XÁC ĐỊNH đột BIẾN TRÊN EXON 2, 3 của GEN SRD5A2 gây BỆNH THIẾU hụt ENZYM 5α REDUCTASE TUÝP 2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI *** VŨ NGỌC MAI XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN TRÊN EXON 2, CỦA GEN SRD5A2 GÂY BỆNH THIẾU HỤT ENZYM 5α-REDUCTASE TUÝP KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA KHÓA 2015 - 2019 HÀ NỘI-2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI *** VŨ NGỌC MAI XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN TRÊN EXON 2, CỦA GEN SRD5A2 GÂY BỆNH THIẾU HỤT ENZYM 5α-REDUCTASE TUÝP Ngành đào tạo : Xét Nghiệm Y Học Mã ngành : 52720332 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA KHÓA 2015 - 2019 Người hướng dẫn khoa học: TS Trần Thị Chi Mai CN Lê Hồng Bích Nga HÀ NỘI-2019 LỜI CẢM ƠN Trong q trình học đại học, khóa luận tốt nghiệp dấu ấn quan trọng q trình học tập nghiên cứu trường Thời gian tiến hành làm khóa luận tốt nghiệp khoa Kỹ Thuật Y học- Trường Đại học Y Hà Nội vừa qua giúp em học hỏi nhiều điều, từ chuyên môn kiến thức tác phong làm việc từ Thầy cô, anh chị bạn bè khoa Trước tiên, em xin bày tỏ cảm ơn sâu sắc đến TS Trần Thị Chi Mai, Trưởng Khoa Kỹ Thuật Y học, Trưởng Bộ mơn Hóa Sinh lâm sàng, Trường Đại học Y Hà Nội, người Thầy hướng dẫn, tận tình giúp đỡ, ln đưa góp ý quý báu, sửa chữa tỉ mĩ lời khuyên hữu ích, tạo điều kiện giúp em hồn thiện khóa luận tốt nghiệp Em xin cảm ơn Ban Giám Hiệu, Phòng Quản lý Đào tạo Đại học, Trường Đại học Y Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi giúp em hồn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn sâu sắc CN Lê Hoàng Bích Nga, người trực tiếp hướng dẫn, bảo, chia sẻ cho em kỹ thuật kinh nghiệm, Thầy cô, anh khoa Kỹ Thuật Y học quan tâm, động viên em trình thực khóa luận Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè quan tâm, động viên, chia sẻ khó khăn với em suốt trình học tập Hà Nội, ngày 28 tháng năm 2019 Sinh viên VŨ NGỌC MAI Cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam Độc lập – Tự – Hạnh phúc **** -LỜI CAM ĐOAN Kính gửi: Phịng Quản lý Đào tạo Đại học – Trường Đại học Y Hà Nội Hội đồng chấm khóa luận tốt nghiệp Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi với giúp đỡ thầy cô Khoa Kỹ thuật Y học- Trường Đại học Y Hà Nội, tất số liệu khóa luận trung thực chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu khác Hà Nội, ngày 28 tháng năm 2019 Người viết khóa luận Vũ Ngọc Mai DANH MỤC VIẾT TẮT DNA Bp DSDs dNTP ddNTP EDTA OD PCR DHT SRD5A2 Deoxyribonucleic Acid Base pair Disorner of sex development Deoxyribonucleotid triphosphat Dideoxyribonucleotid triphosphat Ethylen diamine tetraacetic acid Optical Density (Độ hấp thụ quang) Polymerase Chain Reaction (Phản ứng khuếch đại chuỗi polymerase) Dihydrotestosteron Steroid 5-alpha-reductase MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ĐẶT VẤN ĐỀ Rối loạn phát triển giới tính (DSDs) nhóm rối loạn gặp với sinh lý bệnh đa dạng, thường xuất trẻ sơ sinh thiếu niên, định nghĩa bệnh lý bẩm sinh liên quan đến phát triển quan sinh dục, giới tính khơng điển hình [1] Tỷ lệ mắc bệnh DSDs chưa thống kê rõ ràng, trẻ sơ sinh có quan sinh dục ngồi khơng điển hình tình trạng gặp, báo cáo tỷ lệ 1: 4500 ca sinh [2] Bệnh thiếu hụt enzym 5α-reduacse tuýp bệnh điển hình nhóm bệnh 46, XY DSD, bệnh rối loạn phát triển giới tính Bệnh nhân thiếu hụt enzym 5α-reductase có kiểu hình bên ngồi gần nữ, sinh có phận sinh dục khơng rõ ràng với số triệu chứng dương vật nhỏ, tinh hồn ẩn, lỗ đái thấp, bìu chẻ đơi, nữ hóa Bệnh ảnh hưởng nghiêm trọng đến sống bệnh nhân gia đình người bệnh, phận sinh dục khơng rõ ràng nên khơng phân biệt giới tính nam hay nữ, gặp nhiều khó khăn việc chăm sóc ni dưỡng Do đó, phát bệnh sớm giúp đưa phương pháp điều trị can thiệp tốt Nguyên nhân gây bệnh thiếu hụt enzym 5α-reductase 2, enzym xúc tác phản ứng chuyển hormon sinh dục nam testosteron thành DHTdihydrotestosteron, phân tử có lực cao với thụ thể androgen DHT đóng vai trị quan trọng q trình hình thành phát triển phận sinh dục nam giới trình phát triển thai nhi Enzym 5α-reductase tuýp mã hóa gen SRD5A2 Nghiên cứu cho thấy, bất thường gen SRD5A2 làm thay đổi, giảm nồng độ hoạt tính enzym 5α-reductase 2, dẫn đến giảm hình thành DHT, gây nên xuất quan sinh dục khơng điển hình Chẩn đoán bệnh thiếu hụt enzym 5α-reductase tuýp ngồi đặc điểm lâm sàng, chẩn đoán dựa vào tỷ lệ Testosteron/ DHT trước sau làm test kích thích hCG Phương pháp thứ để chẩn đoán phát bệnh dựa kỹ thuật định lượng steroid niệu Bên cạnh đó, để khẳng định kết chẩn đoán, bệnh nhân nghi ngờ mắc bệnh thiếu hụt enzym 5αreductase tuýp cần tiến hành phân tích đột biến gen SRD5A2 Ở Việt Nam, bước đầu có nghiên cứu phát bệnh Bệnh viện Nhi Trung Ương, nhiên chưa có nghiên cứu xây dựng quy trình xác định đột biến gen SRD5A2 gây bệnh thiếu hụt enzym 5αreductase tuýp Vì vậy, đề tài “Xác định đột biến exon 2, gen SRD5A2 gây bệnh thiếu hụt enzym 5α-reductase tuýp 2” thực với mục tiêu: “Phát đột biến exon 2, gen SRD5A2 bệnh nhân bị thiếu hụt enzym 5α-reductase tuýp 2” CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Bệnh thiếu hụt enzym 5α-reductase tuýp 1.1.1 Nhóm bệnh DSDs DSDs có tên đầy đủ Disorder of sex development (DSDs), nhóm bệnh liên quan đến rối loạn phân biệt giới tính hay khác biệt giới, mơ tả tình trạng bệnh lý bẩm sinh liên quan đến phát triển quan sinh dục hay giới tính khơng điển hình [1] Đặc điểm lâm sàng bệnh nhân mắc bệnh thuộc nhóm DSDs khác Tuy nhiên, nhìn chung, trẻ nghi ngờ mắc bệnh DSDs thường có số đặc điểm lâm sàng như: trẻ sơ sinh có phận sinh dục nữ với âm hộ mở rộng phận sinh dục nam với tinh hồn hai bên, kích thước dương vật nhỏ, lỗ niệu đạo thấp, có bất đồng phận sinh dục nhiễm sắc thể trước sinh Ở tuổi dậy thì, bệnh nhân thường dậy muộn khơng dậy thì, vơ kinh nguyên phát hay có nữ hóa, phát triển tuyến vú nam [2] Một bệnh DSDs phổ biến bệnh tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh (CAH), nghiên cứu nhiều Việt Nam Trong đó, thiếu hụt enzym 21-hydroxylase chiếm 90% trường hợp bệnh nhân mắc bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh [3] Bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể số 6, đột biến gen CYP21A2 gây ra, làm rối loạn trình sinh tổng hợp hormon tuyến vỏ thượng thận, gây bệnh nam hóa trẻ gái, dậy sớm trẻ trai Bên cạnh bệnh tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh, bệnh thiếu hụt enzym 5α-reductase tuýp bệnh thường gặp 10 nhóm bệnh DSDs Bệnh di truyền lặn, đột biến gen SRD5A2 nhiễm sắc thể số gây ra, làm giảm phần hoàn tồn hoạt tính enzym 5α-reductase 2, gây nên xuất quan sinh dục khơng điển hình Năm 2006, nhóm chuyên gia tài trợ Hiệp hội Nội tiết Nhi khoa châu Âu (ESPE) Hiệp hội Nội tiết Nhi Lawson Wilkins (LWPES) đề xuất phân loại cho DSDs Theo đó, rối loạn chia nhỏ thành: • 46, XY DSD gồm rối loạn liên quan đến tuyến sinh dục phát triển tinh hoàn hay suy yếu tổng hợp tác động androgen • 46, XX DSD gồm rối loạn liên quan đến tuyến sinh dục phát triển buồng trứng dư thừa androgen • DSD bất thường nhiễm sắc thể giới tính [2] Theo phân lại này, bệnh thiếu hụt enzym 5α-reductase tuýp thuộc nhóm bệnh 46, XY DSD bao gồm rối loạn tuyến sinh dục phát triển tinh hoàn hay suy yếu tổng hợp tác động androgen 1.1.2 Bệnh thiếu hụt enzym 5α-reductase tuýp Năm 1974, lần đặc điểm lâm sàng hóa sinh mô tả bệnh thiếu hụt enzym 5α-reductase tuýp 2, nghiên cứu thực 24 đối tượng bị ảnh hưởng từ 13 gia đình lớn Dominican hai anh em đến từ Dallas Sau đó, trường hợp New Guinea Thổ Nhĩ Kỳ mơ tả nhiều trường hợp khác tồn giới [4] Thiếu hụt enzym 5α-reductase tuýp hai nguyên nhân thường gặp gây rối loạn phát triển giới tính nam giới, thuộc nhóm bệnh 46, XY DSD cần chẩn đoán sớm Bệnh thiếu hụt enzym 5αreductase tuýp 2, enzym tham gia vào q trình chuyển hố hormon sinh dục, cụ thể testosteron Sự thiếu hụt enzym gây xuất 32 CHƯƠNG KẾT QUẢ 3.1 Kết tách chiết DNA Các mẫu DNA tách chiết từ máu ngoại vi bệnh nhân theo kit QIAGEN Sau tách chiết, mẫu DNA kiểm tra nồng độ độ tinh phương pháp đo mật độ quang học máy NanoDrop One Hình Minh họa kết đo mật độ quang học máy NanoDrop One mẫu SRD5A2-01 sau tách chiết Nhận xét: Từ hình cho thấy: Mẫu DNA SRD5A2- 01 tách chiết có nồng độ 52,1 ng/µl tỷ số A260/A280 1.82 (nằm khoảng 1,8-2,0), tỷ số A260/A230 2,05 (>2), đồ thị biểu diễn độ hấp thụ quang có hình parabol, khơng gãy khúc, đỉnh hấp thụ cực đại tương ứng với bước sóng 260 nm Vì vậy, mẫu DNA thu đạt chuẩn nồng độ độ tinh 33 Bảng Kết đo nồng độ độ tinh mẫu DNA Mã số bệnh nhân Nồng độ DNA (ng/µl) SRA5A2- 01 SRD5A2- 02 SRD5A2- 03 52,1 80,5 93.1 Độ tinh DNA (A260/A280) / (A260/A230) 1,82/ 2,05 1,84 / 2,38 1,89 / 2,45 Nhận xét: Từ Bảng 3.1 cho thấy: - Các mẫu DNA tách chiết đạt nồng độ 50 ng/µl Các tỷ số A260/A280 nằm khoảng 1,8-2,0 tỷ số A260/A230 lớn Như vậy, mẫu DNA tách chiết đảm bảo đạt tiêu chuẩn nồng độ độ tinh để thực hiên cho phản ứng PCR 3.2 Kết khuếch đại exon 2, gen SRD5A2 Sau tách chiết kiểm tra nồng độ, độ tinh DNA bước khuếch đại exon 2, gen SRD5A2 Sau đó, sản phẩm PCR điện di gel argarose 1,5%, ngâm gel dung dịch Ethidium bromide soi gel đèn tử ngoại (UV) Kết thu sau: MK (-) E2 (-)E3 E2 E3 E2 E3 E2 E3 34 SRD5A2-01 SRD5A2-02 SRD5A2-03 Hình Kết điện di sản phẩm PCR khuếch đại exon 2, bệnh nhân SRD5A2-01, SRD5A2-02, SRD5A2-03 Chú thích: - MK: Maker 100 bp (-) E2: Chứng âm exon (-) E3: Chứng âm exon Nhận xét: Các mẫu DNA tạo thành băng nhất, tương đối rõ nét , khơng có băng phụ, kích thước exon khoảng 338bp exon khoảng 350bp so với thang DNA chuẩn Từ kết điện di trên, cho thấy sản phẩm PCR thu đặc hiệu, sử dụng cho kỹ thuật giải trình tự gen SRD5A2 3.3 Kết giải trình tự exon 2,3 gen SRD5A2 Sản phẩm PCR sau điện di đem giải trình tự gen máy tự động Sau đó, kết giải trình tự so sánh với trình tự chuẩn NM_00348 ngân hàng Genbank Sau so sánh, thu kết sau: 35 Hình 3 Minh họa kết giải trình tự exon bệnh nhân SRD5A2-01 36 Hình Minh họa kết giải trình tự exon bệnh nhân SRD5A2-01 Nhận xét: Từ Hình 3.3 Hình 3.4 cho thấy: Kết giải trình tự cho tín hiệu rõ ràng, tín hiệu thấp, bị nhiễu Nghiên cứu khơng phát biến đổi exon 2, gen SRD5A2 nhóm mẫu bệnh nhân 37 CHƯƠNG BÀN LUẬN 4.1 Kết tách chiết DNA Trong năm gần đây, sinh học phân tử có bước phát triển vượt bậc với nhiều thành tựu to lớn ứng dụng rộng rãi vào lĩnh vực đời sống, đặc biệt lĩnh vực y học Các kỹ thuật sinh học phân tử giúp cho việc chẩn đốn điều trị bệnh nhanh, xác góp phần đáp ứng nhiệm vụ chăm sóc, bảo vệ sức khỏe người đạt hiệu Nhóm nghiên cứu tiến hành xác định đột biến gen SRD5A2 gây bệnh thiếu hụt enzym 5α-reductase tuýp Nhóm nghiên cứu sử dụng phương pháp giải trình tự gen máy tự động để xác định đột biến Gen SRD5A2 gồm exon, nhiên khuôn khổ nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu tiến hành exon 2, gen Bước quy trình nghiên cứu thu thập mẫu tách chiết DNA Khi tách chiết DNA cần phải đảm bảo DNA trạng thái nguyện vẹn tối đa, không bị phân hủy tác nhân học, hóa học tác nhân sinh học số enzym nội bào, ngoại bào DNA tách chiết từ nhiều tế bào có nhân thể với nhiều phương pháp khác Chất lượng DNA có ảnh hưởng trực tiếp đến phản ứng PCR kỹ thuật sinh học phân tử Do đó, tách chiết DNA bước bước quan trọng để đảm bảo cho bước quy trình nghiên cứu Tùy vào mục đích nghiên cứu mà người ta sử dụng kỹ thuật tách chiết DNA cho phù hợp, nghiên cứu này, sử dụng phương pháp tách chiết DNA từ máu ngoại vi theo kit QIAGEN, cụ thể từ tế bào bạch cầu có lượng lớn DNA Đây kit thương mại hóa, thẩm định để tách chiết DNA mẫu bệnh nhân Ưu điểm phương pháp dễ sử dụng, thực 38 đơn giản, dễ làm, tốn thời gian phương pháp PCI mà sản phẩm DNA thu đảm bảo nồng độ độ tinh Tuy nhiên, phương pháp số nhược điểm giá thành cao DNA tách chiết không cần đảm bảo số lượng mà đảm bảo độ tinh sạch, không bị đứt gãy, không nhiễm lẫ n tạp chất protein, lipid, glucid thành phần khác gây ức chế phản ứng PCR Nồng độ độ tinh DNA cao đảm bảo cho phản ứng PCR tốt, giúp cho hình ảnh giải trình tự rõ nét, không bị nhiễu, dễ dàng nhận định Do đó, tất mẫu DNA sau tách chiết cần kiểm tra nồng độ độ tinh Trong nghiên cứu này, sử dụng phương pháp đo mật độ quang học máy NanoDrop One bước sóng 260nm 280nm để kiểm tra nồng độ độ tinh DNA Phương pháp dựa khả hấp thụ ánh sáng khác chất có dung dịch Trong thành phần cấu tạo DNA có base purin pyrimidine hấp thụ ánh sáng tử ngoại đỉnh hấp thụ cực đại bước sóng 260nm Do đó, giá trị mật độ quang bước sóng 260nm cho phép xác định nồng độ DNA mẫu theo công thức: CDNA mạch đơi (ng/µl) = 50 x A260nm x n Trong đó: A260nm: độ hấp thụ dung dịch DNA bước sóng 260nm 50: hệ số chuyển đổi dung dịch có nồng độ DNA sợi đơi n: hệ số pha lỗng Ở bước sóng 280nm, protein có mức hấp thụ cao nhất, nhiên protein hấp thụ ánh sáng bước sóng 260nm DNA nên làm sai lệch giá trị thật DNA Do đó, tỷ số A260/A280 cho biết độ tinh mẫu tách chiết xem mẫu có lẫn nhiều hay tạp chất protein, tỷ lệ thường dao động khoảng 1,8-2,0 Ngồi ra, máy cịn tính tỷ lệ A 260/A230 cho 39 biết mẫu lẫn nhiều hay tạp chất carbonhydrat, EDTA… mẫu coi tỷ lệ lớn Sau tách chiết, mẫu DNA bảo quản 4°C sử dụng thời gian ngắn -20 °C sử dụng thời gian dài Từ số liệu Bảng 3.1 thông số nồng độ độ tinh cho biết: Tất mẫu DNA đảm bảo nồng độ để thực phản ứng PCR đạt hiệu tốt Tất số A260/A280 nằm khoảng 1,8-2,0 A260/A230 lớn cho thấy mẫu DNA tách chiết sạch, đảm bảo cho phản ứng PCR thực 4.2 Kết khuếch đại exon 2, gen SRD5A2 Sau kiểm tra nồng độ độ tinh DNA tách chiết phương pháp đo mật độ quang, tất DNA đảm bảo cho phản ứng PCR (trình bày Bảng 3.1), bước nghiên cứu khuếch đại exon 2, gen SRD5A2 với cặp mồi đặc hiệu kỹ thuật PCR đơn mồi Kết phản ứng PCR phụ thuộc vào nhiều yếu tố chất lượng nồng độ DNA khuôn, nồng độ thiết kế mồi, dung dịch đệm, nồng độ nucleiotid tự do, enzym Taq polymerase chu trình nhiệt phản ứng Đối với phản ứng PCR, cần sai sót nhỏ dẫn đến phản ứng không thành công Về thành phần phản ứng, thành phần tham gia phản ứng PCR bao gồm: DNA khuôn, dung dịch Master Mix, mồi xuôi, mồi ngược nước PCR Chất lượng DNA đảm bảo nồng độ độ tinh giúp cho phản ứng PCR đạt hiệu suất cao thông qua phương pháp đo mật độ quang học (trình bày Bảng 3.1) Mồi thiết kế trình tự theo nghiên cứu sử dụng 40 thành công sử dụng theo hướng dẫn nhà sản xuất Sau nhận mồi từ nhà sản xuất, tối ưu nồng độ mồi cách tiến hành pha lỗng mồi với nồng độ khác nhau, sau tiến hành mix phản ứng PCR với nồng độ pha loãng thành phần khác phản ứng giữ nguyên Tiến hành điện di sản phẩm PCR tương ứng với nồng độ mồi, dựa vào kết điện di, chọn nồng độ mồi tối ưu pmol/µl Nước PCR sử dụng nước cất khử ion, khơng có chứa DNAase, RNAase, enzym cắt giới hạn, khơng có thành phần gây ức chết phản ứng PCR Trong nghiên cứu này, sử dụng One Taq Hot Start 2X Master Mix with GC Buffer với thành phần bao gồm enzym Taq polymerase, nucleotid tự với nồng độ thích hợp dung dịch đệm với pH phù hợp giúp rút ngắn thời gian phản ứng, thực nhiều thao tác thủ công để phản ứng PCR diễn tốt Để phản ứng PCR đạt hiệu suất cao chu trình nhiệt phản ứng phù hợp vô quan trọng Chu trình nhiệt phản ứng PCR gồm giai đoạn: (1) giai đoạn biến tính, (2) giai đoạn gắn mồi, (3) giai đoạn kéo dài chuỗi Giai đoạn biến tính giai đoạn chuỗi xoắn kép DNA khn bị biến tính, tách khỏi thành hai mạch đơn, thường khoảng 90-95 °C Giai đoạn gắn mồi giai đoạn nhiệt độ gắn mồi hạ xuống thích hợp cho phép đoạn mồi gắn với DNA sợi khuôn, thường khoảng 55-65 °C Giai đoạn kéo dài giai đoạn nhiệt độ nâng lên đến nhiệt độ tối ưu enzym Taq polymerase xúc tác cho trình kéo dài chuỗi, thường 72 °C Nhiệt độ giai đoạn biến tính kéo dài có biến đổi khơng phụ thuộc vào kích thước đoạn gen đoạn mồi sử dụng với mức nhiệt chung thường 95°C (giai đoạn biến tính) 72°C (giai đoạn kéo dài) Còn nhiệt độ gắn mồi phụ thuộc vào kích thước trình tự đoạn mồi sử dụng cần tính tốn, chuẩn nhiệt độ phù hợp với trình tự mồi khác Trong nghiên 41 cứu này, chọn nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho exon 2, gen SRD5A2 57 °C, nhiệt độ kéo dài 68 °C enzym Taq polymerase sử dụng kit hóa chất khuyến cáo hoạt động tối ưu 68 °C Sau lựa chọn thành phần chu trình nhiệt tối ưu cho phản ứng PCR xong, tiến hành khuếch đại exon 2, gen SRD5A2 ba mẫu bệnh nhân (trình bày Bảng 2.2 2.3) Phản ứng PCR có độ nhạy cao, đó, cần tiến hành mix phản ứng PCR tủ an tồn sinh học, dụng cụ cần đảm bảo hóa chất cần đảm bảo không nhiễm tạp chất Để kiểm tra kết phản ứng PCR, tất sản phẩm PCR điện di kiểm tra gel agarose 1,5% Phản ứng PCR đạt hiệu hình ảnh điện di có băng DNA nhất, sáng rõ nét, tương ứng với kích thước mong muốn, khơng có băng phụ, khơng có tượng nhiễu, đứt đoạn Sau tiến hành phản ứng, kết nghiên cứu (Hình 3.2) cho thấy băng kích thước vị trí exon 338bp exon 350bp, hình ảnh rõ nét, khơng có tín hiệu nhiễu, chứng tỏ cặp mồi sử dụng đặc hiệu, thành phần chu trình nhiệt tối ưu, giúp phản ứng PCR đạt hiệu cao 4.3 Kết giải trình tự exon 2, gen SRD5A2 Hiện nay, lĩnh vực sinh học nói chung sinh học phân tử nói riêng giải trình tự gen kỹ thuật quan trọng Giải trình tự gen nhu cầu tất yếu xu phát triển nghiên cứu ứng dụng sinh học phân tử định danh, định type virus, sản xuất vacxin… khơng thể khơng kể đến xác định đột biến gen Phương pháp giải trình tự gen giúp việc xác định đột biến gen SRD5A2 trở nên dễ dàng độ xác cao Năm 1977, F Sanger cộng phát minh kỹ thuật giải trình tự gen phương pháp enzym, sở phương pháp người ta phát triển máy giải trình tự gen tự động Trong nghiên cứu này, sử dụng phương 42 pháp giải trình tự gen máy tự động để xác định trình tự nucleotid exon 2, gen SRD5A2 Để kết giải trình tự xác, độ tin cậy cao cần đảm bảo kỹ thuật điều kiện phản ứng diễn tốt Giải trình tự gen máy tự động hạn chế thao tác thủ cơng, cho kết xác Kỹ thuật sử dụng đoạn mồi tương ứng với exon dùng phản ứng PCR trước Tuy nhiên, yếu tố định kết giải trình tự phải kể đến sản phẩm PCR Trong nghiên cứu, chúng tơi chuẩn hóa quy trình kỹ thuật, dụng cụ, hóa chất để phản ứng PCR diễn tối ưu nhất, trước tiến hành giải trình tự chúng tơi kiểm tra sản phẩm PCR với hình ảnh băng điện di rõ nét, không bị đứt gãy, không bị có vạch phụ đảm bảo tiến hành giải trình tự (Hình 3.2) Từ đó, kết giải trình tự thu hình ảnh rõ nét, tín hiệu thấp, khơng bị nhiễu, đọc phân tích kết rõ ràng, xác Sản phẩm PCR sau kiểm tra đem tiến hành giải trình tự máy tự động phân tích phần mềm máy tính Sau giải trình tự, chúng tơi tiến hành đọc phân tích kết với exon 2, bệnh nhân, không phát biến đổi nằm exon 2, gen SRD5A2 bệnh nhân nghiên cứu Tuy nhiên, nghiên cứu khác tiến hành với bệnh nhân nghiên cứu exon gen SRD5A2, phát đột biến nằm exon lại, đột biến tìm thấy trước chứng minh có liên quan đến bệnh thiếu hụt enzym 5α-reductase tuýp Trong khuôn khổ đề tài nghiên cứu, tiến hành exon 2, chưa thể phát đột biến gen SRD5A2, cịn có đột biến exon khác nên cần quan sát cụ thể toàn gen bệnh nhân so sánh, phân tích chẩn đốn kết phân tích gen với biểu lâm sàng Đến nay, 100 đột biến gen SRD5A2 mô tả giới [18] Các nghiên giới có tìm thấy đột biến exon nghiên cứu 43 diễn đại học Bang Campina, Brazil tiến hành hai chị em người Brazil chẩn đoán thiếu hụt enzym 5α-reductase tuýp phát đột biến p.Gln126Arg (c.379 G>A) exon Đột biến gây bất hoạt hoàn toàn hoạt động enzym 5α-reductase tế bào Nghiên cứu cho thấy, xác định đột biến gen SRD5A2 góp phần chẩn đoán thiếu hụt enzym 5αreductase tuýp gia đình [19] Mặc dù nghiên cứu chúng tơi chọn lựa bệnh nhân có chẩn đốn đặc điểm lâm sàng cận lâm sàng bệnh rõ ràng, tối ưu tất quy trình, nhiên không phát đột biến exon gen SRD5A2 số bệnh nhân nghiên cứu Một nghiên cứu bệnh nhân người Ý có nhiễm sắc thể 46, XY với phận sinh dục ngồi chủ yếu nữ, xác định đột biến sai nghĩa, đột biến vơ nghĩa đa hình xác định Bốn bệnh nhân có đột biến đồng hợp tử, đột biến nằm exon (Cys133Gly), exon (Gly196Ser Ala207Asp) exon (Tyr235Phe) Một bệnh nhân mang đột biến dị hợp tử vô nghĩa nằm exon (Trp53X) thay đổi exon (Tyr235Phe) Nghiên cứa đột biến gen SRD5A2 gây ảnh hưởng bệnh nhân thiếu hụt enzym 5α-reductase tuýp [20] Sau thực tất quy trình, chúng tơi nhận thấy xác định đột biến gen SRD5A2 theo quy trình xây dựng Trong khn khổ khóa luận tốt nghiệp, với cỡ mẫu nhỏ tiến hành nghiên cứu bệnh nhân, số lượng exon nghiên cứu chưa đủ nghiên cứu tổng số exon gen SRD5A2 nên chưa thể khẳng định tỷ lệ phát đột biến SRD5A2 nghiên cứu chuyên sâu ảnh hưởng đột biến đến cấu trúc chức phân tử protein Do vậy, cần có nghiên cứu mở rộng cỡ mẫu số lượng exon (5 exon) để đưa thống kê danh sách tỉ lệ đột biến quần thể người Việt Nam, kết luận mối liên quan đột biến gen SRD5A2 bệnh thiếu hụt enzym 5α-reductase tuýp Từ sở đó, bác sỹ lâm sàng đưa 44 phương pháp điều trị sớm, chăm sóc hiệu gia đình bệnh nhân thiếu hụt enzym 5α-reductase tuýp KẾT LUẬN Căn vào kết phân tích phía trên, chúng tơi đưa kết luận sau: • Xây dựng quy trình xác định đột biến gen SRD5A2 bệnh nhân thiếu hụt enzym 5α-reductase tuýp Nghiên cứu không phát biến đổi exon 2, gen SRD5A2 TÀI LIỆU THAM KHẢO Kim KS, Kim J (2012) Disorner of sex development Korean J Uron, 53(1), 1-8 Hughes IA, Houk C, Ahmed SF cộng (2006) Consensus statement on management of intersex disorders Arch Dis Child, 91, 554– 563 New MI, Lekarev O, Parsa A, Yuen T, O’Malley B Genetic Steroid Disorders Yuan-Shan Zhua, Guang-Huan Sun (2005) 5α-Reductase Isozymes in the Prostate Author manuscript, 25(1), 1-12 Zhu, Y, Imperato-McGinley, J, Glob (2008) Male Sexual Differentiation Disorder and 5α-Reductase-2 Deficiency The Global Library of Women s Medicine, 3-4 Costa EMF, Domenice S, Sircili MH cộng (2012) DSD Due to alpha-Reductase Deficiency - from Diagnosis to Long Term Outcome Seminars in Reproductive Medicine, 30, 427-431 Hay ID, Wass JA (2009) Clinical Endocrine Oncology, 2, 37 Jean D Wilson, Geoffrey Shaw cộng (2002) The marsupial model for male phenotypic development Trends in Endocrinology & Metabolism, 13, 79-80 SRD5A2 gene, https://ghr.nlm.nih.gov/gene/SRD5A2 10 Normington K, Russell DW (1992) Tissue distribution and kinetic characteristics of rat steroid alpha-reductase isozymes Evidence for distinct physiological functions J Biol Chem, 267, 903-904 11 Leonard S Marks, MD (2004) 5α-Reductase: History and Clinical Importance Review in Urology, 6(9), 11-21 12 Song YN, Fan LJ, Zhao X cộng (2019) Clinical phenotype and gene analysis of 86 cases of alpha reductase deficiency Wanfang Med Oniline, 57(2), 13 Angel On Kei Chan, Betty Wai Man But, Ching Yin Lee cộng (2013) Diagnosis of 5α-Reductase Deficiency: Is Measurement of Dihydrotestosterone Essential? Clinical Chemistry, 59(5), 14 Tạ Thành Văn (2010) PCR số kỹ thuật y sinh học phân tử, Nhà xuất Y học Hà Nội 15 Sanger F cộng (1977) DNA sequencing with chain-terminating inhibitors Proc Natl Acad Sci U S A, 74(12), 3-7 16 Chidgeavadze Z.G, Beabealashvilli R.S, Atrazhev A.M et al (1984) 2',3'Dideoxy-3' aminonucleoside 5'-triphosphates are the terminators of DNA synthesis catalyzed by DNA polymerases Nucleic Acids Res, 12(3), 1671–1686 17 Heather J.M, Chain B (2016) The sequence of sequencers: The history of sequencing DNA Genomics, 107(1), 1-8 18 Cơ sở liệu đột biến gen người, http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php 19 Leme de Calais FL, SoardiFC, Petroli RJ cộng (2011) Molecular diagnosis of α-reductase type II deficiency in Brazilian siblings with 46, XY disorder of sex development International Journal of Molecular Sciences, 12(12), 1-2 20 Baldiontti F, Majore S, Fogli A cộng (2007) Molecular characterizatoin of unrelated Italian patients with 5-alpha-reductace type deficiency Journal of Andronogy, 29(1), 3-6 ... (-) E2 (-)E3 E2 E3 E2 E3 E2 E3 34 SRD5A2- 01 SRD5A2- 02 SRD5A2- 03 Hình Kết điện di sản phẩm PCR khuếch đại exon 2, bệnh nhân SRD5A2- 01, SRD5A2- 02, SRD5A2- 03 Chú thích: - MK: Maker 100 bp (-) E2:... gen SRD5A2 gây bệnh thiếu hụt enzym 5α- reductase tuýp 2? ?? thực với mục tiêu: “Phát đột biến exon 2, gen SRD5A2 bệnh nhân bị thiếu hụt enzym 5α- reductase tuýp 2? ?? 9 CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Bệnh thiếu. .. XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN TRÊN EXON 2, CỦA GEN SRD5A2 GÂY BỆNH THIẾU HỤT ENZYM 5α- REDUCTASE TUÝP Ngành đào tạo : Xét Nghiệm Y Học Mã ngành : 527 2 033 2 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA KHÓA 20 15 - 20 19