XÁC ĐỊNH đột BIẾN KHÁNG THUỐC LIÊN QUAN đến đột BIẾN ở BỆNH NHÂN VIÊM GAN b mạn tại BỆNH VIỆN BỆNH NHIỆT đới TRUNG ƯƠNG từ THÁNG 1 năm 2014 đến THÁNG 12 năm 2017

Trong thời gian từ tháng8/2004 đến tháng 5/2006, tại phòng xét nghiệm Trung Tâm Y Khoa MEDIC, Hồ Tấn Đạt cùng đồng nghiệp đã ứng dụng kỹ thuật giải trình tự chuỗi để xácđịnh kiểu gen và

TRỊNH THỊ HẰNG

XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN KHÁNG THUỐC LIÊN QUAN ĐẾN ĐỘT BIẾN Ở BỆNH NHÂN VIÊM GAN B MẠN TẠI BỆNH VIỆN BỆNH NHIỆT ĐỚI TRUNG ƯƠNG TỪ THÁNG 1 NĂM 2014 ĐẾN THÁNG 12 NĂM 2017

LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC

HÀ NỘI, 2019

TRỊNH THỊ HẰNG

XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN KHÁNG THUỐC LIÊN QUAN ĐẾN ĐỘT BIẾN Ở BỆNH NHÂN VIÊM GAN B MẠN TẠI BỆNH VIỆN BỆNH NHIỆT ĐỚI TRUNG ƯƠNG TỪ THÁNG 1 NĂM 2014 ĐẾN THÁNG 12 NĂM 2017

Chuyên ngành: Vi sinh y học

Mã số : 60720115

LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC Hướng dẫn khoa học:

1.PGS.TS Nguyễn Vũ Trung 2.TS Lê Văn Duyệt

HÀ NỘI, 2019

Trong quá trình học tập và làm luận văn, tôi đã nhận được sự quan tâm, giúp đỡ rất nhiều của nhà trường, cơ quan, gia đình và bạn bè.

Tôi xin chân thành cảm ơn:

- Ban Giám hiệu, Bộ môn Vi sinh, Phòng Đào tạo sau Đại học Trường Đại học Y Hà Nội.

- Labo xét nghiệm Trung tâm Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới Trung Ương.

- Khoa Khám bệnh Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới Trung Ương.

Đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn tốt nghiệp.

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn:

- PGS TS Nguyễn Vũ Trung, người Thầy đã luôn tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn.

- TS Lê Văn Duyệt, người Thầy trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện nghiên cứu Cảm ơn Thầy đã tận tình chỉ dẫn và truyền đạt cho tôi những kiến thức và kinh nghiệm trong quá trình làm khoa học.

- PGS.TS Vũ Tường Vân, TS Phạm Hồng Nhung… là những Thầy trong Hội đồng chấm Luận văn đã đóng góp nhiều ý kiến quý báu để tôi hoàn thành Luận văn.

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã dành

sự quan tâm, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập.

Hà Nội, ngày 18 tháng 9 năm 2019

Trịnh Thị Hằng

Tôi là Trịnh Thị Hằng, học viên cao học khóa 25, chuyên ngành Vi

sinh vật, Trường Đại học Y Hà Nội xin cam đoan:

1 Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn

của Thầy PGS-TS Nguyễn Vũ Trung và TS Lê Văn Duyệt.

2 Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã

được công bố tại Việt Nam

3 Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác,

trung thực và khách quan, đã được xác nhận và chấp nhận của cơ sởnơi nghiên cứu cho phép lấy số liệu

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những cam kết này

Hà Nội, ngày 18 tháng 9 năm 2019

Người viết cam đoan

Trịnh Thị Hằng

ADV Adefovir

ALT Amino alanin transferase

AntiHBc Kháng thể kháng kháng nguyên lõi vi rút viêm gan BAntiHBe Kháng thể kháng kháng nguyên e vi rút viêm gan B

AntiHBs Kháng thể kháng kháng nguyên bề mặt vi rút viêm gan BAST Alanin Amino Transferase

DNA Axit deoxyribonucleic

ETV Entercavir

EMT Emtricitabine

GGT Gamma Glutamyl transferase

HBcAg Kháng nguyên lõi vi rút viêm gan B

HBeAg Kháng nguyên e vi rút viêm gan B

HBsAg Kháng nguyên bề mặt vi rút viêm gan B

NUCs Các thuốc điều trị vi rút viêm gan B loại đồng phân nucleosides

Pg RNA RNA trung gian

RT Reverse Transcriptase

TDF Tenofovir

TP Terminal protein

WHO Tổ chức Y tế Thế giới

ĐẶT VẤN ĐỀ 12

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Dịch tễ học 3

1.1.1 Tình hình nhiễm HBV trên thế giới 3

1.1.2 Tình hình nhiễm HBVở Việt Nam 3

1.2 Đặc điểm vi rút viêm gan B 4

1.2.1 Cấu trúc vi rút 4

1.2.2 Cấu trúc bộ gen HBV 5

1.2.3 Hepatitis B Polymerase Protein 6

1.2.4 Quá trình nhân lên của HBV 7

1.2.5 Phân loại HBV theo genotype 9

1.2.6 Mối liên quan giữa genotype của HBV và hiệu quả điều trị thuốc kháng vi rút Nucleosides 11

1.3 Các marker huyết thanh của HBV và ý nghĩa 11

1.4 Chẩn đoán viêm gan vi rút B mạn 12

1.5 Điều trị viêm gan B mạn tính 12

1.5.1 Chỉ định điều trị 12

1.5.2 Các thuốc điều trị 13

1.5.3 Theo dõi điều trị 15

1.5.4 Đánh giá thất bại điều trị 15

1.6 Tình trạng kháng thuốc 16

1.6.1 Quản lý kháng thuốc kháng vi rút của HBV 16

1.6.2 Cơ chế kháng thuốc kháng vi rút của HBV 16

1.6.3 Tỷ lệ kháng thuốc 19

1.7 Các kỹ thuật xét nghiệm sử dụng trong xác định đột biến kháng thuốc

của HBV 23

1.7.1 Realtime PCR 23

1.7.2 Giải trình tự gen 24

1.8 Một số nghiên cứu về đột biến kháng thuốc điều trị viêm gan B mạn tính ở Việt Nam 25

1.9 Tình hình bệnh nhân đến khám và điều trị viêm gan B mạn tính tại bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới Trung Ương 26

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 Đối tượng nghiên cứu 28

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 28

2.3 Phương pháp nghiên cứu 28

2.3.1 Thiết kế nghiên kế 28

2.3.2 Phương pháp chọn mẫu 28

2.3.3 Các biến số, chỉ số nghiên cứu 29

2.3.4 Quy trình thực hiện nghiên cứu 32

2.3.5 Phương pháp thu thập thông tin 33

2.4 Các kỹ thuật xét nghiệm sử dụng trong nghiên cứu 33

2.4.1 Kỹ thuật đo tải lượng HBV 33

2.4.2 Kỹ thuật xác định đột biến kháng thuốc 33

2.5 Nhập và xử lý số liệu 34

2.6 Đạo đức nghiên cứu 34

2.7 Hạn chế của đề tài 35

CHƯƠNG 3; KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 36

3.1 Đột biến kháng thuốc của HBV ở bệnh nhân nhiễm VGB mạn tính 36

3.1.3 Đặc điểm đột biến của HBV 48

3.2 Các mối liên quan với đột biến kháng thuốc 53

3.2.1 Mối liên quan giữa đột biến kháng thuốc với phác đồ điều trị 53

3.2.2 Mối liên quan giữa đột biến kháng thuốc với thời gian điều trị 54

3.2.3 Mối liên quan giữa kháng thuốc với mức độ xơ gan 55

3.2.4 Mối liên quan giữa kháng thuốc với HBeAg 56

3.2.5 Mối liên quan giữa đột biến kháng thuốc với tải lượng HBV 57

3.2.6 Mối liên quan giữa đột biến kháng thuốc với kiểu gen HBV 58

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 59

4.1 Đột biến kháng thuốc của HBV 59

4.2 Mối liên quan giữa đột biến kháng thuốc của HBV và phác đồ điều trị, một số yếu tố khác 71

4.2.1 Mối liên quan giữa đột biến kháng thuốc của HBV và phác đồ điều trị .71

4.2.2 Mối liên quan giữa đột biến kháng thuốc của HBV và thời gian điều trị 75

4.2.3 Mối liên quan giữa đột biến kháng thuốc của HBV và tải lượng vi rút 76

KẾT LUẬN 77 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Bảng 1.1 Phân bố địa lý của HBV theo genotype và subtype 10

Bảng 1.2 Tóm tắt các dấu ấn huyết thanh của nhiễm HBV và ý nghĩa 11

Bảng1.3 Tỷ lệ kháng thuốc kháng HBV theo năm ở bệnh nhân điều trị NUCs 20

Bảng 3.1 Thời gian điều trị trung bình của các bệnh nhân theo các phác đồ điều trị 40

Bảng 3.2 Tỷ lệ mức độ AST/ ALT 40

Bảng 3.3 Tỷ lệ Bilirubin toàn phần 41

Bảng 3.4 Tỷ lệ bệnh nhân theo chỉ số AFP 41

Bảng 3.5 Tỷ lệ Prothrombin 42

Bảng 3.6 Tỷ lệ INR 43

Bảng 3.7 Các chỉ số công thức máu 43

Bảng 3.8 Tần số bệnh nhân nhiễm chủng HBV có mang các đột biến kháng NUCs 48

Bảng 3.9 Tần số đột biến kháng đa thuốc của HBV 51

Bảng 3.10 Phân bố các dạng đột biến kháng thuốc của HBV theo phác đồ điều trị 51

Bảng 3.11 Các thuốc NUCs bị kháng theo dạng kháng thuốc và phác đồ điều trị 52

Bảng 3.12 Mối liên quan giữa kháng thuốc với phác đồ điều trị 53

Bảng 3.13 Mối tương quan về tình trạng đột biến kháng thuốc của HBV giữa 2 phác đồ điều trị TDF 53

Bảng 3.14 Mối liên quan giữa tình trạng đột biến kháng thuốc của HBV với thời gian điều trị bằng phác đồ ETV 1 viên/ngày 54

Bảng 3.15 Mối liên quan giữa dạng đột biến kháng thuốc của HBV với thời gian điều trị bằng phác đồ ETV 1 viên/ngày 54

Bảng 3.17 Mối liên quan giữa tình trạng đột biến kháng thuốc của HBV với

tình trạng HBeAg 56Bảng 3.18 Mối liên quan giữa tình trạng đột biến kháng thuốc của HBV với

tải lượng HBV 57Bảng 3.19 Mối liên quan giữa tình trạng đột biến kháng thuốc của HBV với

kiểu gen của HBV 58

Hình 1.1 Cấu trúc của vi rút viêm gan B 4

Hình 1.2 Cấu trúc bộ gen của HBV 6

Hình 1.3 Polymerase Protein của HBV 6

Hình 1.4 Vòng đời của HBV trong tế bào gan 9

Hình 1 5 Polymerase/enzyme phiên mã ngược (Pol/rt) biểu thị đột biến thay thế kháng thuốc tiên phát liên quan đến các L-nucleoside (LMV và LdT), các acyclic phosphonate (ADV và TFV) và nhóm D-Cyclopentane 19

Biểu đồ 3.1 Tỷ lệ bệnh nhân theo tuổi 36

Biểu đồ 3.2 Phân bố bệnh nhân theo giới tính 37

Biểu đồ 3.3 Tỷ lệ bệnh nhân theo lý do vào viện 37

Biểu đồ 3.4 Tỷ lệ bệnh nhân theo thời gian nhiễm HBV 38

Biểu đồ 3.5 Tỷ lệ bệnh nhân theo phác đồ điều trị 39

Biểu đồ 3 6 Tỷ lệ bệnh nhân theo tình trạng HBeAg 42

Biểu đồ 3.7 Tỷ lệ bệnh nhân theo chỉ số Fibro-S 44

Biểu đồ 3.8 Tỷ lệ bệnh nhân theo chỉ số Fibro-F 45

Biểu đồ 3.9 Tỷ lệ bệnh nhân theo tải lượng HBV 46

Biểu đồ 3.10 Tỷ lệ bệnh nhân theo kiểu gen 47

Biểu đồ 3.11 Tỷ lệ đột biến kháng thuốc của HBV 48

Biểu đồ 3.12 Tỷ lệ kháng thuốc ở nhóm bệnh nhân nghiên cứu 49

Biểu đồ 3.13 Tỷ lệ đột biến kháng đơn thuốc của HBV 50

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nhiễm vi rút viêm gan B (Hepatitis B virus- HBV) có nguy cơ dẫn đếnmột số biến chứng nguy hiểm như suy gan, xơ gan và ung thư gan Theothống kê của Tổ chức Y Tế Thế Giới, đến năm 2015 có khoảng 240 triệungười nhiễm HBV (HBsAg dương tính) và số người tử vong liên quan đếnnhiễm HBV là 887 000 [1] HBV và các bệnh do nó gây ra hiện đang là vấn

đề sức khỏe toàn cầu, không chỉ bởi tỷ lệ người nhiễm cao, kèm theo các biếnchứng nguy hiểm mà còn do sự lây truyền nhanh trong cộng đồng HBV cóthể lây truyền qua tổn thương ở da, niêm mạc có tiếp xúc với máu, dịch củangười mang HBV, qua con đường truyền máu, dùng chung bơm kim tiêm,quan hệ tình dục không an toàn, và đặc biệt là qua quá trình chu sinh [2],[3]

Ở các nước có tỷ lệ bệnh lưu hành cao, chu sinh là con đường lây truyền cơbản và hơn 90% trẻ bị nhiễm HBV trong giai đoạn này sẽ diễn biến mạn tính

do hệ thống miễn dịch chưa hoàn thiện [4],[5],[6],[7] Mặc dù đã có vắc xinhiệu quả nhưng tỷ lệ người nhiễm HBV vẫn còn cao Việt Nam cũng là mộttrong những nước có tỷ lệ nhiễm HBV cao với khoảng 10-20% dân số bịnhiễm Trong đó, HBV gây ra 49,7% trường hợp viêm gan cấp, 87,6% trườnghợp xơ gan và 57,6%-80% số ca bị ung thư gan [8]

Trước thực trạng trên, việc phát hiện và điều trị viêm gan B mạn tính đãtrở nên vô cùng quan trọng, nhằm ngăn ngừa và giảm nguy cơ tử vong chobệnh nhân Hiện nay, có 2 nhóm thuốc được công nhận trong điều trị viêmgan B mạn là Interferon và các đồng phân Nucleotides [3] Tuy nhiên, với liệupháp miễn dịch, điều trị bằng Interferon, tỷ lệ đáp ứng thấp, dưới 40% [9] Do

đó, những liệu pháp kháng vi rút hiệu quả được xem là cần thiết trong điều trịviêm gan B Các đồng phân nucleotides có tác dụng ức chế sự tăng sinh của

vi rút trong thời gian dài, với mức độ khác nhau tùy loại thuốc, ít tác dụngphụ, làm chậm diễn biến của bệnh, cải thiện tỷ lệ sống và giảm nguy cơ biếnchứng cho bệnh nhân [3]

Trong quá trình điều trị bằng thuốc kháng vi rút, dưới áp lực chọn lọccủa thuốc, các dòng vi rút có đột biến kháng thuốc sẽ xuất hiện và lan rộng,

gây nên tình trạng kháng thuốc, dẫn đến thất bại điều trị Các xét nghiệm xácđịnh tình trạng kháng thuốc của HBV cùng với việc xác định gen kháng thuốc

có ý nghĩa chiến lược trong điều trị và kiểm soát bệnh ở Việt Nam Cho đếnnay, đã có khá nghiều nghiên cứu về vấn đề này Trong thời gian từ tháng8/2004 đến tháng 5/2006, tại phòng xét nghiệm Trung Tâm Y Khoa MEDIC,

Hồ Tấn Đạt cùng đồng nghiệp đã ứng dụng kỹ thuật giải trình tự chuỗi để xácđịnh kiểu gen và các đột biến kháng thuốc của siêu vi viêm gan B trên 122bệnh nhân viêm gan B mạn tính đang điều trị Lamivudine Nghiên cứu xácđịnh được 2 kiểu gen của HBV là kiểu gen B và C, trong đó kiểu gen B là62,3% và kiểu gen C là 37,7% Tổng cộng có 63,9% có đột biến khángLamivudine Trong đó, tỷ lệ có đột biến kháng Lamivudine sau 1, 2, 3, 4 nămđiều trị Lamivudine là 27,8%; 63,4%; 71,1%; 83,3% [10] Năm 2010, Lê ThịDung xây dựng quy trình phát hiện đột biến rtA181V/T và rtN236T khángadefovir của HBV bằng kỹ thuật realtime PCR, xác định được 45,11% ca xuấthiện đột biến kháng ADV Trong đó, đột biến rtA181V chiếm 5,71%; độtbiến rtN236T chiếm 5,71% và đột biến rtA181T chiếm 11,43% [11] Tại bệnhviện Bệnh Nhiệt Đới Trung Ương, trong quá trình theo dõi, quản lý bệnhnhân viêm gan B được điều trị bằng các thuốc kháng vi rút, chúng tôi nhậnthấy những trường hợp thất bại điều trị do kháng thuốc đã xuất hiện không ít.Tuy nhiên, cho đến nay vẫn chưa có thống kê đầy đủ về một số đột biến liênquan đến kháng thuốc điều trị viêm gan B Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài:

“Xác định đột biến liên quan đến kháng thuốc của HBV ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính tại bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới Trung từ tháng 1 năm

2014 đến tháng 12 năm 2017” với mục tiêu sau:

Xác định đột biến kháng thuôc của HBV và mối liên quan với các phác

đồ điều trị ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Dịch tễ học

1.1.1 Tình hình nhiễm HBV trên thế giới

Theo thống kê của WHO, trên thế giới có khoảng 257 người nhiễm HBV(HbsAg dương tính), năm 2015 có 887.000 người tử vong do các biến chứngcủa nhiễm HBV [1]

Tỷ lệ nhiễm HBV trên thế giới thay đổi theo các vùng địa lý khác nhau,

từ 2- 20% [12] Ở châu Á (đặc biệt là Đông Nam Á, Trung Quốc, Phillipin,Indonesia), Trung Đông, châu Phi và một số vùng Nam Mỹ, tỷ lệ nhiễm HBV

ở mức độ cao, từ 8-15% [13] Vùng có tỷ lệ nhiễm HBV trung bình 2-7% làNhật Bản, Nam Mỹ, Đông Âu, Nam Âu và một phần trung tâm châu Á Với

số người nhiễm HBV dưới 2% dân số, các nước Bắc Âu, Úc, phía Nam Nam

Mỹ, Canada và Mỹ là những quốc gia có tỷ lệ nhiễm HBV thấp nhất [14].Qua nghiên cứu, con đường lây truyền HBV ở các nước châu Á chủ yếu

là lây truyền dọc từ mẹ sang con trong quá trình chu sinh Trong khi đó, lâytruyền ngang lại là con đường chính ở châu Phi và các nước phương Tây [12].Hậu quả lâu dài của nhiễm HBV mạn tính cũng rất khác nhau giữa cácđối tượng Tỷ lệ xơ gan hàng năm ước tính 2- 6% ở những bệnh nhân viêmgan B mạn có HBeAg dương tính và 8-10% với HBsAg âm tính Bên cạnh

đó, tỷ lệ ung thư gan hàng năm ở những người mang HBV không xơ gan làdưới 1% trong khi tỷ lệ này ở những bệnh nhân xơ gan là 2-3% [15],[16]

1.1.2 Tình hình nhiễm HBVở Việt Nam

Tính đến năm 2005, Việt Nam có khoảng 8,4 triệu người mang vi rútHBV mạn tính và có 233.000 người chết do các bệnh liên quan như viêm gan

B cấp và mạn, xơ gan, suy gan, ung thư gan do HBV [17]

Theo nghiên cứu của Hipgrave và cộng sự về phân bố tỷ lệ nhiễm HBVtheo tuổi ở Việt Nam, tỷ lệ nhiễm ở trẻ sơ sinh là 12,5%, trẻ nhỏ là 18,4%,thanh thiếu niên là 20,5%, người lớn là 18,8% [18] Sự thay đổi theo tuổi nàycho thấy ở nước ta, đường lây truyền từ mẹ sang con chiếm một tỷ lệ lớntrong việc lây truyền HBV.

Những đối tượng có nguy cơ lây nhiễm HBV cao cũng đã được nghiêncứu về tỷ lệ mang HBsAg:

• 12,4% ở nhóm nhân viên Y tế [19]

• 21,1% ở nhóm cho máu nhiều lần [20]

• 19,2% ở nhóm tiêm chích và mại dâm [21]

• 24,7% ở nhóm HIV dương tính [22]

Những số liệu nói trên là những minh chứng cho thấy Việt Nam là mộttrong những nước có tỷ lệ HBV lưu hành cao HBV không chỉ là mối lo ngạicủa ngành y tế mà của toàn xã hội Chi phí điều trị tốn kém đã trở thành gánhnặng cho nhiều gia đình, ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống

1.2 Đặc điểm vi rút viêm gan B

1.2.1 Cấu trúc vi rút

Hình 1.1 Cấu trúc của vi rút viêm gan B [23]

HBV thuộc họ Hepadnaviridae, là một loại vi rút hướng gan, có hệ ditruyền là DNA Một hạt virion hoàn chỉnh còn gọi là tiểu thể Dane, có cấutrúc hình cầu, đường kính khoảng 42 nm, gồm 3 lớp:

Lớp ngoài cùng là lớp lipid kép gắn nhiều protein bề mặt S, M, L(HBsAg trong huyết thanh)

Lớp giữa là lớp vỏ nucleocapsid đường kính 27nm và có hình lăng trụ,được cấu thành từ 240 protein lõi ( HBcAg trong huyết thanh)

Lớp trong cùng có chứa cấu trúc DNA kép không hoàn chỉnh, đóng vònggọi là RC- DNA (relaxed circle DNA) và DNA polymerase [24],[25]

1.2.2 Cấu trúc bộ gen HBV

Genome của HBV là phân tử DNA kép mạch vòng không hoàn chỉnhvới một sợi DNA mang mã hóa không hoàn chỉnh (sợi dương) và một sợiDNA mang mã hóa hoàn chỉnh (sợi âm), có kích thước khoảng 3.2 kb SợiDNA dương liên kết với một oligonucleotide ở đầu 5’, còn sợi DNA âm cóđầu 5’ liên kết với Polymerase protein của virus [26]

Dựa trên sự so sánh các chuỗi DNA của các dòng HBV khác nhau, có ítnhất 4 khung đọc mở (ORFs) bảo tồn, được tìm thấy trong genome của HBV.Gen polymerase (gen P) là vùng đọc mở lớn nhất, mã hóa cho protein P đachức năng Cùng với gen P còn có 6 gen khác Gen C mã hóa chonucleocapsid và HBcAg, gen PreC mã hóa cho HBeAg, gen X mã hóa choprotein X (HBX), và 3 gen PreS1, PreS2, PreS mã hóa cho các protein bề mặt

là LHBs, MHBs, SHBs [27]

Hình 1.2 Cấu trúc bộ gen của HBV DNA kép được biểu thị bằng các đường đen đậm Sợi DNA (-) là đường đen đậm, liền, có đầu 5’ liên kết hóa trị với P Sợi DNA (+) là đường đen đậm có nét đứt, có đầu 5’ liên kết với RNA primer (dường zíc zắc) DR1 và DR2 là hướng lặp lại Vòng tròn bên ngoài là biểu thị của pgRNA với ε ở đầu 5’ và đuôi poly A ở đầu 3’ Các vị trí tương đối của các khung đọc mở được biểu thị ở bên trong [28].

1.2.3 Hepatitis B Polymerase Protein

Hình 1.3 Polymerase Protein của HBV [29] Polymerase protein gồm các vùng: Terminal, Spacer, RNAse H và RT Trên RT có các vị trí tác động

của thuốc NUCs là G FA B C D E

Vùng đọc mở lớn nhất của HBV genome mã hóa cho polymerase proteincủa HBV Protien P có kích thước khoảng 90 kD, được cấu thành từ 838 axitamin, rất giàu histidine, được xem là một emzym đa chức năng với các hoạttính chính như: vai trò làm đoạn mồi cho quá trình sao mã, DNA polymerase

và enzym phiên mã ngược Protein P được tạo nên bởi 3 vùng chức năng vàmột vùng đệm có thể thay đổi Phần N-terminus của protein đóng vai trò nhưđoạn mồi (Primase), khởi đầu cho quá trình tổng hợp sợi DNA âm Vùng nàycòn gọi là terminal protein (TP) [30],[31],[32] Vùng đệm (Spacer) nằm giữavùng TP và vùng RT (Reverse Transcriptase) Nó từng được cho là vùngkhông quan trọng, chỉ có nhiệm vụ liên kết vùng TP và vùng RT với nhau,những đột biến xảy ra với những acid amin ở vùng này không gây ra nhữngthay đổi của protein P [33] Nhưng thực tế, tận cùng C- của vùng Spacer lại làphần không thể thiếu được cho quá trình đóng gói RNA trung gian (pg RNA)[34] Vùng RT chịu trách nhiệm cho quá trình sao mã bộ gen thông qua quátrình sao mã ngược từ pgRNA thành sợi DNA âm của bộ gen và sau đó, sợi

âm này sẽ được sử dụng làm khuôn mẫu để tổng hợp sợi DNA dương Vùng

RT hiện tại là đích tác động duy nhất của liệu pháp kháng virus sử dụng trongđiều trị viêm gan B [35] Cuối cùng là vùng RNase H nằm ở đầu carboxyl,chịu trách nhiệm tiêu hủy khuôn mẫu pg RNA trong suốt quá trình tổng hợpsợi DNA âm Các nghiên cứu cũng đã chỉ ra rằng vùng Rnase H cũng quantrọng đối với quá trình đóng gói pg RNA [36]

Protein P cũng là thành phần cấu trúc của vi rút vì nó được đưa vào nhân

tế bào chủ, phục vụ cho việc sao chép pha sớm [25]

1.2.4 Quá trình nhân lên của HBV

Đầu tiên, hạt vi rút gắn với tế bào gan qua một thụ thể đặc hiệu dành choIgA trên bề mặt tế bào gan Sau khi cởi bỏ vỏ ngoài, phần nucleocapsid của virút xâm nhập vào bào tương và di chuyển đến nhân tế bào Tại đây,

nucleocapsid cởi vỏ capsid, còn DNA kép với hai sợi không bằng nhau thìchui vào trong nhân.

Trong nhân tế bào, gen của vi rút được chuyển thành dạng vòng khépkín, siêu xoắn (cccDNA) Vi rút sử dụng RNA polymerase II của vật chủ

và cccDNA làm khuôn mẫu để tổng hợp 4 loại RNA Pregenome RNA cóchiều dài khoảng 3,5kb và 3 sub-genome RNA có kích thước khác nhau lầnlượt là 2,4kb; 2,1kb; 0,7kb Toàn bộ mRNA được gắn đuôi và vận chuyển

ra tế bào chất

Tại tế bào chất, pgRNA được dùng để tổng hợp genome của HBV Cácsubgenome RNA được dùng để tổng hợp các protein khác trong đó có HBp,protein C và tiền C, protein X, protein S và proteinkinase Protein C đượcdùng để tạo thành nucleocapsid HbcAg Protein tiền C được vận chuyển đếnlưới nội chất Từ lưới nội chất, nó được tiết ra ngoài dưới dạng kháng nguyêntiền lõi HbeAg Còn pgRNA được đóng cùng DNA polymerase của virus vàproteinkinase tạo thành hạt lõi Bên trong lớp vỏ capsid vừa tạo thành,pgRNA làm khuôn mẫu để tổng hợp các sợi DNA âm theo cơ chế sao mãngược Polymerase của HBV phiên giải pgRNA, chỉ để lại một đoạn nhỏ (29cặp base ở đầu 5’) Đoạn này dùng làm mồi cho tổng hợp sợi DNA dươngtrên khuôn DNA âm Protein S gắn vào màng lipid của bộ máy Golgi và lướinội chất để sau đó, các nucleocapsid nảy chồi vào lưới nội chất và Golgi sẽbiến chúng thành vỏ ngoài của các thế hệ vi rút con

Một số bộ gen trưởng thành sau tổng hợp sẽ quay về nhân, chuyểnthành dạng cccDNA nhằm duy trì lượng luôn ổn định cho dịch mã Phầnlớn bộ gen trưởng thành được lắp ráp hoàn chỉnh rồi nảy chồi, di chuyếnđến tế bào gan khác

Trong quá trình nhân lên, vi rút luôn tổng hợp thừa protein vỏ nên tronghuyết thanh người bị nhiễm HBV, ngoài vi rút hoàn chỉnh còn xuất hiện cácdạng không hoàn chỉnh hình cầu, hình que, hình sợi [25]

Hình 1.4 Vòng đời của HBV trong tế bào gan [37]

1.2.5 Phân loại HBV theo genotype

Dựa vào sự khác nhau trong trình tự nucloetide của toàn bộ gen, cho đếnnay HBV đã được phân thành 10 genotype (từ A đến J) và 28 subtype Sựphân loại genotype dựa vào sự khác nhau trên 8% về trình tự nuclotide, sựkhác nhau từ 4-8% sẽ là cơ sở để phân loại subtype [38],[39]

Ngoại trừ hai genotype mới được phân lập là I và J, sự phân bố địa lý vàsắc tộc của genotype và subtype HBV được cho là đặc trưng [Bảng 1.1].Genotype A lưu hành cao ở Saharan châu Phi (A1), Bắc Âu (A2) và Tây Phi(A3).Genotype B và C phổ biến ở châu Á Hiện tại genotype B được chiathành các subtype từ B1 đến B6, trong đó B1 được phân lập ở Nhật, B2-5được tìm thấy ở Đông Á, B6 được tìm thấy ở người dân bản địa sống ởphương Bắc như Alaska, Bắc Canada và đảo Groeland.Genotype C gồm cácsubtype từ C1 đến C5, chủ yếu tồn tại ở Đông Á và Nam Á Genotype D vớicác subtype từ D1 đến D5 lưu hành ở châu Phi, châu Âu, Tây Phi Genotype

E chỉ hạn chế ở Tây Phi Genotype F (F1-F4) được tìm thấy ở Trung Mỹ vàNam Mỹ Genotype G đã được báo cáo ở Pháp, Đức và Anh [38],[39], [40],[41],[42] Gần đây, genotype I đã được phân lập ở Việt Nam và Lào, đó là sự

tái tổ hợp giữa các genotype A, C và G [43],[44], [45] Genotype mới nhấtcủa HBV là J, được xác định ở đảo Ryukyu của Nhật, có mối liên quan mậtthiết với genotype phát hiện ở vượn, đười ươi và genotype C phát hiện trênngười [46].

Mối tương quan của sự phân bố genotype HBV với phương thức lâytruyền cũng đã được nghiên cứu Genotype B và C lưu hành cao ở một số khuvực nhất định như các nước châu Á, nơi mà phương thức lây truyền dọc từ mẹsang con đóng vai trò quan trọng trong lan truyền HBV Trong khi đó, cácgenotype còn lại thường xuyên được tìm thấy ở các khu vực có phương thứclây truyền chính là lây truyền dọc Vì vậy, genotype HBV có thể được vậndụng như một công cụ dịch tễ học cho điều tra lây truyền mẹ-con, cụm giađình và xu hướng phân bố địa lý HBV [42]

Bảng 1.1 Phân bố địa lý của HBV theo genotype và subtype [47]

A2A3

Sub-Saharan châu PhiBắc Âu

Tây Phi

B2-5B6

Nhật BảnĐông Á, Đài Loan, Trung Quốc, Indonesia, Việt Nam, PhilipineAlaska, Bắc Canada

C4C5

Đài Loan, trung Quốc, Hàn Quốc, Đông Nam Á

ÚcPhilipine, Việt Nam

D D1-5 Châu Phi, Châu Âu, Địa Trung Hải, Ấn Độ

kháng vi rút Nucleosides

Đáp ứng điều trị đối với các NUCs ở các genotype của HBV cũng đãđược nghiên cứu Nghiên cứu ở Đức cho thấy tỷ lệ kháng LAM ở bệnh nhânnhiễm HBV genptype A cao hơn genotype D Không có sự khác nhau vềnguy cơ kháng LAM ở bệnh nhân nhiễm HBV genotype B so với bệnh nhânnhiễm HBV genotype C Mặc dù có rất ít nghiên cứu nhưng hiệu quả điều trịđối với các NUCs khác trừ Lamivudine là giống nhau giữa các kiểu gen [48]

1.3 Các marker huyết thanh của HBV và ý nghĩa

Bảng 1.2 Tóm tắt các dấu ấn huyết thanh của nhiễm HBV và ý nghĩa [49]

Âm tính Dương

tính

HBeAg:

 Dấu ấn sự nhân lên của virus

 Xuất hiện trong nhiễm cấp hoăc

mạn

 Âm tính trong biến chủng

precore

Dương tính

Âm tính Dương

hoặc âmtính

Anti HBsAg:

 Dấu ấn của sự phục hồi và miễn

dịch

 Xuất hiện sau khi đã thải trừ

HBsAg và khi hồi phục hoàn toàn

 Dương tính khi tiêm phòng

Phản ứng chuyển đảo huyết thanh từ HBeAg

(+) sang anti HBeAg (+) thường dẫn tới sự

ức chế virus kéo dài

tính hoặc âm

tínhAnti HBc:

 Nhiễm mới: IgM (+)

 Nhiễm HBV đã lâu: IgG (+)

HBV DNA:

 Dấu ấn đánh giá vi rút đang nhân

lên

 Trong viêm gan B cấp hoặc mạn

tính có thể định lượng được hoặc

dưới ngưỡng phát hiện

Dươngtính hoặcdướingưỡngphát hiện

Âm tính Dương

tính hoặcdướingưỡngphát hiện

1.4 Chẩn đoán viêm gan vi rút B mạn

- HBsAg (+) >6 tháng hoặc HBsAg (+) và Anti HBc IgG (+)

- AST, ALT tăng từng đợt hoặc liên tục trên 6 tháng

- Có bằng chứng tổn thương xơ hóa gan hoặc xơ gan được xác định bằngsinh thiết gan, hoặc đo độ đàn hồi gan, hoặc Fibrotest, hoặc chỉ số APRI và đãloại trừ do các căn nguyên khác[3]

1.5 Điều trị viêm gan B mạn tính

1.5.1 Chỉ định điều trị

Khi có đủ 2 tiêu chuẩn sau: [3]

- ALT tăng trên 2 lần giá trị bình thường, hoặc có bằng chứng xơ hóagan, xơ gan

- HBV DNA ≥105 copies/ml (20.000 IU/ml) nếu HBeAg (+) hoặc HBVDNA ≥104 copies/ml (2.000 IU/ml) nếu HBeAg (-)

1.5.2 Các thuốc điều trị

Sự nhân lên và tình trạng hoạt động của virus chính là tác nhân dẫn đếntổn thương gan và sự tiến triển của bệnh Chính vì vậy, điều trị viêm gan B

mạn tính nhằm làm thuyên giảm bệnh gan, ức chế sự nhân lên của vi rút Mụcđích cuối cùng là ngăn cản sự tiến triển thành xơ gan, suy gan và ung thư gan.Hiện nay trên thế giới có 7 loại thuốc được sử dụng trong điều trị viêm gan Bmạn tính, chia làm hai nhóm thuốc điều trị chính:

1.5.2.1 Interferon (IFN) (nhóm dung hòa miễn dịch)

Nhóm này bao gồm các thuốc: IFN-α, pegIFN-α IFN-α có tác dụngchống vi rút và củng cố hệ miễn dịch cơ thể Dạng pegIFN-α cải thiện tínhchất dược động học nên có thể tiêm hàng tuần thay vì uống hàng ngày Cácnghiên cứu cho thấy những bệnh nhân điều trị IFN-α có đáp ứng giảm ALT,giảm HBV DNA, mất HBeAg nhiều hơn so với nhóm chứng không dùngthuốc [50] Đáp ứng với điều trị phụ thuộc vào men gan và tải lượng vi rúttrước khi điều trị: ALT cao, HBV DNA thấp có xu hướng đáp ứng tốt hơn vớiđiều trị [51]

1.5.2.2 Thuốc kháng vi rút Nucleosides

Nhóm này gồm các thuốc: Lamivudin, Adefovir, Entecavir, TenofovirCác thuốc nhóm này làm giảm tỷ lệ ung thư gan, giảm và thậm chí cảithiện tình trạng xơ gan [52],[53] Nồng độ ALT cao trước khi điều trị tiênlượng kết quả điều trị tốt đối với bệnh nhân HBeAg (+), tuy nhiên không cómột tiêu chuẩn cụ thể nào đối với bệnh nhân HBeAg (-) [54]

Việc lựa chọn thuốc điều trị phụ thuộc vào tác dụng, sự kháng thuốc, tácdụng phụ và tình trạng bệnh nhân [3],[49]:

• Lamivudin:

- Ức chế quá trình nhân lên của vi rút, cải thiện mô học tế bào gan

- Đột biến kháng thuốc thường gặp nhất là thay thế Methionin tạiTyrosin- Methionin- Aspartat- Aspartat (YMDD) bằng Valin hoặc IsoleucinrtM204V/I Đột biến này thường kèm theo thay thế từ Leucin sang Methionin

ở vùng ngược lại rtL180M Genotype kháng có thể phát hiện từ 14-32% saumột năm điều trị và tới 70% sau 5 năm

- Những yếu tố làm tăng nguy cơ kháng với Lamivudin: thời gian điềutrị kéo dài, nồng độ HBV DNA cao trước khi điều trị.

oỨc chế sao chép chuỗi âm của HBV DNA từ RNA

oỨc chế tổng hợp chuỗi dương của HBV DNA

- Có hiệu quả hơn Lamivudin và Adefovir, đặc biệt với những trườnghợp kháng Lamivudin

• Liều điều trị:

- Tenofovir (TDF) 300mg/ngày hoặc Entecavir (ETV) 0.5mg/ngày

- Lamivudin (LAM) 100mg/ngày dùng trong xơ gan mất bù, phụ nữ có thai

- Adefovir 10mg ngày uống 1 viên

1.5.3 Theo dõi điều trị [3]

• Tuân thủ điều trị: tư vấn cho bệnh nhân về lợi ích của tuân thủ điều trị

và các biện pháp hỗ trợ

• Các xét nghiệm theo dõi định kỳ:

- Tháng đầu sau điều trị: theo dõi AST, ALT, creatinin máu

- Định kỳ 3-6 tháng điều trị: theo dõi AST, ALT, creatinin máu,HBeAg, Anti- Hbe, HBV DNA, có thể định lượng HbsAg

1.5.4 Đánh giá thất bại điều trị

• Tiêu chuẩn thất bại điều trị [3],[49]:

- ALT tăng cao trở lại

- HBV DNA tăng > 1log10 so với trị số thấp nhất, hoặc giảm < 1log10sau 12 tuần điều trị, hoặc giảm < 2log10 sau 24 tuần điều trị

Tuy nhiên, để dự đoán đề kháng và tiếp cận giải quyết chủ động, “lộtrình” tiếp cận trong năm 2007 đã đề xuất rằng thời điểm quan trọng đầutiên để đánh giá ở một bệnh nhân bắt đầu điều trị kháng vi rút là 12 tuần ,tại thời điểm này đáp ứng < 1 log10 ở bệnh nhân cũng phải được xemnhư là một ”người không đáp ứng nguyên phát” và phải đưa đến một thayđổi trong điều trị

Thời điểm quan trọng kế tiếp trong lộ trình tiếp cận là 24 tuần điều trị,khi mà việc đạt được một đáp ứng “hoàn thành” (không thể phát hiện HBVDNA bằng PCR) quyết định cho việc tiếp tục điều trị với các thuốc hiện tại Nếu thời điểm này , HBV DNA ≥103 copies/ml thì việc làm xét nghiệm xácđịnh kháng thuốc là cần thiết [55]

• Muốn khảng định thất bại điều trị cần [3, 49]:

- Đánh giá tuân thủ điều trị và độ tin cậy của xét nghiệm HBV DNA

- Giải trình tự gen xác định gen đột biến kháng thuốc

1.6 Tình trạng kháng thuốc

1.6.1 Quản lý kháng thuốc kháng vi rút của HBV [49]

Sự kháng thuốc kháng vi rút là vấn đề quan trọng trong theo dõi điều trịviêm gan vi rút B bằng các NUCs Bệnh nhân cần được theo dõi định kỳ:

- Xét nghiệm HBV DNA định kỳ 3-6 tháng/lần trong suốt thời gianđiều trị

- Trong trường hợp có bùng phát vi rút, cần kiểm tra sự tuân thủ điều trị

và khảng định kháng thuốc bằng kỹ thuật giải trình tự gen

1.6.2 Cơ chế kháng thuốc kháng vi rút của HBV [56]

Kháng thuốc là một trong những khó khăn lớn nhất trong quản lý điều trịviêm gan virus B mạn Thuốc kháng virus chính được sử dụng để điều trịCHB là NUCs, đóng vai trò như là áp lực chọn lọc đột biến gen ở gen P, làmgiảm tính nhạy cảm của HBV với thuốc, ngăn cản tác dụng của thuốc

Động lực của HBV thể hiện ở khả năng sản sinh ra 1012 đến 1013 hạt virút trong thời gian một ngày Nửa chu kỳ vòng đời của HBV tự do thay đổi từ3- 24 giờ, còn nửa chu kỳ vòng đời của tế bào gan bị nhiễm HBV khoảng 100ngày Sự khác nhau về thời gian sống là một trong những nguyên nhân chínhđòi hỏi thời gian điều trị viêm gan B mạn tính phải kéo dài

Đột biến phát sinh một cách tự phát trong quá trình nhân lên của vi rút làquá trình sao mã ngược của HBV, bản chất của sự sai sót này là enzymePolymerase thiếu đi khả năng đọc sửa lỗi sao chép trong quá trình sao chépvật liệu di truyền Tỷ lệ thay thế một nucleotide trong một chu kỳ sao chép làkhoảng 10-4 Hậu quả là xuất hiện các thế hệ biến thể vi rút mang đột biến,chúng tồn tại và nhân lên Về lý thuyết, tất cả các nucleotide của bộ gen HBVđều có khả năng bị thay thế hàng ngày ở bệnh nhân bị nhiễm HBV Như vậy,đột biến kháng thuốc có thể đã tồn tại trước đó ở những bệnh nhân bị nhiễmHBV nhưng chưa điều trị thuốc kháng vi rút (còn gọi là đột biến tự nhiên)

Áp lực chọn lọc của thuốc kháng virus có thể tác động đến quá trìnhchọn lọc các biến thể vi rút kháng thuốc trước đó Tốc độ chọn lọc gen kháng

thuốc chủ yếu phụ thuộc vào số lượng acid nucleic của vi rút đóng vai trò nhưnguồn dự trữ cho bộ gen của những vi rút mới.

Đột biến gen được cho là được lưu trữ trong cccDNA, là những phân tửxuất hiện trong nhân của tế bào gan bị nhiễm HBV và mang tính bảo thủ Độtbiến gen kháng thuốc được chọn lọc lúc đầu chỉ là những biến thể về gen,chúng cần phải có thời gian dài để phát triển thành quần thể ưu thế Quá trìnhnày phụ thuộc vào khả năng đột biến của virus trong môi trường có sự hiệndiện của thuốc kháng vi rút và không gian sao chép có sẵn trong gan để cácđột biến được nhân lên

Đối với CHB, không gian sao chép được cung cấp bởi số lượng tế bàogan Trong quá trình chọn lọc đột biến gen kháng thuốc, các tế bào gan bịnhiễm HBV type hoang dại sẽ dần biến mất, còn các tế bào gan chưa bị nhiễm

sẽ nhạy cảm với nhiễm HBV mới bị đột biến Nhưng những tế bào bị nhiễm

có thời gian sống dài nên chỉ có cơ hội rất nhỏ cho việc thay thế quần thể virút ban đầu bởi một quần thể mới của các biến thể vi rút kháng thuốc và nếu

có thì quá trình này thường rất chậm Đây là một trong những lý do tại saođộng lực chọn lọc kháng thuốc rất khác nhau giữa HBV và HIV

Động lực vi rút cũng là một trong những yếu tố quan trọng trong cơ chếchọn lọc đột biến kháng thuốc Đột biến gen P có thể làm giảm tính nhạy cảmcủa HBV với NUCs, nhưng để đạt được khả năng kháng thuốc cao thì cần cóquá trình bổ sung các đột biến sau đó Điều này được thể hiện trong trườnghợp với ETV Đột biến kháng thuốc đầu tiên tại rt204 và lần thứ 2 tại rt184,rt202 hoặc rt250 Nhiều đột biến kháng thuốc có liên quan với các đột biếnthêm vào để phục hồi khả năng sao chép của vi rút bị đột biến Như vậy, độnglực của vi rút không chỉ bao gồm khả năng sao chép các đột biến khi có sựhiện diện của NUCs mà còn có cả sự tác động ngược lại của các đột biến lênkhả năng sao chép đột biến

Biểu hiện đầu tiên của kháng thuốc là sự phát triển trở lại của vi rút.Nồng độ HBV-DNA có khuynh hướng thấp lúc đầu khi mới sử dụng thuốcbởi vì hầu hết các chủng kháng thuốc đều giảm sao chép đúng so với HBV tựnhiên.Tuy nhiên, sự đột biến bù có thể hồi phục lại việc sao chép với mức độnhanh hơn dẫn tới tăng nồng độ HBV-DNA cao hơn trước khi điều trị Việcphát triển trở lại của vi rút thường đi theo sau biến đổi về sinh hóa (tăng nồng

độ ALT) Đột biến nhanh chóng của chủng kháng thuốc có thể dẫn đến tìnhtrạng không đáp ứng lần đầu, một vài trường hợp có thể bị viêm gan nặng độtngột và viêm gan mất bù

Do bộ gen của HBV là những vùng đọc hiểu chồng lên nhau nên việcthay đổi một vị trí trên gen P cũng có thể tác động đến cấu trúc và chức năngcủa protein S Vì vậy, vài đột biến kháng thuốc liên quan Lamivudin có thểlàm thay đổi kháng nguyên của kháng nguyên bề mặt HbsAg

Tác động của đáp ứng miễn dịch kháng vi rút đặc hiệu đến chọn lọc độtbiến kháng thuốc chưa được biết rõ

Tỉ lệ chủng đột biến kháng thuốc có liên hệ với nồng độ HBV-DNAtrước khi điều trị, tốc độ ức chế vi rút, thời gian điều trị và các biểu hiện trướckhi điều trị NUCs Tỉ lệ kháng thuốc theo kiểu gen cũng khác nhau theo độnhạy của phương pháp được sử dụng để xác định chủng kháng và bệnh nhânđược xét nghiệm

Đột biến kháng thuốc có thể xác định được sau nhiều tháng hoặc vài nămtrước khi bùng phát về sinh hóa Do đó, việc xác định và can thiệp sớm có thểngăn chặn viêm gan nặng đột phát và viêm gan mất bù, điều này đặc biệt quantrọng ở những bệnh nhân bị ức chế miễn dịch và xơ gan

Hình 1 5 Polymerase/enzyme phiên mã ngược (Pol/rt) biểu thị đột biến thay thế kháng thuốc tiên phát liên quan đến các L-nucleoside (LMV và LdT), các acyclic phosphonate (ADV và TFV) và nhóm D-Cyclopentane

(ETV) *S/A/I/L/G/C/M [57]

1.6.3 Tỷ lệ kháng thuốc

Tỷ lệ kháng thuốc kháng vi rút của HBV đã giảm rõ cùng với sự pháttriển của các NUCs thế hệ mới Kháng LAM xuất hiện thường xuyên ở 80%bệnh nhân điều trị trong 5 năm [58],[59] Trong số những bệnh nhân đượcđiều trị bằng ADV thì tổng tỷ lệ kháng thuốc trên 5 năm là 29% với HBeAg (-)

và 42% với HBeAg (+) [60],[61] Tỷ lệ kháng Telbivudine thấp hơn nhưngcũng là con số đáng kể sau 2 năm điều trị: 25%với HBeAg (+) và 11% vớiHBeAg (-) [62] Điều trị lâu dài với ETV đơn trị liệu cho thấy kháng thuốccòn thấp 1,2% sau 6 năm điều trị [63] Kháng Tenofovir chưa được phát hiện

ở những bệnh nhân sau 4 năm điều trị [64] Tỷ lệ kháng ADV sau 5 năm điềutrị là 29 % [65]

ETV và Tenofovir đã được chứng minh là những thuốc có rào cản caođối với sự kháng thuốc của HBV Những thuốc có rào cản thấp đối với sựkháng thuốc sẽ có nguy cơ cao phát triển những đột biến đa kháng.

Bảng1.3.Tỷ lệ kháng thuốc kháng HBV theo năm ở bệnh nhân điều trị

1.6.4 Hậu quả kháng thuốc

Tình trạng kháng thuốc, đặc biệt là đa kháng, kháng chéo hiện nay đãgây ra những khó khăn cho điều trị CHB Sự phát triển đề kháng virus có thểdẫn đến đợt bùng phát virus, giảm tỷ lệ chuyển đổi huyết thanh HBeAg ởbệnh nhân HBeAg (+), cơn tái phát viêm gan khi đang và ngưng điều trị, tiếntriển mô học của bệnh gan.Cùng với sự phát triển mạnh của HBV, bệnh lý vềgan diễn biến phức tạp và nhanh chóng tiến triển đến suy gan cấp, xơ gan,ung thư gan, tử vong [59],[66],[67]

1.6.5 Phân loại kháng thuốc

Cho đến nay, nhiều loại đột biến kháng thuốc của HBV đã được các nhà

khoa học phát hiện và tất cả các đột biến này đều nằm trên vùng sao chép ngượccủa gene P Gene P được chia thành 7 vùng (domains), được sắp xếp từ A đến G.Các đột biến kháng thuốc cơ bản trên gene P của HBV, dẫn đến sự thay đổi các

bộ ba mật mã (codons), nghĩa là làm thay đổi các acid amin trong chuỗipolypeptide của enzyme reverse polymerase (rt) Sự thay đổi các acid amin trongcác đột biến kháng thuốc thường gặp là: rtL80I/V (trên vùng A), rtI169T,rtV173L, rtL180M, rtA181T/V/S, rtT184A/S/G/C (trên vùng B), rtA194T,rtS202C /G/I , rtM204V/I (trên vùng C), rtN236T (trên vùng D), và rtM250V(trên vùng E) Các thay đổi acid amin này có thể riêng lẻ hoặc kết hợp, tạo nênmức độ kháng thuốc khác nhau của các chủng HBV kháng thuốc này

Các đột biến kháng thuốc trong quá trình điều trị một thuốc duy nhất(monotherapy) [68],[69],[70] là:

1 Các đột biến kháng Lamivudine gồm: rtL180M + rtM204V/I/S,rtM204I, rt80VI + rtM204I, rtV173L + rtL180M + rtM204V, rtI169T +rtV173L + rtL180M + rtM204V/, rtA181T, rtT184S + rtL180M + rtM204Vhoặc rtQ215S + rtL180M + rtM204V

2 Các đột biến kháng Adefovir gồm: rtN236T, rtA181V/T, rtV84M/rtS85A/ rtL80V/I hoặc rtV214A/ rtQ215S

3 Các đột biến kháng Entercavir: rtI169T + ntV173L + rtL180M +rtT184G + rtM204V, rtI169T + ntV173L + rtL180M + rtM204V + rtM250Vhoặc có sự kết hợp các đột biến ở các codon 184, 202 và 250

4 Các đột biến kháng Telbivudine gồm: rtM204I hoặc có các đột biếnliên quan đến kháng Lamivudine

5 Các đột biến kháng Tenofovir gồm: rtL180M + rtA194T + rtM204V,rtV204A, rtQ215S hoặc rtA181V + rtM204I

Các đột biến kháng đa thuốc khi điều trị phối hợp (combination therapy)

từ hai thuốc trở lên gồm các nhóm [68],[69],[70]

Nhóm 1 : Các đột biến kháng đa thuốc Lamivudine + Adefovir gồm: rtM204I + rtL180M

1.7 Các kỹ thuật xét nghiệm sử dụng trong xác định đột biến kháng thuốc của HBV

1.7.1 Realtime PCR [71],[72]

Phản ứng tổng hợp chuỗi thời gian thực (Real time PCR) hay còn đượcgọi là phản ứng tổng hợp chuỗi định lượng là một kĩ thuật về sinh học phân tửđược sử dụng trong phòng thí nghiệm dựa trên phản ứng tổng hợp chuỗi(Polymerase chain reaction-PCR) Kĩ thuật này được sử dụng nhằm khuếchđại và cùng lúc xác định được số lượng của phân tử DNA đích

Quy trình thí nghiệm theo nguyên tắc thông thường của phản ứng tổnghợp chuỗi, trong đó đặc điểm chính là đoạn DNA được nhân lên sẽ được pháthiện trong thời gian thực (real time) Đây là phương pháp tiếp cận mới so vớiphản ứng PCR thông thường-khi mà sản phẩm chỉ được xác định khi phảnứng đã kết thúc

Realtime PCR cho phép phát hiện và định lượng nồng độ sản phẩm saumỗi chu kỳ nhiệt dựa trên cường độ phát huỳnh quang Mức độ nhiễm đượcđịnh lượng bằng số bản sao HBV DNA trên một đơn vị HBV – DNA là căn

cứ để điều trị viêm gan B hay không, khi được phát hiện vượt ngưỡng 104-105copies/ ml máu thì người bệnh cần phải được điều trị Trong quá trình điều trị,người bệnh thường phải kiểm tra định kì từ 3-6 tháng/ lần và xét nghiệm HBVDNA cũng là xét nghiệm không thể thiếu Xét nghiệm này giúp theo dõi đượchiệu quả điều trị bệnh Nếu vi rút có dấu hiệu tăng trở lại và không ngừngphát triển có nghĩa là vi rút có thể đã kháng thuốc Trình tự HBV đột biến cóthể được khuếch đại và phát hiện nhờ kỹ thuật realtime PCR

Kỹ thuật realtime PCR so với PCR - điện di: Có thao tác đơn giản vàthời gian ngắn hơn, độ nhạy và đặc hiệu cao hơn; tránh được ngoại nhiễm sảnphẩm PCR dẫn đến dương tính giả Hơn nữa Kit real-time có thể sử dụng cho

cả mục đích định tính và định lượng

Một số dòng máy Realtime PCR đã và đang được sử dụng phổ biến tạiViệt Nam

1 Máy ABI 7500, 7500 Fast, 7500 Fast Dx

2 Máy CFX96 – Bio-Rad

3 Máy MX3000P Agilent – Stratagene

4 Máy Rotor-Gene – Qiagen

5 Máy của Eppendorf

6 Máy của Roche

1.7.2 Giải trình tự gen [71]

Giải trình tự gen là tìm ra trình tự sắp xếp các nucleotide trên đoạn genđược quan tâm Khi ứng dụng vào nghiên cứu HBV, trình tự các nucleotideđược xác định và được so sánh với thư viện gen, từ đó xác định được HBVgenotype và một số đột biến kháng thuốc của HBV, đưa ra được phác đồ điềutrị tối ưu

Năm 1975, kỹ thuật giải trình tự gen (nguyên lý enzym) được công bốbởi Sanger và đến năm 1977, Maxam- Gilbert công bố kỹ thuật giải trình tựgen dựa trên nguyên lý phân giải hóa học Hiện nay, các kỹ thuật này đã đượccải tiến rất nhiều nhờ những tiến bộ mới về khoa học và công nghệ, làm chohiệu suất của giải trình tự gen ngày càng cao, một trình tự dài hàng nghìn cặpbase có thể được phiên giải trong vài tiếng đồng hồ thay vì hàng tuần nhưtrước đây

So sánh kỹ thuật giải trình tự gen và realtime PCR thấy realtime PCR chỉ

có thể phát hiện được rất ít các đột biến kháng thuốc của HBV vì có quá nhiềucác biến thể của HBV đã làm cho việc thiết kế các probe phát hiện hay thiết

kế các vị trí để enzym cắt giới hạn nhận diện bị khó khăn rất nhiều Giải trình

tự gen do đó sẽ có ưu điểm hơn trong việc xác định kiểu gen và các đột biếnkháng thuốc

Một số hệ thống giải trình tự gen hiên đang sử dụng tại Việt Nam

1 Hệ thống giải trình tự và phân tích đoạn ABI 3500, nhà sản xuất:

Applied Biosystem - Mỹ/Nhật

2 Hệ thống OpenGene

3 Máy giải trình tự gen Pyromark Q24 hãng Qiagen Đức

1.8 Một số nghiên cứu về đột biến kháng thuốc điều trị viêm gan B mạn tính ở Việt Nam

Đột biến kháng thuốc điều trị viêm gan B ở Việt Nam đã được nghiêncứu khá nhiều Một số nghiên cứu có thể kể đến như:

- Nghiên cứu của Hồ Tấn Đạt cùng đồng nghiệp từ tháng 8/2004 đếntháng 5/2006, tại phòng xét nghiệm Trung Tâm Y Khoa MEDIC, kỹ thuật giảitrình tự chuỗi được ứng dụng để xác định kiểu gen và các đột biến khángthuốc của siêu vi viêm gan B trên 122 bệnh nhân viêm gan B mạn tính đangđiều trị Lamivudine Nghiên cứu xác định được 2 kiểu gen của HBV là kiểugen B và C, trong đó kiểu gen B là 62,3% và kiểu gen C là 37,7% Tổng cộng

có 63,9% có đột biến kháng Lamivudine Trong đó, tỷ lệ có đột biến khángLamivudine sau 1, 2, 3, 4 năm điều trị Lamivudine là 27,8%; 63,4%; 71,1%;83,3% [10]

- Năm 2010, Lê Thị Dung xây dựng quy trình phát hiện đột biếnrtA181V/T và rtN236T kháng adefovir của HBV bằng kỹ thuật realtime PCR,xác định được 45,11% ca xuất hiện đột biến kháng ADV Trong đó, đột biếnrtA181V chiếm 5,71%; đột biến rtN236T chiếm 5,71% và đột biến rtA181Tchiếm 11,43% [11]

- Lao Đức Thuận- Trương Kim Phượng cùng đồng nghiệp nghiên cứuứng dụng kỹ thuật Realtime-PCR để xác định kiểu gen, lượng vi rút trongmáu và đặc điểm kháng thuốc điều trị của vi rút viêm gan B trên người bệnhcủa bệnh viện đa khoa Đồng Tháp năm 2014 Kết quả:

+ kiểu gen nhiễm: kiểu gen B nhiều hơn kiểu gen C, đồng nhiễm cảhai kiểu gen B và C

+ đột biến kháng LAM và ADV đi kèm với tỷ lệ HBeAg dương tínhcao và ngược lại

+ bệnh nhân có đột biến kháng thuốc có tải lượng vi rút cao cả trongtrường hợp kháng LAM và ADV

Ngoài ra, còn rất nhiều các nghiên cứu khác:

- Ứng dụng kỹ thuật Realtime PCR sử dụng Displacing Probe để chẩnđoán hiện tượng HBV kháng thuốc Lamivudine ở bệnh nhân mắc bệnh viêmgan B (2000) Đỗ Hữu Nhật ĐH Nông Lâm-TP Hồ Chí Minh

- Định enotyp và phát hiện đột biến YMDD kháng lamivudine của HBVbằng kỹ thuật giải trình tự vùng gene rt của HBV(2006) Phạm Hùng Vân-Nguyễn Thị Minh Thư và đồng nghiệp Đại học Y Dược- Công ty Nam Khoa

- Sử dụng kỹ thuật PCR- RFLP để phát hiện đột biến khángLamivudine và đột biến basal core promoter của vi rút viêm gan B (2008).Nguyễn Chí Vinh Bệnh Viện ĐH Y Dược TP.HCM

- Ứng dụng kỹ thuật Realtime-PCR để xác định kiểu gen, lượng virustrong máu và đặc điểm kháng thuốc điều trị của vi rút viêm gan B trên ngườibệnh của bệnh viện đa khoa Đồng Tháp Lao Đức Thuận- Trương KimPhượng cùng đồng nghiệp Tạp chí Khoa học Trường Đại học Mở TP Hồ ChíMinh Số 6(39)2014

1.9 Tình hình bệnh nhân đến khám và điều trị viêm gan B mạn tính tại bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới Trung Ương

Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương là một trong những tuyến caonhất khám, chữa bệnh và phục hồi các chức năng về bệnh truyền nhiễm vànhiệt đới, trong đó có các bệnh về gan do HBV Khoa xét nghiệm của bệnhviện được đầu tư các trang thiết bị hiện đại như xét nghiệm căn nguyên vi rútbằng PCR, RT-PCR dùng để định lượng vi rút viêm gan B, hệ thống giải trình

tự để xác định đột biến kháng thuốc, từ đó hỗ trợ điều trị hiệu quả

Trung bình một tháng có khoảng 2500 đến 3000 bệnh nhân viêm gan Bđến khám và điều trị tại bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới Trung Ương với nhiều độtuổi khác nhau, ở nhiều tỉnh thành khác nhau, con đường lây nhiễm khác nhau

và tình trạng bệnh không giống nhau Trong số đó, một số loài HBV có cácđột biến liên quan đến kháng thuốc điều trị HBV ở bệnh nhân viêm gan mạn

đã được xác định

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU