t"c đU sinh trư•ng kh\ phân gi\i cellulose cla chlng x= khukn tuy•n ch n sau ngày ni cHy Ký hi u chlng A2 C2 C3 C4 C6 T‚ l ñưAng b€ sung (%) 0% 0.05%G 0.1%G 0.15%G 0.05%S 0.1%S 0.15%S 0% 0.05%G: 0.1%G: 0.15%G 0.05%S 0.1%S 0.15%S 0% 0.05%G: 0.1%G: 0.15%G 0.05%S 0.1%S 0.15%S 0% 0.05%G: 0.1%G: 0.15%G 0.05%S 0.1%S 0.15%S 0% 0.05%G: 0.1%G: 0.15%G 0.05%S 0.1%S ĐưAng kính vịng thly T"c đU sinh trư•ng phân (mm) sau ngày nuôi cHy (ljn) 28.7 6.519 29.0 2.359 29.7 6.522 32.7 3.508 29.0 4.931 30.7 2.279 28.7 2.757 34.3 2.082 33.0 5.349 34.2 12.633 30.1 2.531 29.7 2.592 28.0 3.598 30.8 2.854 34.5 2.062 32.0 3.653 31.3 2.719 34.8 7.385 36.7 1.986 30.7 3.974 33.5 3.812 34.5 31.7 32.7 33.5 32.7 32.5 31.0 28.0 27.2 29.7 29.5 27.3 31.0 5.400 4.169 5.016 3.312 4.262 2.160 2.088 1.037 3.712 3.068 6.316 2.465 2.653 52 C7 Ctm 0.15%S 0% 0.05%G: 0.1%G: 0.15%G 0.05%S 0.1%S 0.15%S 0% 0.05%G: 0.1%G: 0.15%G 0.05%S 0.1%S 0.15%S 31.7 27.3 25.7 26.7 27.7 27.7 27.5 29.2 34,3 34.0 21.3 20.6 24.3 17.6 16.8 2.438 2.720 4.541 2.333 3.010 1.159 1.796 5.879 17,000 3.310 2.267 3.673 2.308 3.766 6.579 K2t qu\ b\ng 3.5 cho thHy: Z Đ"i v„i chlng C2, đưAng kính vịng thly phân • nghi m thec b€ sung 0,1% glucose tương ñương ( 30,1 – 34,2 mm) so v„i môi trưAng không b€ sung (34,3mm) Nhưng t"c đU sinh trư•ng cla x= khukn vưbt trUi, tăng 12,633 ljn so v„i môi trưAng không b€ sung ch{ tăng 5,068 ljn Khi b€ sung nCng ñU saccharose, đưAng kính vịng thly phân thHp (28,0 – 30,8mm) T"c đU sinh trư•ng tăng 0,371 ljn so v„i khơng b€ sung Z • chlng C3, đưAng kính vịng thly phân 34.8 mm • mơi trưAng b€ sung 0,15% glucose, tương đương so v„i mơi trưAng khơng b€ sung (34.5mm) T"c đU sinh trư•ng cla x= C2 tăng 7.385 ljn • t{ l b€ sung này, so v„i mơi trưAng khơng b€ sung, s sinh trư•ng tăng 2.581 ljn Khi b€ sung nCng ñU saccharose, ñưAng kính vịng thly phân bi2n đUng t’ 30.7 – 36.7mm t"c đU sinh trư•ng tăng 0,927 ljn so v„i mec đU tăng cla mơi trưAng khơng b€ sung Z Chlng C6 có đưAng kính vịng thly phân 29.5 mm • nCng đU đưAng b€ sung 0,15% glucose, cao so v„i môi trưAng không b€ sung (28.0mm) T"c ñU sinh trư•ng cla x= khukn tăng 6.316 ljn • t{ l b€ sung 53 này, cao gHp 0,432 ljn so v„i mơi trưAng khơng b€ sung • nCng đU saccharose b€ sung, đưAng kính vịng thly phân bi2n ñUng nhi_u (27.3 – 31.7mm), t"c ñU sinh trư•ng so v„i không b€ sung tăng 1,558 ljn Z Đ"i v„i chlng C7, • mơi trưAng b€ sung 0,05% glucose, đưAng kính vịng thly phân 25,7 mm so v„i mơi trưAng khơng b€ sung 27.3mm Nhưng t"c đU sinh trư•ng cla C7 so v„i môi trưAng không b€ sung glucose tăng 0.669 ljn Khi b€ sung nCng ñU saccharose, ñưAng kính vịng thly tương đương v„i khơng b€ sung, t"c đU sinh trư•ng tăng so v„i khơng b€ sung 1,161 ljn Ngồi ra, đ"i v„i chlng Ctm thương m=i hóa, đưAng kính vịng thly phân • mơi trưAng b€ sung 0,05% glucose 34,0 mm ch{ tương đương v„i mơi trưAng khơng b€ sung (34,3mm) • nCng ñU b€ sung khác cla glucose saccharose, ñưAng kính vịng thly phân đ_u thHp h“n, bi2n đUng t’ 16,8 – 24,3mm t"c đU sinh trư•ng ñ_u thHp h“n, bi2n ñUng t’ 2,267 – 6,579 ljn sau ngày ni cHy Trong đó, t"c đU sinh trư•ng cla chlng thương m=i Ctm mơi trưAng khơng b€ sung đưAng tăng 17,0 ljn sau ngày Nhìn chung, tr’ chlng C4, kh\ phân gi\i cellulose cla chlng C2, C3, C6, C7 ñ_u tương ñương môi trưAng b€ sung không b€ sung glucose t{ l 0,1 – 0,15% , t"c ñU sinh trư•ng khơng tương đương Sau ngày ni cHy, s sinh trư•ng cla chlng hju h2t đ_u cao h“n so v„i môi trưAng không b€ sung Đi_u ñã kh“ng ñEnh vai trò cla glucose, nguCn cacbon dR s} dNng nhHt cho m i vi sinh v9t Các chlng x= khukn s} dNng glucose đ• tăng sinh kh"i Sau nguCn glucose c=n ki t, x= khukn m„i s} dNng đ2n nguCn cellulose t’ CMC Do đó, thAi gian ni cHy ngày, t"c đU sinh trư•ng cao ho=t tính enzyme khơng cao, ch{ tương ñương v„i môi trưAng không b€ sung ñưAng 54 Đ"i v„i nguCn cacbon b€ sung saccharose, s bi2n đUng v_ đưAng kính vịng phân gi\i khơng có nhgng ñi•m chung, nhiên, hju h2t • chlng, ñưAng kính vịng thly phân nh‡ hodc tương đương so v„i mơi trưAng khơng b€ sung T"c đU sinh trư•ng tăng so v„i môi trưAng không b€ sung không cao b€ sung glucose Nguyên nhân glucose ñưAng ñơn nên m i vi sinh v9t s} dNng dR dàng Saccharose đưAng đơi gCm glucose liên k2t v„i fructose b•ng liên k2t α 1Z2 Cellulose polymer cla glucose, phân t} glucose liên k2t v„i b•ng liên k2t β 1Z4 Do đ• phân gi\i, địi h‡i ph\i có enzyme phân gi\i liên k2t cla saccharose v9y vi c đáp eng nhu cju dinh dư‰ng cho x= khukn ch9m hơn, t’ x= khukn sinh trư•ng ch9m Chlng A2 ñưbc L Hà phân l9p t=i Cư Just cho k2t qu\ tương t chlng tuy•n ch n Đ"i chi2u v„i chlng vi sinh v9t phân gi\i cellulose ch2 phkm thương m=i cho k2t qu\ khác h“n Trong mơi trưAng khơng b€ sung đưAng, chlng thương m=i Ctm có đưAng kính vịng thly phân 34,4mm, t"c đU sinh trư•ng tăng 17,00 sau ngày ni cHy Ngưbc l=i, mơi trưAng có b€ sung đưAng, chlng thương m=i có ho=t tính enzyme t"c đU sinh trư•ng thHp h“n Đây chlng x= khukn có kh\ phân gi\i cellulose t"t, khơng cjn b€ sung đưAng mơi trưAng ni cHy 55 Hình 3.6 Kh\ phân gi\i cellulose đĩa th=ch cla chlng x= khukn tuy•n ch n v„i t‚ l nguCn cacbon khác D a vào b\ng s" li u k2t qu\ OD xác ñEnh kh\ sinh trư•ng t’ng ngày sau cHy vào mơi trưAng có b€ sung glucose cla chlng x= khukn kh\o sát, chúng tơi nh9n thHy: mơi trưAng có b€ sung đưAng, chlng có s vưbt trUi v_ mec đU tăng trư•ng sau ngày nhgng ngày sau có giai đo=n t"c đU tăng trư•ng khơng bi2n đUng sau l=i tăng cao Như v9y, • diRn pha lag chuy•n qua log 2, tec sau s} dNng ñưAng glucose ñ• tăng trư•ng theo hàm s" log • log1, t"c đU sinh trư•ng khơng tăng vi sinh v9t chuy•n qua pha lag 2, sau tăng m=nh 56 chuy•n qua log Đi_u cheng t‡, ñ2n ngày the nuôi cHy the 5, nguCn glucose mơi trưAng đưbc s} dNng h2t, x= khukn chuy•n sang s} dNng cellulose nên có pha lag log Trong đó, s tăng trư•ng cla chúng mơi trưAng khơng b€ sung glucose • ngày sau v„i t"c đU tăng đ_u, khơng có hi n tưbng d’ng l=i rCi tăng v t Như v9y chúng v…n tăng đ_u theo hàm s" log • pha log s} dNng nhHt nguCn cacbon B\ng 3.6 ~nh hư•ng cla t{ l b€ sung gluose đ2n s sinh trư•ng cla chlng x= khukn tuy•n ch n K2t qu\ OD K2t qu\ T‚ l ñưAng (t’ ñ2n ngày) T‚ l ñưAng OD Chlng Chlng b€ sung B€ sung (t’ ñ2n ngày) 0.049 0.097 0.110 0.099 0.132 0.124 % glucose % glucose 0.139 0.162 0.146 0.198 0.151 0.297 0.043 0.072 0.173 0.148 0.05% 0.201 0.264 0.05%G 0.209 0.269 Glucose 0.214 0.272 0.283 0.335 C2 C3 0.030 0.089 0.121 0.102 0.181 0.148 0.1%G 0.1% Glucose 0.230 0.192 0.238 0.203 0.409 0.331 0.039 0.081 0.104 0.181 0.15% 0.119 0.218 0.15%G 0.249 Glucose 0.265 0.256 0.308 0.286 0.327 0.045 0.081 C6 C4 0% glucose % glucose 0.095 0.088 57 0.05% glucose 0.1% Glucose 0.15% Glucose % glucose 0.05%G C7 0.1%G 0.15%G 0.101 0.164 0.185 0.288 0.059 0.108 0.134 0.151 0.209 0.305 0.062 0.156 0.286 0.341 0.358 0.373 0.106 0.197 0.299 0.387 0.426 0.438 0.050 0.070 0.112 0.123 0.138 0.186 0.061 0.112 0.113 0.177 0.238 0.338 0.081 0.103 0.112 0.243 0.256 0.270 0.099 0.144 0.05% Glucose 0.1% Glucose 0.15% Glucose % glucose 0.05%G Ctm 0.1%G 0.15%G 0.099 0.104 0.109 0.165 0.059 0.129 0.190 0.257 0.263 0.278 0.073 0.183 0.247 0.271 0.283 0.297 0.079 0.128 0.219 0.236 0.302 0.578 0.012 0.087 0.106 0.167 0.186 0.216 0.042 0.139 0.153 0.173 0.179 0.181 0.086 0.189 0.215 0.243 0.262 0.281 0.052 0.115 0.182 58 0.213 0.223 0.243 0.207 0.213 0.226 0.397 Như v9y sau ngày ni cHy mơi trưAng có b€ sung gluose, chúng tơi có th• xác đEnh ho=t tính cla enzyme cellulase b•ng phương pháp so màu v„i DNS glucose ñưbc s} dNng h2t, x= khukn ñã chuy•n sang s} dNng cellulose K2t qu\ xác đEnh ho=t tính enzyme cellulase cla chlng x= khukn tuy•n ch n mơi trưAng có b€ sung đưAng v„i t{ l khác đưbc th• hi n qua b\ng 3.6 B\ng 3.7: ~nh hư•ng cla t{ l đưAng b€ sung đ2n ho=t tính enzyme cellulase cla chlng x= khukn Chlng T‚ l nguCn Ho=t tính Chlng T‚ l nguCn Ho=t tính x= cacbon enzyme X= khukn cacbon enzyme khukn (%) cellulase (%) cellulase (IU/ml) C2 C3 (IU/ml) 0% 0.079 0% 0.108 0.05%G 0.074 0.05%G 0.102 0.1%G 0.155 0.1%G 0.124 0.15%G 0.051 0.15%G 0.102 0.05%S 0.054 0.05%S 0.099 0.1%S 0.056 0.1%S 0.224 0.15%S 0.212 0.15%S 0.214 0% 0.107 0% 0.115 0.05%G: 0.112 0.05%G: 0.164 0.1%G: 0.161 0.1%G: 0.165 0.15%G 0.215 0.15%G 0.182 C6 C7 59 0.05%S 0.090 0.05%S 0.129 0.1%S 0.188 0.1%S 0.165 0.15%S C4 0.131 0.15%S 0.141 0% 0.046 0% 0.166 0.05%G: 0.075 0.05%G: 0.124 0.1%G: 0.088 0.1%G: 0.213 0.15%G 0.096 0.15%G 0.044 0.05%S 0.052 0.05%S 0.349 0.1%S 0.068 0.1%S 0.230 0.15%S 0.052 0.15%S 0.130 Ctm B\ng 3.7 cho thHy, nhu cju v_ b€ sung nCng ñU glucose saccharose khác • chlng x= khukn khác Trong chlng, nhu cju v_ nCng ñU glucose khác v„i nhu cju v_ saccharose Đi_u th• hi n s ñdc thù cla chlng gi"ng vi sinnh v9t nói chung, cla x= khukn nói riêng Tuy nhiên có ñi•m chung b€ sung glucose hodc saccharose • nCng đU 0,05%, sau ngày ni cHy, ho=t tính enzyme hju khơng có s bi2n đUng rõ ràng so v„i nuôi cHy môi trưAng không b€ sung Nhưng b€ sung • nCng đU 0,1% glucose, • chlng tuy•n ch n có ho=t tính enzyme cao h“n so v„i nuôi môi trưAng không b€ sung tăng khơng đáng k•, t’ 0,148 ljn (chlng C6) ñ2n 0,962 ljn (chlng C2) Khi b€ sung saccharose, đa s" chlng x= khukn tuy•n ch n thích hbp nCng đU b€ sung 0,1%, làm ho=t tính enzyme tăng t’ 0,435 ljn (chlng C7) ñ2n 1,074 ljn (chlng C6) Chlng C2 thích hbp v„i b€ sung saccharose 1,5% làm tăng ho=t tính enzyme 1,684 ljn so v„i mơi trưAng khơng b€ sung Chlng thương m=i thích hbp b" sung 0,5% saccharose, ho=t tính enzyme tăng so v„i môi trưAng không b€ sung 1,102 ljn 60 Thí nghi m ti2p tNc ti2n hành kh\o sát ho=t tính enzyme cellulase t"c đU sinh trư•ng cla chlng x= khukn phát tri•n ưu th2 nhHt mơi trưAng có b€ sung glucose 1% MNc đích thí nghi m: xác đEnh \nh hư•ng cla vi c b€ sung đưAng glucose 1% vào mơi trưAng ni cHy đ2n sinh trư•ng ho=t tính cla enzyme theo thAi gian ni cHy Chlng C2 chlng có ho=t tính enzyme bi2n đUng cao nhHt mơi trưAng ni cHy nên đưbc ch n đ• kh\o sát K2t qu\ đưbc ghi nh9n • b\ng 3.8 B\ng 3.8: ~nh hư•ng cla thAi gian ni cHy v„i t{ l b€ sung glucose 1% ñ2n ho=t tính enzyme cellulase cla chlng x= khukn C2 T{ l ThAi gian T"c đU sinh trư•ng sau Ho=t tính glucose b€ nuôi cHy (ngày) ngày (ljn) enzyme cellulase sung (%) 0,1 (IU/ml) 0,987 0,042 1,170 0,089 1,168 0,083 1,152 0,074 11 1,149 0,075 2,913 0,056 3,509 0,155 3,887 0,231 3,925 0,279 11 3,872 0,267 K2t qu\ nghiên ceu cho thHy, 11 ngày kh\o sát, \nh hư•ng cla vi c b€ sung glucose 0,1% th• hi n mUt cách rõ r t đ2n sinh trư•ng sinh t€ng hbp enzyme cellulase cla chlng x= khukn C2 so v„i môi trưAng ch{ có CMC 61 Trong mơi trưAng khơng b€ sung glucose, sau ngày ni cHy, t"c đU sinh trư•ng tăng 0,185 ljn, ho=t tính enzyme tăng 1,119 ljn so v„i ngày trư„c đ=t k2t qu\ cao nhHt T"c đU sinh trư•ng ho=t tính enzyme l=i gi\m djn ñ2n ngày the 11 mdc dju t"c đU gi\m rHt thHp • mơi trưAng có b€ sung glucose 0,1%, t=i ngày the 5, t"c đU sinh trư•ng tăng 0,205 ljn ho=t tính enzyme tăng 1,768 ljn so v„i ngày trư„c T=i ngày nuôi cHy, t"c đU sinh trư•ng tăng 0,108 ljn, ho=t tính enzyme tăng 0,490 ljn so v„i ngày the T’ ngày the 7, 9, 11 t"c đU sinh trư•ng bi2n đUng khơng rõ ràng, hju khơng tăng nga Ho=t tính enzyme cao nhHt vào ngày the 0,279 IU/ml Như v9y theo b€ sung glucose 0,1%, x= khukn s} dNng glucose đ• tăng sinh kh"i nên ho=t tính cla enzyme cellulase dEch ni chưa cao cho ñ2n ngày the Khi nguCn glucose c=n ki t, x= khukn chuy•n qua s} dNng cellulose v„i lưbng sinh kh"i l„n so v„i thAi đi•m mơi trưAng khơng b€ sung Do vào ngày the 9, ho=t tính cao nhHt mơi trưAng ni cHy có b€ sung glucose 0,1% 3.3 Đ7nh danh ch ng x! khu0n ưu th* D a vào khóa phân lo=i cla Bergey, chlng x= khukn ưu th2 chlng C2, C6, chúng bư„c ñju ñEnh danh chlng cN th• sau: Z Chlng C2: Actinoplanes philippinensis thu c chi Actinoplanes h& Actinoplanetes Khukn l=c màu xanh nâu, b_ mdt xù xì, mép khukn l=c b•ng ph“ng, cHu trúc khukn l=c d=ng rR, khukn ty chHt màu vàng ñNc, t=o sˆc t" nâu nâu mơi trưAng Túi sinh bào t} có d=ng cju ñ2n ovan, kích thư„c t’ – 25 ”m, bào t} cuUn xoˆn, hình cju 1Z 1,2”m NguCn dinh dư‰ng cacbon cellulose, saccharose, nhi t đU thích hbp 45 – 550C, pH = 5,0 – 6,0 Z Chlng C6: Thermomonospora fusca chi Thermomonospora fusca h& Thermomonospora 62 Khukn l=c màu vàng đNc, b_ mdt nh¢n, mép khukn l=c d=ng lCi cong, cHu trúc khukn l=c b•ng ph“ng Khukn ty chHt trˆng đNc Khukn l=c chuy•n màu thành vàng nh=t Khukn ty khí sinh mang bào t} thành đám, cNm Sinh trư•ng mơi trưAng cellulose, saccharose, lactose Nhi t đU mơi trưAng thích hbp 50 – 550C, pH= 7,0 – 8,0 63 PHwN IV KrT LU N VÀ KIrN NGH I Knt luLn T’ k2t qu\ thí nghi m trên, chúng tơi đưa mUt s" k2t lu9n sau: Đã phân l9p mô t\ đdc đi•m hình thái, khukn ty cla 12 chlng x= khukn chEu nhi t phân gi\i cellulose t’ ñ"ng l v‡ cà phê, rơm r=, mùn cưa ký hi u: C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12 D a vào ho=t tính enzym cellulase cla chlng x= khukn phân l9p ñã tuy•n ch n đưbc chlng x= khukn chEu nhi t có ho=t tính enzym cao chlng: C2, C3, C4, C6 C7 MUt s" y2u t" \nh hư•ng đ2n ho=t tính enzym cellulase cla chlng x= khukn tuy•n ch n sau: Z Nhi t ñU thích hbp ñ"i v„i chlng C2, C3, C4, C6, C7 : 450C – 500C Z pH thích hbp cho chlng: C2: 5,5 Z 6,0; C3: 5,5 – 7,5; C4: 5,5 – 6,5; C6: 7,0 – 8,0; C7: 6,5 – 8,0 Z B€ sung glucose 0,05% hodc saccharose 0,05 % vào mơi trưAng ni cHy khơng có \nh hư•ng rõ r t đ"i v„i ho=t tính enzyme cellulase so v„i không b€ sung Z Đa s" chlng tuy•n ch n thích hbp v„i nCng đU saccharose 0,1 % b€ sung , riêng chlng C2 thích hbp v„i vi c b€ sung 0,15% Z Đ"i v„i chlng C2, mơi trưAng khơng b€ sung đưAng , ho=t tính enzyme cellulase cao nhHt vào ngày the nuôi cHy, sau gi\m ch9m djn Z • nCng đU b€ sung 0,1% ho=t tímh enzyme cellulase cla chlng C2 cao nhHt vào ngày the 9; t"c đU sinh trư•ng tăng khơng đáng k• sau ngày ni cHy chlng x= khukn ưu th2 tuy•n ch n chlng C2, C6 đưbc đEnh danh theo khóa phân lo=i cla Bergey sau: Z Chlng C2: Actinoplanes philippinensis Z Chlng C6: Thermomonospora fusca 64 II Kinn nghD Ti2p tNc phân l9p tuy•n ch n chlng x= khukn chEu nhi t t nhiên • Đˆk Lăk ñ• b\o tCn nguCn gen vi sinh v9t ñEa phương Bư„c ñju th} nghi m s} dNng chlng x= khukn tuy•n ch n vào nguCn chHt ph2 th\i nông lâm nghi p chea nhi_u cellulose đ• ki•m tra kh\ hi u qu\ phân gi\i Nghiên ceu thu nh9n b\o qu\n enzyme cellulase t’ môi trưAng nuôi cHy chlng x= khukn tuy•n ch n 65 Ngưng d@n khoa h†c BMT, ngaỳ 12 tháng 01 năm 2011 Ngư