XÁC ĐỊNH đột BIẾN KHÁNG THUỐC LIÊN QUAN đến đột BIẾN ở BỆNH NHÂN VIÊM GAN b mạn tại BỆNH VIỆN BỆNH NHIỆT đới TRUNG ƯƠNG từ THÁNG 1 năm 2014 đến THÁNG 12 năm 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI TRỊNH THỊ HẰNG XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN KHÁNG THUỐC LIÊN QUAN ĐẾN ĐỘT BIẾN Ở BỆNH NHÂN VIÊM GAN B MẠN TẠI BỆNH VIỆN BỆNH NHIỆT ĐỚI TRUNG ƯƠNG TỪ THÁNG NĂM 2014 ĐẾN THÁNG 12 NĂM 2017 LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC HÀ NỘI, 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI TRỊNH THỊ HẰNG XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN KHÁNG THUỐC LIÊN QUAN ĐẾN ĐỘT BIẾN Ở BỆNH NHÂN VIÊM GAN B MẠN TẠI BỆNH VIỆN BỆNH NHIỆT ĐỚI TRUNG ƯƠNG TỪ THÁNG NĂM 2014 ĐẾN THÁNG 12 NĂM 2017 Chuyên ngành: Vi sinh y học Mã số : 60720115 LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC Hướng dẫn khoa học: 1.PGS.TS Nguyễn Vũ Trung 2.TS Lê Văn Duyệt HÀ NỘI, 2019 LỜI CẢM ƠN Trong q trình học tập làm luận văn, tơi nhận quan tâm, giúp đỡ nhiều nhà trường, quan, gia đình bạn bè Tơi xin chân thành cảm ơn: - Ban Giám hiệu, Bộ mơn Vi sinh, Phịng Đào tạo sau Đại học Trường Đại học Y Hà Nội - Labo xét nghiệm Trung tâm Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới Trung Ương - Khoa Khám bệnh Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới Trung Ương Đã tạo điều kiện thuận lợi cho trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn tốt nghiệp Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, xin chân thành cảm ơn: - PGS TS Nguyễn Vũ Trung, người Thầy ln tận tình bảo, hướng dẫn tơi q trình học tập hoàn thành luận văn - TS Lê Văn Duyệt, người Thầy trực tiếp hướng dẫn thực nghiên cứu Cảm ơn Thầy tận tình dẫn truyền đạt cho kiến thức kinh nghiệm trình làm khoa học - PGS.TS Vũ Tường Vân, TS Phạm Hồng Nhung… Thầy Hội đồng chấm Luận văn đóng góp nhiều ý kiến quý báu để tơi hồn thành Luận văn Cuối tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè dành quan tâm, động viên, giúp đỡ tơi suốt q trình học tập Hà Nội, ngày 18 tháng năm 2019 Trịnh Thị Hằng LỜI CAM ĐOAN Tôi Trịnh Thị Hằng, học viên cao học khóa 25, chuyên ngành Vi sinh vật, Trường Đại học Y Hà Nội xin cam đoan: Đây luận văn thân trực tiếp thực hướng dẫn Thầy PGS-TS Nguyễn Vũ Trung TS Lê Văn Duyệt Cơng trình không trùng lặp với nghiên cứu khác công bố Việt Nam Các số liệu thơng tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan, xác nhận chấp nhận sở nơi nghiên cứu cho phép lấy số liệu Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm cam kết Hà Nội, ngày 18 tháng năm 2019 Người viết cam đoan Trịnh Thị Hằng DANH MỤC VIẾT TẮT ADV Adefovir ALT Amino alanin transferase AntiHBc Kháng thể kháng kháng nguyên lõi vi rút viêm gan B AntiHBe Kháng thể kháng kháng nguyên e vi rút viêm gan B AntiHBs Kháng thể kháng kháng nguyên bề mặt vi rút viêm gan B AST Alanin Amino Transferase DNA Axit deoxyribonucleic ETV Entercavir EMT Emtricitabine GGT Gamma Glutamyl transferase HBcAg Kháng nguyên lõi vi rút viêm gan B HBeAg Kháng nguyên e vi rút viêm gan B HBsAg Kháng nguyên bề mặt vi rút viêm gan B HBV Hepatitis B virus HCV Hepatitis C virus HDV Hepatitis D virus HIV Virus gây suy giảm miễn dịch mắc phải người LAM Lamivudine LdT Telbivudine NUCs Các thuốc điều trị vi rút viêm gan B loại đồng phân nucleosides Pg RNA RNA trung gian RT Reverse Transcriptase TDF Tenofovir TP Terminal protein WHO Tổ chức Y tế Thế giới MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ .12 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Dịch tễ học 1.1.1 Tình hình nhiễm HBV giới 1.1.2 Tình hình nhiễm HBVở Việt Nam 1.2 Đặc điểm vi rút viêm gan B 1.2.1 Cấu trúc vi rút 1.2.2 Cấu trúc gen HBV 1.2.3 Hepatitis B Polymerase Protein 1.2.4 Quá trình nhân lên HBV 1.2.5 Phân loại HBV theo genotype 1.2.6 Mối liên quan genotype HBV hiệu điều trị thuốc kháng vi rút Nucleosides .11 1.3 Các marker huyết HBV ý nghĩa .11 1.4 Chẩn đoán viêm gan vi rút B mạn .12 1.5 Điều trị viêm gan B mạn tính 12 1.5.1 Chỉ định điều trị 12 1.5.2 Các thuốc điều trị 13 1.5.3 Theo dõi điều trị 15 1.5.4 Đánh giá thất bại điều trị .15 1.6 Tình trạng kháng thuốc .16 1.6.1 Quản lý kháng thuốc kháng vi rút HBV 16 1.6.2 Cơ chế kháng thuốc kháng vi rút HBV 16 1.6.3 Tỷ lệ kháng thuốc 19 1.6.4 Hậu kháng thuốc .20 1.6.5 Phân loại kháng thuốc 21 1.7 Các kỹ thuật xét nghiệm sử dụng xác định đột biến kháng thuốc HBV 23 1.7.1 Realtime PCR 23 1.7.2 Giải trình tự gen 24 1.8 Một số nghiên cứu đột biến kháng thuốc điều trị viêm gan B mạn tính Việt Nam 25 1.9 Tình hình bệnh nhân đến khám điều trị viêm gan B mạn tính bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới Trung Ương .26 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Đối tượng nghiên cứu 28 2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu .28 2.3 Phương pháp nghiên cứu .28 2.3.1 Thiết kế nghiên kế 28 2.3.2 Phương pháp chọn mẫu 28 2.3.3 Các biến số, số nghiên cứu 29 2.3.4 Quy trình thực nghiên cứu 32 2.3.5 Phương pháp thu thập thông tin 33 2.4 Các kỹ thuật xét nghiệm sử dụng nghiên cứu 33 2.4.1 Kỹ thuật đo tải lượng HBV 33 2.4.2 Kỹ thuật xác định đột biến kháng thuốc .33 2.5 Nhập xử lý số liệu 34 2.6 Đạo đức nghiên cứu 34 2.7 Hạn chế đề tài .35 CHƯƠNG 3; KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 36 3.1 Đột biến kháng thuốc HBV bệnh nhân nhiễm VGB mạn tính 36 3.1.1 Đặc điểm chung nhóm bệnh nhân 36 3.1.2 Kết xét nghiệm sinh hóa, miễn dịch chẩn đốn hình ảnh 40 3.1.3 Đặc điểm đột biến HBV 48 3.2 Các mối liên quan với đột biến kháng thuốc .53 3.2.1 Mối liên quan đột biến kháng thuốc với phác đồ điều trị .53 3.2.2 Mối liên quan đột biến kháng thuốc với thời gian điều trị 54 3.2.3 Mối liên quan kháng thuốc với mức độ xơ gan 55 3.2.4 Mối liên quan kháng thuốc với HBeAg 56 3.2.5 Mối liên quan đột biến kháng thuốc với tải lượng HBV 57 3.2.6 Mối liên quan đột biến kháng thuốc với kiểu gen HBV .58 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 59 4.1 Đột biến kháng thuốc HBV 59 4.2 Mối liên quan đột biến kháng thuốc HBV phác đồ điều trị, số yếu tố khác .71 4.2.1 Mối liên quan đột biến kháng thuốc HBV phác đồ điều trị 71 4.2.2 Mối liên quan đột biến kháng thuốc HBV thời gian điều trị 75 4.2.3 Mối liên quan đột biến kháng thuốc HBV tải lượng vi rút 76 KẾT LUẬN 77 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Phân bố địa lý HBV theo genotype subtype 10 Bảng 1.2 Tóm tắt dấu ấn huyết nhiễm HBV ý nghĩa .11 Bảng1.3 Tỷ lệ kháng thuốc kháng HBV theo năm bệnh nhân điều trị NUCs .20 Bảng 3.1 Thời gian điều trị trung bình bệnh nhân theo phác đồ điều trị 40 Bảng 3.2 Tỷ lệ mức độ AST/ ALT 40 Bảng 3.3 Tỷ lệ Bilirubin toàn phần 41 Bảng 3.4 Tỷ lệ bệnh nhân theo số AFP .41 Bảng 3.5 Tỷ lệ Prothrombin .42 Bảng 3.6 Tỷ lệ INR 43 Bảng 3.7 Các số công thức máu 43 Bảng 3.8 Tần số bệnh nhân nhiễm chủng HBV có mang đột biến kháng NUCs .48 Bảng 3.9 Tần số đột biến kháng đa thuốc HBV 51 Bảng 3.10 Phân bố dạng đột biến kháng thuốc HBV theo phác đồ điều trị .51 Bảng 3.11 Các thuốc NUCs bị kháng theo dạng kháng thuốc phác đồ điều trị .52 Bảng 3.12 Mối liên quan kháng thuốc với phác đồ điều trị 53 Bảng 3.13 Mối tương quan tình trạng đột biến kháng thuốc HBV phác đồ điều trị TDF 53 Bảng 3.14 Mối liên quan tình trạng đột biến kháng thuốc HBV với thời gian điều trị phác đồ ETV viên/ngày 54 Bảng 3.15 Mối liên quan dạng đột biến kháng thuốc HBV với thời gian điều trị phác đồ ETV viên/ngày .54 99 - HBeAg - HCV Ab - Định lượng AFP - HIV Ag/Ab test nhanh 6.5 XN sinh học phân tử HBV đo tải lượng: - Nồng độ virus huyết tương (IU/ml) - Nồng độ virus huyết tương (copies/ml) 6.6 Siêu âm ổ bụng 6.7 Fibroscan A/ Kết đánh giá độ nhiễm mỡ gan: S0 □ S1 □ S2 □ S3 □ S4 □ B/ Độ xơ hóa gan F0-F1 □ F2 □ 6.8 Dịch ổ bụng - Định lượng Protein - Định lượng Clo - Định lượng Glucose - AFB - Vi nấm nhuộm soi - Vi khuẩn nhuộm soi F3 □ F3-F4 □ Có □ Khơng □ F4 □ 100 6.9 XN xác định kháng thuốc HBV KT giải trình tự gen Tên thuốc Phiên giải Vị trí đột biến Tình trạng Lamivudine Adefovir Entecavir Tenofovir Telbivudin 6.10 Các xét nghiệm khác: - XQ phổi: Bình thường □ Bất thường □ Không làm □ Ngày xuất bất thường Nêu rõ hình ảnh bất thường XQ…………………………………… - Điện tâm đồ Bình thường □ Bất thường □ Khơng làm □ Ngày xuất bất thường Nêu rõ bất thường ……………………………………………………… - MRI (nếu có) Bình thường □ Bất thường □ Khơng làm □ Ngày xuất bất thường Nêu rõ bất thường ……………………………………………………… -XN Nước tiểu Viết tắt 101 IV Điều trị Phác đồ điều trị Thời gian Đáp ứng Thất bại Di chứng Tử vong V Chẩn đoán lúc xuất viện/tử vong: (khoanh trịn vào chẩn đốn thích hợp) (ghi rõ): ………………………………………………………… Ngày tháng năm Người làm bệnh án PHỤ LỤC 102 CÁC KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM SỦ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU Kỹ thuật đo tải lượng HBV 1.1 Kỹ thuật: Realtime PCR Kỹ thuật Realtime PCR kỹ thuật chung dùng để định lượng vi rút, bao gồm hệ thống bán tự động tự động Trong nghiên cứu này, tải lượng vi rút thực hệ thống tự động Cobas TaqMan Roche 1.2 Chuẩn bị: 1.2.1 Thiết bị dụng cụ - Máy COBAS AmpliPrep Instrument COBAS TaqMan Analyzer, Hãng Roche hệ thống máy tính, máy in lưu điện kèm Phải kiểm tra chuẩn bị máy trước sử dụng - Tủ an toàn sinh học: ESCO class II type A2/LA2-3AI, Serial – 2013-82176; - Máy ly tâm eppendorf R, Serial – 0035487 - Máy vortex - Pipét: Biorad (100-1000µl) 1.2.2 Hóa chất: COBAS AmpliPrep/ COBAS TapMan HBV Test  HBV CS1 (hộp chứa hạt tinh thể): Hạt tinh thể Silica, Isopropanol  HBV CS2 (hộp chứa dung dịch ly giải): Natri citrate dehydrate, Guanidine thiocyanate, Polydocanol, Dithiothretiol  HBV CS3: hộp chứa hóa chất khác - Pase : EDTA Tris buffer, CaCl2, Calci acetate, Proteinase, Glycerol - EB: Tris buffer trung tính, Methylparaben  HBV CS4: hộp chứa hóa chất dành riêng cho HBV test 103 - HBV QS (HBV chuẩn): Tris-HCl buffer, EDTA, PolyA ARN, Plasmid gắn đoạn gen HBV DNA chuẩn, Natri azide - HBV MMX (HBV Master Mix): Tricine buffer, Kali acetate, Kali hydroxide, Natri azide, Glycerol, dATP, dCTP, dGTP, dTTP, Mồi ngược xuôi, Tá dược, Probe gắn huỳnh quang kép đặc hiệu cho HBV ADN đích chuẩn, Enzyme Z05 ADN polymerase, Enzyme AmpErase - HBV Mn2+: Mage acetate, Acid acetic băng, Natri azide - HBV H(+)C (Chứng dương nồng độ cao): Plasmid gắn đoạn HBV AND chuẩn, thành phần bảo quản ProClin®: 5-Chloro-2methyl-2H-isothiazol - HBV L(+)C (Chứng dương nồng độ thấp): Plasmid gắn đoạn HBV AND chuẩn, thành phần bảo quản ProClin®: 5-Chloro-2methyl-2H-isothiazol - CTM (-) C (COBAS TapMan HBV chứng âm): Plasmid khơng chứa trình tự HBV AND, thành phần bảo quản ProClin®: 5Chloro-2-methyl-2H-isothiazol - HBV H(+)C Clip: Clip chứa barcode cho chứng dương nồng độ cao - HBV L(+)C Clip: Clip chứa barcode cho chứng dương nồng độ thấp - HBV (-) C Clip: Clip chứa barcode cho chứng âm - HBV WR (Dung dịch rửa hệ thống tách chiết): Natri citrate dehydrate, N-Methylisothiazolone-HCl 1.2.3 Vật tư tiêu hao: - SPU (Sample Processing Unit): block tách chiết bệnh phẩm - S-tube (Sample tube): ống chứa huyết tương chống đông - K-tube K-tip - Đầu 1000 µl 1.2.4 Bệnh phẩm: 104 - Từ bệnh phẩm máu tồn phần chống đơng EDTA, sau kiểm tra đối chiếu thông tin bệnh nhân, huyết tương tách phương pháp ly tâm (thường từ 800 x g đến 1600 x g 20 phút) - Chuyển huyết tương sang ống S-tube giữ nhiệt độ -20 đến -80 oC chưa sử dụng Trong trường hợp này, trước tách chiết, để bệnh phẩm nhiệt độ phịng thí nghiệm rã đơng hồn tồn sau votex 3-5 giây - Chứng phải lấy khỏi điều kiện bảo quản 2-8 0C tiến hành 1.3 Quy trình thực 1.3.1 Tách chiết DNA: chạy hệ thống tách chiết COBAS® AmpliPrep:  Nhập hóa chất sinh phẩm: - Tất hóa chất phải lấy khỏi điều kiện bảo quản 2-8 oC cho vào hệ thống tách chiết tự động COBAS AmpliPre để nhiệt độ phịng thí nghiệm tối thiểu 30 phút mẻ bệnh phẩm tách chiết - Đặt HBV CS1 vào rack hóa chất A - Đặt HBV CS2, HBV CS3, HBV CS4 vào rack B, C, D E  Chuẩn bị vật tư tiêu hao: - Xác định lượng vật tư tiêu hao cần thiết: mẫu bệnh phẩm sử dụng tương ứng SPU, S-tube, K-tip, K-tube - Đặt SPU vào khay chứa SPU cho vào rack J, K L hệ thống COBAS AmpliPre - Đặt khay chứa K-tube vào rack M, N, O P hệ thống COBAS AmpliPre 105  Chỉ định vị trí cho mẫu loại test: - Chuẩn bị rack bệnh phẩm theo trình tự sau: gắn clip chứa barcode vào vị trí để S-tube (tube bệnh phẩm) Gắn clip có barcode đặc biệt tương ứng với chứng CTM (-)C, HBV L(+)C HBV H(+)C vào rack bệnh phẩm Lưu ý barcode chứng phải gắn tương ứng xác khơng nhầm lần Gắn S-tube vào vị trí gắn barcode - Vào phầm mềm AMPLILINK để định loại test tiến hành, xác định vị trí mẫubệnh phẩm đối chứng, vị trí bệnh phẩm phải tương ứng với vị trí ống rack bệnh phẩm - Lấy 1000-1050 µL huyết tương bệnh phẩm chứng CTM (-)C, HBV L(+)C HBV H(+)C vào S-tube (sử dụng đầu típ có màng lọc không chứa Dnase) - Các mẫu bệnh phẩm chứng cần phải cho vị trị định phần mềm AMPLILINK tờ giấy Order in - Cho rack chứa bệnh phẩm clip có barcode vào rack F, G H  Chạy hệ thống COBAS AmpliPrep: - Khởi động trình tách chiết phần mềm AMPLILINK - Kết thúc trình tách chiết COBAS AmpliPrep: Kiểm tra thơng tin cố cảnh báo có Lấy sản phẩm tách chiết bệnh phẩm chứng chứa rack K-carier khỏi hệ thống COBAS AmpliPrep Lấy nước thải vật tư tiêu hao qua sử dụng khỏi hệ thống COBAS AmpliPre 106 1.3.2 Chạy PCR-Realtime: Quá trình chạy PCR-Realtime phải chạy vòng 120 phút kể từ sau trình tách chiết hồn thành, sản phẩm tách chiết DNA bệnh phẩm chứng lưu giữ điều kiện 2-80C  Chuyển K-carrier chứa K-tip từ COBAS AmpliPrep sang COBAS TaqMan® Analyzer Quét mã vạch K-carrier phận chứa K-tube  Sau đặt thiết bị chứa K-tube vào máy COBAS TaqMan Analyzer , thiết bị tự động chạy Realtime PCR  Kết thúc trình chạy PCR, đèn COBAS TaqMan Analyzer nhấp nháy Kiểm tra cố lỗi có Kiểm tra kết nêu mục Kết Sau lưu kết vào máy vi tính Lấy K-tube sử dụng khỏi máy COBAS TaqMan Analyzer 1.3.3 Kết diễn giải kết theo bảng sau: Kết Diễn giải Báo cáo Target not detected Lượng DNA HBV thấp mức giới hạn phát máy Kết báo cáo là: HBV DNA < 20 IU/mL 2.0E+01 IU/mL ≤ Kết ≤ 1.70E+08 IU/mL Đây giới hạn mà nồng độ vi rút xác định xác biểu thị IU/ml copies/ml Nồng độ DNA vi rút cao mức giới hạn Kết > 1.70E+08 phát máy, nhiên chứng nội (IS) IU/mL cho kết tốt Kết chấp nhận báo cáo là: > 1.70 x 108 IU/mL INVAVID, > 1.70E+08 IU/mL Kết không chấp nhận hiểu DNA HBV có bệnh phẩm cao, 107 lấy hết tài nguyên chứng nội Bệnh phẩm cần phải pha loãng huyết tương người bình thường (khơng bị nhiễm HBV) chống đơng EDTA để đảm bảo chứng nội thị kết Kỹ thuật xác định đột biến kháng thuốc: Kỹ thuật giải trình tự gen 2.1 Thiết bị  Máy ly tâm cơng suất tối đa 16000 vịng/phút  Máy vortex  Dụng cụ làm lạnh ống PCR  Máy PCR Mastercycler gradient Eppendorf C1000 BioRad tương đương  Máy ủ nhiệt Techine Dri-BlockR  Hệ thống máy điện di máy đọc sản phẩm PCR  Máy giải trình tự gen ABI 3130 sequencer 2.2 Hóa chất  Quick g DNA Mini Prep Kit (hoặc tương đương);  Kit OneStep RT-PCR hãng Invitrogen (SuperScript® III Platinum® One-Step Quantitative RT-PCR System Cat No 11732020) (hoặc tương đương);  Các cặp mồi hãng IDT  OneTaq® HotStart 2X Master Mix with Standard Buffer  MicroElute Cycle-Pure Kit, for Purification of PCR product hãng Omega Bio-tek  Bright Dye Terminator Sequencing (Nimagen) 108  ZR DNA sequencing Clean-up Kit (Zymo Research, USA)  Running buffer 1X  Capillary (máy giải trình tự gien, model 3130) Capillary Array, x 50cm 2.3 Các bước thực 2.3.1 Chuẩn bị Master Mix cho phản ứng PCR  Số lượng ống PCR cần cho lần xét nghiệm theo công thức sau: Số lượng ống = số bệnh phẩm +3 Một lần thực PCR cần tiến hành đồng thời loại chứng bào gồm: Chứng dương; Chứng Âm để đảm bảo trình tách chiết ADN không bị nhiễm; Chứng NTC (None Template Control) để đảm bảo Master mix phản ứng PCR không bị nhiễm  Tiến hành làm tan đá ống dung dịch kit Taq PCR Master Mix Kit ống primer, sau giữ đặt ống khay đá  Lấy ống eppendof 1,5 ml vô trùng, không chứa DNase để khay đá, sau trộn thành phần Master mix theo cơng thức sau: ST Thành phần Thể tích (25 µl) T Taq PCR 2x Master Mix 12,5 MgCl2 1,0 DMSO 1,0 B2 (10µM) 0,5 HS4R (10µM) 0,5 H2O 4,5 ADN khn 5,0 109  Hút 20 µl Master mix vào ống PCR tương ứng với mẫu bệnh phẩm, chứng dương chứng âm  Đặt ống PCR chứa Master mix vào khay đá để đảm bảo nhiệt độ mix ~ 0C Bổ sung ADN khuôn sau để tránh nhiễm chéo, spin nhẹ đặt vào máy luân nhiệt tiến hành chạy 2.3.2 Tách chiết DNA Dùng nước cất khử trùng để làm chứng âm Tiến hành tách chứng âm đồng thời với bệnh phẩm khác  Bước 1: Bổ sung Beta-meraptoethanol vào dung dịch Genomic Lysis Buffer đến nồng độ 0,5%  Bước 2: Cho 200 µl huyết tương vào ống 1,5 ml, bổ sung 800 µl Genomic Lysis Buffer  Bước 3: Vortes 4-6 giây, ủ vòng 15-20 phút nhiệt độ thường  Bước 4: Chuyển toàn hỗn hợp lên cột, ly tâm tốc độ 10.000 x g vịng phút (có thể ly tâm làm lần, lần 500 µl), đổ phần dịch ống hứng  Bước 5: Cho 200 µl DNA Pre-Wash Buffer vào cột, ly tâm 10.000 x g vòng phút  Bước 6: Cho 500 µl Wash Buffer vào cột, ly tâm 10.000 x g vòng phút  Bước 7: Chuyển cột sang ống eppendorf 1,5 ml  Bước 8: Bổ sung 50 µl DNA Ellution Buffer trực tiếp vào phần màng lọc, tủ phút Ly tâm tốc độ 16.000 x g vòng 30 giây DNA thu sử dụng bảo quản -20oC 2.3.3 Thực PCR (vùng S) 110  Bước 1: Chuyển µl sản phẩm tách chiết ADN bệnh phẩm sản phẩm tách chiết chứng dương âm vào ống PCR tương ứng  Bước 2: Ly tâm nhẹ ống PCR có chứa Master mix sản phẩm ADN tách chiết  Bước 3: Chuyển ống PCR vào máy luân nhiệt cài đặt theo chu trình nhiệt sau: 95 oC 95 oC 55 oC 72 oC 72 oC oC phút 30 giây 30 giây phút 10 phút chu kỳ 40 chu kỳ chu kỳ Giữ mẫu 2.3.4 Điện di kiểm tra sản phẩm Các mẫu sau hoàn tất PCR điện di gel agarose để kiểm tra sản phẩm (sử dụng thuốc nhuộm Ethidium bromide GelRed)  Chuẩn bị Agarose 1,2 %  Đun nóng chảy agarose lị vi sóng (2-3 phút), để nguội đến 5560oC đổ vào khuôn cài sẵn lược  Để gel đông sau khoảng 20 phút, đặt gel vào bể điện di bổ sung buffer TAE 1x sau đo tiến hành điện di  Thành phần giếng điện di gồm: µl sản phẩm PCR (hoặc Maker) 1.5 µl Loading Dye Trộn tra mẫu vào giếng  Điện di với cường độ dòng điện 100 V 30 phút  Đọc phân tích kết điện di máy soi gel 111 2.3.5 Tinh sản phẩm PCR Sản phẩm PCR sau kiểm tra gel agarose 1,2 % tinh kit MicroElute Cycle-Pure Kit, for Purification of PCR product hãng Omega Bio-tek Quy trình thực sau: Bước 1: Chuyển sản phẩm PCR sang ống eppendorf 1,5 ml Cho thêm lần thể tích CP Buffer Bước 2: Vortex để trộn ly tâm nhẹ để dung dịch không bám lên nắp ống Bước 3: Đặt cột lọc MicroElute® LE DNA lên ống hứng ml Bước 4: Chuyển dung dịch từ ống eppendorf sang cột lọc Bước 5: Ly tâm > 13000g phút nhiệt độ phòng Bước 6: Loại bỏ dịch ống hứng Bước 7: Thêm 700 μL DNA Wash Buffer Chú ý: DNA Wash phải pha loãng ethanol trước sử dụng Bước 8: Ly tâm tốc độ tối đa phút Bước 9: Loại bỏ dịch ống hứng Bước 10: Lặp lại từ bước – cho bước rửa DNA Wash Buffer lần Bước 11: Ly tâm tốc độ tối đa phút để làm khô cột lọc Bước 12: Chuyển cột lọc sang ống eppendorf 1,5 ml Bước 13: Cho 10 - 20 µl Elution Buffer, TE Buffer nước cất vơ trùng vào cột lọc Bước 14: Ủ nhiệt độ phòng phút Bước 15: Ly tâm tốc độ tối đa phút Chú ý: Trong lần rửa này, lượng ADN thu đạt khoảng 80 – 90%, lần rửa thứ hai thu lượng ADN lại với nồng độ thấp Bước 16: Bảo quản ADN tinh -20oC 2.3.6 Xác định trình tự gen 112  Phản ứng PCR sequencing Sử dụng sinh phẩm Bright Dye terminator để thực phản ứng PCR Hỗn hợp phản ứng: Ready Reaction Premix Bright Dye sequencing buffer Primer µl µl µl (10 pmol) Template µl H2O Chu trình nhiệt: dẫn đến 20 µl 96 oC phút 96 oC 10 giây 50 oC giây 60 oC phút 25 chu kỳ  Tinh sản phẩm PCR sequencing Sử dụng kit tinh sản phẩm PCR (Sequencing clean up kit) hãng Zymo Reseach Quy trình: Bước 1: Thêm 240μl Sequecing Binding Buffer vào ống chứa sản phẩm PCR sequecing Bước 2: Chuyển toàn dịch lên cột lọc Bước 3: Ly tâm 10,000rpm/1 phút Bước 4: Thêm 300μl Sequecing Wash Buffer , ly tâm 10,000rpm/1 phút 113 Bước 5: Thêm 20μl Water Dnase, Rnase Free , ly tâm 10,000rpm/1 phút  Giải trình tự gen máy AB Applied Biosystem - Chuẩn bị hóa chất: Đệm 1x, Distilled H2O DNAse, RNAse free, Polyacrylamide gel - Kiểm tra bổ sung đệm 1x, H2O polyacrylamide gel vào ống thích hợp máy sequencing - Đặt plate (hoặc tube) vào vị trí đọc máy sequencing - Thực chạy sequencing 2.3.7 Diễn giải báo cáo kết quả: Kết giải trình tự vùng gen S thuộc genome HBV xử lý xác định genotype sau:  Copy trình tự ADN xử lý đưa vào sở liệu HBV  Bấm nút Search để chương trình tự động kiểm tra trình tự tương đồng  Kết Blast Search đưa genotype tương đồng 2.4 Gen đích sử dụng để xác định kháng thuốc HBV Tên mồi HB1F HB6R B2 HS4R Trình tự 5’ – 3’ AAGCTCTGCTAGATCCCAGAGT TTGTYTACGTCCCGTCGGCG GGCTCACAGTTCACGGAACAGT CATACTTTCCAATCAATAGG Vị trí 18 to 39 1803 to 1784 65 to 86 992 to 973 PCR PCR vòng PCR vòng ... điều trị viêm gan B Vì vậy, thực đề tài: ? ?Xác định đột biến liên quan đến kháng thuốc HBV b? ??nh nhân viêm gan B mạn tính b? ??nh viện B? ??nh Nhiệt Đới Trung từ tháng năm 2 014 đến tháng 12 năm 2 017 ” với... nghiệm đột biến kháng thuốc HBV b? ??nh viện B? ??nh Nhiệt Đới Trung Ương từ tháng năm 2 014 đến tháng 12 năm 2 017 2 .1. 1 Tiêu chuẩn lựa chọn b? ??nh nhân - B? ??nh nhân b? ?? viêm gan mạn HBV - Đang điều trị thuốc. .. PCR, xác định 45 ,11 % ca xuất đột biến kháng ADV Trong đó, đột biến rtA181V chiếm 5, 71% ; đột biến rtN236T chiếm 5, 71% đột biến rtA181T chiếm 11 ,43% [11 ] Tại b? ??nh viện B? ??nh Nhiệt Đới Trung Ương,