XÁC ĐỊNH đột BIẾN LIÊN QUAN đến KHÁNG THUỐC ở BỆNH NHÂN VIÊM GAN b mạn TÍNH tại BỆNH VIỆN BỆNH NHIỆT đới TRUNG ƯƠNG (12014 122017)

Từ tháng 8/2004 đến tháng5/2006, Hồ Tấn Đạt cùng đồng nghiệp đã ứng dụng kỹ thuật giải trình tự gen để xác định kiểu gen và các đột biến kháng thuốc của HBV trên 122 bệnhnhân viêm gan B

TRỊNH THỊ HẰNG

X¸C §ÞNH §éT BIÕN LI£N QUAN §ÕN KH¸NG THUèC

ë BÖNH NH¢N VI£M GAN B M¹N TÝNH T¹I BÖNH

VIÖN BÖNH NHIÖT §íI TRUNG ¦¥NG (1/2014-12/2017)

LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC

ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

TRỊNH THỊ HẰNG

X¸C §ÞNH §éT BIÕN LI£N QUAN §ÕN KH¸NG THUèC

ë BÖNH NH¢N VI£M GAN B M¹N TÝNH T¹I BÖNH

VIÖN BÖNH NHIÖT §íI TRUNG ¦¥NG (1/2014-12/2017)

Trong quá trình học tập và làm luận văn, tôi đã nhận được sự quan tâm, giúp đỡ rất nhiều của nhà trường, cơ quan, gia đình và bạn bè.

Tôi xin chân thành cảm ơn:

- Ban Giám hiệu, Bộ môn Vi sinh, Phòng Đào tạo sau Đại học Trường Đại học Y Hà Nội.

- Khoa Vi sinh và sinh học phân tử Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương.

- Khoa Khám bệnh Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương.

Đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn tốt nghiệp.

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn:

- PGS TS Nguyễn Vũ Trung, người Thầy đã luôn tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn.

- TS Lê Văn Duyệt, người Thầy trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện nghiên cứu Cảm ơn Thầy đã tận tình chỉ dẫn và truyền đạt cho tôi những kiến thức và kinh nghiệm trong quá trình làm khoa học.

- PGS.TS Vũ Tường Vân, PGS.TS Lê Hồng Hinh, TS Phạm Hồng Nhung, TS Nguyễn Kim Thư, TS Trần Minh Châu, là những Thầy trong Hội đồng chấm Luận văn đã đóng góp nhiều ý kiến quý báu để tôi hoàn thành Luận văn.

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã dành

sự quan tâm, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập.

Hà Nội, ngày 18 tháng 9 năm 2019

Tôi là Trịnh Thị Hằng, học viên cao học khóa 25, chuyên ngành Vi

sinh Y học, Trường Đại học Y Hà Nội xin cam đoan:

1 Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn

của Thầy PGS-TS Nguyễn Vũ Trung và TS Lê Văn Duyệt.

2 Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đãđược công bố tại Việt Nam

3 Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác,trung thực và khách quan, đã được xác nhận và chấp nhận của cơ sởnơi nghiên cứu cho phép lấy số liệu

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những cam kết này

Hà Nội, ngày 18 tháng 9 năm 2019

Người viết cam đoan

Trịnh Thị Hằng

ADV Adefovir

ALT Amino alanin transferase

AntiHBc Kháng thể kháng kháng nguyên lõi vi rút viêm gan BAntiHBe Kháng thể kháng kháng nguyên e vi rút viêm gan B

AntiHBs Kháng thể kháng kháng nguyên bề mặt vi rút viêm gan BAST Aspartate Transaminase

DNA Axit deoxyribonucleic

ETV Entercavir

FTC Emtricitabine

GGT Gamma Glutamyl transferase

HBcAg Kháng nguyên lõi vi rút viêm gan B

HBeAg Kháng nguyên e vi rút viêm gan B

HBsAg Kháng nguyên bề mặt vi rút viêm gan B

NUCs Các thuốc điều trị vi rút viêm gan B loại đồng phân nucleosides

Pg RNA RNA trung gian

RT Reverse Transcriptase

TDF Tenofovir

TP Terminal protein

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Dịch tễ học 3

1.1.1 Tình hình nhiễm HBV trên thế giới 3

1.1.2 Tình hình nhiễm HBV ở Việt Nam 3

1.2 Đặc điểm vi rút viêm gan B 4

1.2.1 Cấu trúc HBV 4

1.2.2 Quá trình nhân lên của HBV 8

1.2.3 Phân loại HBV theo kiểu gen 9

1.2.4 Mối liên quan giữa kiểu gen của HBV và hiệu quả điều trị thuốc kháng vi rút Nucleosides 10

1.3 Các marker huyết thanh của HBV và ý nghĩa 11

1.4 Chẩn đoán viêm gan vi rút B mạn (theo hướng dẫn của Bộ Y tế năm 2019 12

1.5 Điều trị viêm gan B mạn tính 12

1.5.1 Chỉ định điều trị 12

1.5.2 Nguyên tắc điều trị 12

1.5.3 Mục tiêu điều trị 12

1.5.4 Các thuốc điều trị 12

1.5.5 Theo dõi điều trị khi bệnh nhân đang điều trị bằng thuốc kháng vi rút NUCs 13

1.5.6 Đánh giá thất bại điều trị 14

1.6 Tình trạng kháng thuốc 14

1.6.1 Quản lý kháng thuốc kháng vi rút của HBV 14

1.6.4 Hậu quả kháng thuốc 19

1.6.5 Phân loại kháng thuốc 19

1.7 Các kỹ thuật xét nghiệm sử dụng trong xác định đột biến kháng thuốc của HBV 20

1.7.1 Realtime PCR 20

1.7.2 Giải trình tự gen 22

1.8 Một số nghiên cứu về đột biến kháng thuốc điều trị viêm gan B mạn tính ở Việt Nam 22

1.9 Tình hình bệnh nhân đến khám và điều trị viêm gan B mạn tính tại bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương 24

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Đối tượng nghiên cứu 25

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 25

2.3 Phương pháp nghiên cứu 25

2.3.1 Thiết kế nghiên kế 25

2.3.2 Phương pháp chọn mẫu 25

2.3.3 Các biến số, chỉ số nghiên cứu 26

2.3.4 Quy trình nghiên cứu 29

2.3.5 Phương pháp thu thập thông tin 30

2.4 Các kỹ thuật xét nghiệm sử dụng trong nghiên cứu 30

2.4.1 Kỹ thuật đo tải lượng HBV 30

2.4.2 Kỹ thuật xác định đột biến kháng thuốc 30

2.5 Nhập và xử lý số liệu 31

2.6 Đạo đức nghiên cứu 31

2.7 Hạn chế của đề tài 32

3.1.1 Đặc điểm chung của nhóm bệnh nhân 33

3.1.2 Kết quả xét nghiệm sinh hóa, miễn dịch và chẩn đoán hình ảnh 37

3.1.3 Đặc điểm đột biến của HBV 45

3.2 Các mối liên quan với đột biến kháng thuốc 50

3.2.1 Mối liên quan giữa đột biến kháng thuốc với phác đồ điều trị 50

3.2.2 Mối liên quan giữa đột biến kháng thuốc với thời gian điều trị 51

3.2.3 Mối liên quan giữa kháng thuốc với mức độ xơ gan 52

3.2.4 Mối liên quan giữa kháng thuốc với HBeAg 52

3.2.5 Mối liên quan giữa đột biến kháng thuốc với tải lượng HBV 53

3.2.6 Mối liên quan giữa đột biến kháng thuốc với kiểu gen HBV 53

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 54

4.1 Đột biến kháng thuốc của HBV 54

4.2 Mối liên quan giữa đột biến kháng thuốc của HBV và phác đồ điều trị, một số yếu tố khác 65

4.2.1 Mối liên quan giữa đột biến kháng thuốc của HBV và phác đồ điều trị 65

4.2.2 Mối liên quan giữa đột biến kháng thuốc của HBV và thời gian điều trị69 4.2.3 Mối liên quan giữa đột biến kháng thuốc của HBV và tải lượng vi rút 70

KẾT LUẬN 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Bảng 1.1 Phân bố địa lý của HBV theo kiểu gen và subtype 10

Bảng 1.2 Tóm tắt các dấu ấn huyết thanh của nhiễm HBV và ý nghĩa 11

Bảng1.3 Tỷ lệ kháng thuốc kháng HBV theo năm ở bệnh nhân điều trị NUCs 18 Bảng 3.1 Thời gian điều trị trung bình của các bệnh nhân theo các phác đồ điều trị 37

Bảng 3.2 Tỷ lệ mức độ AST/ALT 37

Bảng 3.3 Tỷ lệ Bilirubin toàn phần 38

Bảng 3.4 Tỷ lệ bệnh nhân theo chỉ số AFP 38

Bảng 3.5 Tỷ lệ Prothrombin 39

Bảng 3.6 Tỷ lệ INR 40

Bảng 3.7 Các chỉ số công thức máu 40

Bảng 3.8 Tần số bệnh nhân nhiễm các chủng HBV có các đột biến kháng NUCs 45

Bảng 3.9 Kháng đơn thuốc ở nhóm 70 đối tượng nghiên cứu 47

Bảng 3.10 Tần số đột biến kháng đa thuốc của HBV 47

Bảng 3.11 Tình trạng đột biến kháng thuốc và phác đồ điều trị 48

Bảng 3.12 Phân bố các dạng đột biến kháng thuốc của HBV theo phác đồ điều trị 49

Bảng 3.13 Các thuốc NUCs bị kháng theo dạng kháng thuốc và phác đồ điều trị50 Bảng 3.14 Mối tương quan về tình trạng đột biến kháng thuốc của HBV giữa 2 phác đồ điều trị TDF (1viên/ngày) và ETV (1viên/ngày) 50

Bảng 3.15 Mối liên quan giữa tình trạng đột biến kháng thuốc của HBV với thời gian điều trị bằng phác đồ ETV (1 viên/ngày) 51

Bảng 3.16 Mối liên quan giữa dạng đột biến kháng thuốc của HBV với thời gian điều trị bằng phác đồ ETV 51

Bảng 3.18 Mối liên quan giữa tình trạng đột biến kháng thuốc của HBV với

tình trạng HBeAg .52Bảng 3.19 Mối liên quan giữa tình trạng đột biến kháng thuốc của HBV với tải

lượng HBV 53Bảng 3.20 Mối liên quan giữa tình trạng đột biến kháng thuốc của HBV với

kiểu gen của HBV 53

Hình 1.1 Cấu trúc của vi rút viêm gan B 4

Hình 1.2 Cấu trúc bộ gen của HBV 5

Hình 1.3 Polymerase Protein của HBV 7

Hình 1.4 Vòng đời của HBV trong tế bào gan 9

Hình 1 5 Polymerase/enzyme phiên mã ngược 17

Biểu đồ 3.1 Tỷ lệ bệnh nhân theo tuổi 33

Biểu đồ 3.2 Phân bố bệnh nhân theo giới tính 34

Biểu đồ 3.3 Tỷ lệ bệnh nhân theo lý do vào viện 34

Biểu đồ 3.4 Tỷ lệ bệnh nhân theo thời gian nhiễm HBV 35

Biểu đồ 3.5 Tỷ lệ bệnh nhân theo phác đồ điều trị 36

Biểu đồ 3.6 Tỷ lệ bệnh nhân theo tình trạng HBeAg 39

Biểu đồ 3.7 Tỷ lệ bệnh nhân theo chỉ số Fibro-S 41

Biểu đồ 3.8 Tỷ lệ bệnh nhân theo chỉ số Fibro-F 42

Biểu đồ 3.9 Tỷ lệ bệnh nhân theo tải lượng HBV 43

Biểu đồ 3.10 Tỷ lệ bệnh nhân theo kiểu gen 44

Biểu đồ 3.11 Tỷ lệ đột biến kháng thuốc của HBV 45

Biểu đồ 3.12 Tỷ lệ kháng thuốc ở nhóm bệnh nhân nghiên cứu 46

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nhiễm vi rút viêm gan B (Hepatitis B virus-HBV) có nguy cơ dẫn đếnmột số biến chứng nguy hiểm như suy gan, xơ gan và ung thư gan Theothống kê của Tổ chức Y tế Thế giới, đến năm 2015, có khoảng 257 triệungười nhiễm HBV (HBsAg dương tính) và số người tử vong liên quan đếnnhiễm HBV là 887 000 [1] HBV và các bệnh do vi rút này gây ra hiện đang

là vấn đề sức khỏe toàn cầu, không chỉ bởi tỷ lệ người nhiễm cao, kèm theocác biến chứng nguy hiểm mà còn do sự lây truyền nhanh trong cộng đồng.HBV có thể lây truyền qua tổn thương ở da, niêm mạc có tiếp xúc với máu,dịch của người mang HBV, qua con đường truyền máu, dùng chung bơm kimtiêm, quan hệ tình dục không an toàn, và đặc biệt là qua quá trình chu sinh[1] Ở các nước có tỷ lệ bệnh lưu hành cao, chu sinh là con đường lây truyền

cơ bản và hơn 90% trẻ bị nhiễm HBV trong giai đoạn này sẽ diễn biến mạntính do hệ thống miễn dịch chưa hoàn thiện [2], [3] Mặc dù đã có vắc xinhiệu quả, nhưng tỷ lệ người nhiễm HBV vẫn còn cao Việt Nam cũng là mộttrong những nước có tỷ lệ nhiễm HBV cao, với khoảng 10-20% dân số bịnhiễm Trong đó, HBV gây ra 49,7% trường hợp viêm gan cấp, 87,6% trườnghợp xơ gan và 57,6%-80% số ca bị ung thư gan [8]

Trước thực trạng trên, việc phát hiện và điều trị viêm gan B mạn tính trởnên vô cùng quan trọng nhằm ngăn ngừa và giảm nguy cơ tử vong cho bệnhnhân Hiện nay, có 2 nhóm thuốc được công nhận trong điều trị viêm gan Bmạn là Interferon và các đồng phân Nucleotides [4] Tuy nhiên, với liệu phápmiễn dịch, điều trị bằng Interferon, tỷ lệ đáp ứng thấp, dưới 40% [5] Do đó,những liệu pháp kháng vi rút hiệu quả được xem là cần thiết trong điều trịviêm gan B Các đồng phân nucleotides có tác dụng ức chế sự tăng sinh của

vi rút trong thời gian dài, với mức độ khác nhau tùy loại thuốc, ít tác dụngphụ, làm chậm diễn biến của bệnh, cải thiện tỷ lệ sống và giảm nguy cơ biếnchứng cho bệnh nhân [4]

Trong quá trình điều trị bằng thuốc kháng vi rút, dưới áp lực chọn lọc củathuốc, các dòng vi rút có đột biến kháng thuốc sẽ xuất hiện và lan rộng, gây

nên tình trạng kháng thuốc, dẫn đến thất bại điều trị Các xét nghiệm xác địnhtình trạng kháng thuốc của HBV cùng với việc xác định gen kháng thuốc có ýnghĩa chiến lược trong điều trị và kiểm soát bệnh ở Việt Nam Cho đến nay,

đã có khá nhiều nghiên cứu về vấn đề này Từ tháng 8/2004 đến tháng5/2006, Hồ Tấn Đạt cùng đồng nghiệp đã ứng dụng kỹ thuật giải trình tự gen

để xác định kiểu gen và các đột biến kháng thuốc của HBV trên 122 bệnhnhân viêm gan B mạn tính đang điều trị LAM Nghiên cứu xác định được 2kiểu gen của HBV là kiểu gen B và C với tỷ lệ lần lượt là 62,3% và 37,7%.Đột biến kháng LAM chiếm 63,9%, trong đó, tỷ lệ đột biến kháng LAM sau

1, 2, 3, 4 năm điều trị LAM là 27,8%; 63,4%; 71,1%; 83,3% [6] Năm 2010,

Lê Thị Dung xây dựng quy trình phát hiện đột biến rtA181V/T và rtN236Tkháng ADV của HBV bằng kỹ thuật realtime PCR, xác định được 45,11%bệnh nhân xuất hiện đột biến kháng ADV Trong đó, đột biến rtA181V chiếm5,71%; đột biến rtN236T chiếm 5,71% và đột biến rtA181T chiếm 11,43%[7] Tại bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương, trong quá trình theo dõi, quản

lý bệnh nhân viêm gan B được điều trị bằng các thuốc kháng vi rút, chúng tôinhận thấy không ít những trường hợp thất bại điều trị do kháng thuốc Tuynhiên, cho đến nay vẫn chưa có thống kê đầy đủ về một số đột biến liên quan

đến kháng thuốc điều trị viêm gan B Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Xác định đột biến liên quan đến kháng thuốc của HBV ở bệnh nhân viêm gan

B mạn tính tại bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương (1/2014-12/2017)”

với mục tiêu sau:

Xác định đột biến kháng thuốc của HBV và mối liên quan với các phác

đồ điều trị ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Dịch tễ học

1.1.1 Tình hình nhiễm HBV trên thế giới

Theo thống kê của WHO, trên thế giới có khoảng 257 người nhiễm HBV(HBsAg dương tính), năm 2015 có 887.000 người tử vong do các biến chứngcủa nhiễm HBV [1]

Tỷ lệ nhiễm HBV trên thế giới thay đổi theo các vùng địa lý khác nhau,

từ 2-20% [8] Ở châu Á (đặc biệt là Đông Nam Á, Trung Quốc, Phillipin,Indonesia), Trung Đông, châu Phi và một số vùng Nam Mỹ, tỷ lệ nhiễm HBV

ở mức độ cao, từ 8-15% [9] Vùng có tỷ lệ nhiễm HBV trung bình 2-7% làNhật Bản, Nam Mỹ, Đông Âu, Nam Âu và một phần trung tâm châu Á Với

số người nhiễm HBV dưới 2% dân số, các nước Bắc Âu, Úc, phía Nam Nam

Mỹ, Canada và Mỹ là những quốc gia có tỷ lệ nhiễm HBV thấp nhất [10].Qua nghiên cứu, con đường lây truyền HBV ở các nước châu Á chủ yếu

là lây truyền dọc từ mẹ sang con trong thời kỳ chu sinh Trong khi đó, lâytruyền ngang lại là con đường chính ở châu Phi và các nước phương Tây [8] Hậu quả lâu dài của nhiễm HBV mạn tính cũng rất khác nhau giữa cácđối tượng Tỷ lệ xơ gan hàng năm ước tính 2-6% ở những bệnh nhân viêmgan B mạn có HBeAg dương tính và 8-10% với HBsAg âm tính Bên cạnh

đó, tỷ lệ ung thư gan hàng năm ở những người nhiễm HBV không xơ gan làdưới 1% trong khi tỷ lệ này ở những bệnh nhân xơ gan là 2-3% [11], [12]

1.1.2 Tình hình nhiễm HBV ở Việt Nam

Tính đến năm 2005, Việt Nam có khoảng 8,4 triệu người nhiễm vi rútHBV mạn tính và có 233.000 người chết do các bệnh liên quan như viêm gan

B cấp và mạn, xơ gan, suy gan, ung thư gan do HBV [13]

Theo nghiên cứu của Hipgrave và cộng sự về phân bố tỷ lệ nhiễm HBVtheo tuổi ở Việt Nam, tỷ lệ nhiễm ở trẻ sơ sinh là 12,5%, trẻ nhỏ là 18,4%,thanh thiếu niên là 20,5%, người lớn là 18,8% [14] Sự thay đổi theo tuổi nàycho thấy ở nước ta, đường lây truyền từ mẹ sang con chiếm một tỷ lệ lớntrong việc lây truyền HBV.

Những đối tượng có nguy cơ lây nhiễm HBV cao cũng đã được nghiêncứu về tỷ lệ mang HBsAg:

• 12,4% ở nhóm nhân viên Y tế [15]

• 21,1% ở nhóm cho máu nhiều lần [16]

• 19,2% ở nhóm tiêm chích và mại dâm [17]

• 24,7% ở nhóm HIV dương tính [18]

Những số liệu nói trên là những minh chứng cho thấy Việt Nam là mộttrong những nước có tỷ lệ HBV lưu hành cao HBV không chỉ là mối lo ngạicủa ngành y tế mà của toàn xã hội Chi phí điều trị tốn kém đã trở thành gánhnặng cho nhiều gia đình, ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống

1.2 Đặc điểm vi rút viêm gan B

1.2.1 Cấu trúc HBV

Hình 1.1 Cấu trúc của vi rút viêm gan B [19]

HBV thuộc họ Hepadnaviridae, là một loại vi rút hướng gan, có vật liệu

di truyền là DNA Một hạt virion hoàn chỉnh còn gọi là tiểu thể Dane, có cấutrúc hình cầu, đường kính khoảng 42 nm, gồm 3 lớp:

Lớp ngoài cùng là lớp lipid kép gắn nhiều protein bề mặt S, M, L(HBsAg trong huyết thanh)

Giữa là lớp vỏ nucleocapsid đường kính 27nm và có hình lăng trụ, đượccấu thành từ 240 protein lõi (HBcAg trong huyết thanh)

Lớp trong cùng có chứa cấu trúc DNA kép không hoàn chỉnh, đóng vònggọi là RC- DNA (relaxed circle DNA) và DNA polymerase [20],[21]

1.2.1.1 Cấu trúc bộ gen HBV

Hình 1.2 Cấu trúc bộ gen của HBV

DNA kép được biểu thị bằng các đường đen đậm Sợi DNA (-) là đường đen đậm, liền, có đầu 5’ liên kết hóa trị với P Sợi DNA (+) là đường đen đậm có nét đứt, có đầu 5’ liên kết với RNA primer (đường zíc zắc) Vòng tròn bên ngoài là biểu thị của pgRNA với ε ở đầu 5’ và đuôi poly A ở đầu 3’ Các vị trí tương đối

của các khung đọc mở được biểu thị ở bên trong [22].

Bộ gen của HBV là phân tử DNA kép mạch vòng không hoàn chỉnh vớimột sợi DNA mang mã hóa không hoàn chỉnh (sợi dương) và một sợi DNAmang mã hóa hoàn chỉnh (sợi âm), có kích thước khoảng 3,2 kb Sợi DNAdương liên kết với một oligonucleotide ở đầu 5’, còn sợi DNA âm có đầu 5’liên kết với Polymerase protein của vi rút [23]

Dựa trên sự so sánh các chuỗi DNA của các dòng HBV khác nhau, có ítnhất 4 khung đọc mở (ORFs) bảo tồn được tìm thấy trong bộ gen của HBV

Gen polymerase (gen P) là vùng đọc mở lớn nhất, mã hóa cho protein P đa chức năng Cùng với gen P còn có 6 gen khác Gen C mã hóa cho nucleocapsid và HBcAg, gen PreC mã hóa cho HBeAg, gen X mã hóa cho protein X (HBX), và 3 gen PreS1, PreS2, PreS mã hóa cho các protein bề mặt

là LHBs, MHBs, SHBs [24]

1.2.1.2 Hepatitis B Polymerase Protein

Vùng đọc mở lớn nhất của bộ gen của HBV mã hóa cho polymeraseprotein của HBV Protien P có kích thước khoảng 90 kD, được cấu thành từ

838 axit amin, rất giàu histidine, được xem là một emzym đa chức năng vớicác hoạt tính chính như: vai trò làm đoạn mồi cho quá trình sao mã, DNApolymerase và enzym phiên mã ngược Protein P được tạo nên bởi 3 vùngchức năng và một vùng đệm có thể thay đổi Phần N-terminus của proteinđóng vai trò như đoạn mồi (Primase), khởi đầu cho quá trình tổng hợp sợiDNA âm Vùng này còn gọi là terminal protein (TP) [25], [26], [27] Vùngđệm (Spacer) nằm giữa vùng TP và vùng RT (Reverse Transcriptase), là phầnkhông thể thiếu được cho quá trình đóng gói RNA trung gian (pg RNA) [28].Vùng RT chịu trách nhiệm cho quá trình sao mã bộ gen thông qua quá trìnhsao mã ngược từ pgRNA thành sợi DNA âm của bộ gen và sau đó, sợi âm này

sẽ được sử dụng làm khuôn mẫu để tổng hợp sợi DNA dương Vùng RT hiệntại là đích tác động duy nhất của liệu pháp kháng vi rút sử dụng trong điều trị

viêm gan B [29] Cuối cùng là vùng RNase H nằm ở đầu carboxyl, chịu tráchnhiệm tiêu hủy khuôn mẫu pg RNA trong suốt quá trình tổng hợp sợi DNA

âm Các nghiên cứu cũng đã chỉ ra rằng vùng Rnase H cũng quan trọng đốivới quá trình đóng gói pg RNA [30]

Protein P cũng là thành phần cấu trúc của vi rút vì nó được đưa vào nhân

tế bào chủ, phục vụ cho việc sao chép pha sớm [21]

Hình 1.3 Polymerase Protein của HBV [31].

Polymerase protein gồm các vùng: Terminal, Spacer, RNAse H và RT Trên

RT có các vị trí tác động của thuốc NUCs là G FA B C D E

1.2.2 Quá trình nhân lên của HBV

Đầu tiên, hạt vi rút gắn với tế bào gan qua một thụ thể đặc hiệu dành choIgA trên bề mặt tế bào gan Sau khi cởi bỏ vỏ ngoài, phần nucleocapsid của virút xâm nhập vào bào tương và di chuyển đến nhân tế bào Tại đây,nucleocapsid cởi vỏ capsid, còn DNA kép với hai sợi không bằng nhau thìchui vào trong nhân

Trong nhân tế bào, gen của vi rút được chuyển thành dạng vòng khépkín, siêu xoắn (cccDNA) Vi rút sử dụng RNA polymerase II của vật chủ

và cccDNA làm khuôn mẫu để tổng hợp 4 loại RNA Pregenome RNA(pgRNA) có chiều dài khoảng 3,5kb và 3 sub-genome RNA có kích thướckhác nhau lần lượt là 2,4kb; 2,1kb; 0,7kb Toàn bộ mRNA được gắn đuôi

và vận chuyển ra tế bào chất

Tại tế bào chất, pgRNA được dùng để tổng hợp bộ gen của HBV Cácsub-genome RNA được dùng để tổng hợp các protein khác trong đó có HBp,protein C và tiền C, protein X, protein S và proteinkinase Protein C đượcdùng để tạo thành nucleocapsid HBcAg Protein tiền C được vận chuyển đếnlưới nội chất Từ lưới nội chất, nó được tiết ra ngoài dưới dạng kháng nguyêntiền lõi HBeAg Còn pgRNA được đóng cùng DNA polymerase của vi rút vàproteinkinase tạo thành hạt lõi Bên trong lớp vỏ capsid vừa tạo thành,pgRNA làm khuôn mẫu để tổng hợp các sợi DNA âm theo cơ chế sao mãngược Polymerase của HBV phiên giải pgRNA, chỉ để lại một đoạn nhỏ (29cặp base ở đầu 5’) Đoạn này dùng làm mồi cho tổng hợp sợi DNA dươngtrên khuôn DNA âm Protein S gắn vào màng lipid của bộ máy Golgi và lướinội chất để sau đó, các nucleocapsid nảy chồi vào lưới nội chất và Golgi sẽbiến chúng thành vỏ ngoài của các thế hệ vi rút con

Một số bộ gen trưởng thành sau tổng hợp sẽ quay về nhân, chuyểnthành dạng cccDNA nhằm duy trì lượng luôn ổn định cho dịch mã Phầnlớn bộ gen trưởng thành được lắp ráp hoàn chỉnh rồi nảy chồi, di chuyểnđến tế bào gan khác

Hình 1.4 Vòng đời của HBV trong tế bào gan [32]

1.2.3 Phân loại HBV theo kiểu gen

Dựa vào sự khác nhau trong trình tự nucloetide của toàn bộ gen, cho đếnnay HBV đã được phân thành 10 kiểu gen (từ A đến J) và 28 subtype Sựphân loại kiểu gen dựa vào sự khác nhau trên 8% về trình tự nucleotide, sựkhác nhau từ 4-8% sẽ là cơ sở để phân loại subtype [33], [34]

Ngoại trừ hai kiểu gen mới được phân lập là I và J, sự phân bố địa lý vàsắc tộc của kiểu gen và subtype HBV được cho là đặc trưng [Bảng 1.1] Kiểugen A lưu hành cao ở Saharan châu Phi (A1), Bắc Âu (A2) và Tây Phi (A3).Kiểu gen B và C phổ biến ở châu Á Hiện tại kiểu gen B được chia thành cácsubtype từ B1 đến B6, trong đó B1 được phân lập ở Nhật, B2-5 được tìm thấy

ở Đông Á, B6 được tìm thấy ở người dân bản địa sống ở phương Bắc nhưAlaska, Bắc Canada và đảo Groeland Kiểu gen C gồm các subtype từ C1 đếnC5, chủ yếu tồn tại ở Đông Á và Nam Á Kiểu gen D với các subtype từ D1đến D5 lưu hành ở châu Phi, châu Âu, Tây Phi Kiểu gen E chỉ hạn chế ở TâyPhi Kiểu gen F (F1-F4) được tìm thấy ở Trung Mỹ và Nam Mỹ Kiểu gen G

đã được báo cáo ở Pháp, Đức và Anh [33], [34], [35], [36], [37] Gần đây,kiểu gen I đã được phân lập ở Việt Nam và Lào, đó là sự tái tổ hợp giữa cáckiểu gen A, C và G [38], [39], [40] Kiểu gen mới nhất của HBV là J, đượcxác định ở đảo Ryukyu của Nhật, có mối liên quan mật thiết với kiểu gen pháthiện ở vượn, đười ươi và kiểu gen C phát hiện trên người [41]

Bảng 1.1 Phân bố địa lý của HBV theo kiểu gen và subtype [42]

Kiểu gen Subtype Vùng địa lý

A2A3

Sub-Saharan châu PhiBắc Âu

Tây Phi

B2-5B6

Nhật BảnĐông Á, Đài Loan, Trung Quốc, Indonesia,Việt Nam, Philipine

Alaska, Bắc Canada

C4C5

Đài Loan, trung Quốc, Hàn Quốc, Đông Nam Á

ÚcPhilipine, Việt Nam

D D1-5 Châu Phi, Châu Âu, Địa Trung Hải, Ấn Độ

cơ kháng LAM ở bệnh nhân nhiễm HBV kiểu gen B so với bệnh nhân nhiễmHBV kiểu gen C Mặc dù có rất ít nghiên cứu nhưng hiệu quả điều trị đối vớicác NUCs khác (trừ LAM) là giống nhau giữa các kiểu gen [43]

1.3 Các marker huyết thanh của HBV và ý nghĩa

Bảng 1.2 Tóm tắt các dấu ấn huyết thanh của nhiễm HBV và ý nghĩa [44]

Dấu ấn huyết thanh Cấp Khỏi

bệnh

Mạn

HBsAg:

- Dấu ấn huyết thanh xuất hiện đầu tiên

- HBsAg (+) kéo dài >6 tháng trong nhiễm

HBV mạn

HBeAg:

- Dấu ấn sự nhân lên của vi rút

- Xuất hiện trong nhiễm cấp hoặc mạn

- Âm tính trong biến chủng precore

hoặc(-)

Anti HBsAg:

- Dấu ấn của sự phục hồi và miễn dịch

- Xuất hiện sau khi đã thải trừ HBsAg và khi

hồi phục hoàn toàn

- Dương tính khi tiêm phòng vacxin

(-) (+) (-)

Anti HBeAg:

Phản ứng chuyển đảo huyết thanh từ HBeAg (+)

sang anti HBeAg (+) thường dẫn tới sự ức chế vi

rút kéo dài

hoặc(-)

Anti HBc:

- Nhiễm mới: IgM (+)

- Nhiễm HBV đã lâu: IgG (+)

HBV DNA:

- Dấu ấn đánh giá vi rút đang nhân lên

- Trong viêm gan B cấp hoặc mạn tính có thể

định lượng được hoặc dưới ngưỡng phát

hiện

(+) hoặcdướingưỡngpháthiện

(-) (+)

hoặcdướingưỡngpháthiện

1.4 Chẩn đoán viêm gan vi rút B mạn (theo hướng dẫn của Bộ Y tế năm

2019 [45])

- HBsAg và/ hoặc HBV DNA dương tính ≥ 6 tháng, hoặc

- HBsAg dương tính và anti-HBc IgM âm tính

1.5 Điều trị viêm gan B mạn tính [45]

1.5.1 Chỉ định điều trị

Dựa vào sự kết hợp 3 yếu tố: nồng độ ALT, tải lượng HBV DNA vàmức độ xơ hóa gan

1.5.2 Nguyên tắc điều trị

- Lựa chọn ban đầu là các thuốc uống NUCs. Chỉ nên dùng các phác đồ

có Peg-IFN đối với một số trường hợp đặc biệt

- Điều trị viêm gan B mạn với NUCs là điều trị lâu dài, có thể kéo dàisuốt đời

- Tuân thủ điều trị

1.5.3 Mục tiêu điều trị

- Ức chế lâu dài sự sao chép của HBV

- Cải thiện chất lượng sống, ngăn ngừa diễn tiến xơ gan, ung thư gan

- Dự phòng lây truyền HBV cho cộng đồng, bao gồm dự phòng lâytruyền mẹ con

- Dự phòng đợt bùng phát viêm gan vi rút B

1.5.4 Các thuốc điều trị

Hiện nay trên thế giới có 7 loại thuốc được sử dụng trong điều trị viêmgan B mạn tính, chia làm hai nhóm thuốc điều trị chính:

1.5.4.1 Interferon (IFN) (nhóm dung hòa miễn dịch)

Nhóm này bao gồm các thuốc: IFN-α, pegIFN-α IFN-α có tác dụngchống vi rút và củng cố hệ miễn dịch cơ thể Dạng pegIFN-α cải thiện tínhchất dược động học nên có thể tiêm hàng tuần thay vì uống hàng ngày Cácnghiên cứu cho thấy, những bệnh nhân điều trị IFN-α có đáp ứng giảm ALT,

giảm HBV DNA, mất HBeAg nhiều hơn so với nhóm chứng không dùngthuốc [46] Đáp ứng với điều trị phụ thuộc vào men gan và tải lượng vi rúttrước khi điều trị: ALT cao, HBV DNA thấp có xu hướng đáp ứng tốt hơn vớiđiều trị [47]

Việc lựa chọn thuốc điều trị phụ thuộc vào tác dụng, sự kháng thuốc, tácdụng phụ và tình trạng bệnh nhân [44]

1.5.5 Theo dõi điều trị khi bệnh nhân đang điều trị bằng thuốc kháng vi rút NUCs [45]

 Tuân thủ điều trị: tư vấn cho bệnh nhân về lợi ích của tuân thủ điều trị vàcác biện pháp hỗ trợ

 Các xét nghiệm theo dõi định kỳ:

- Tháng đầu sau điều trị: theo dõi AST, ALT, creatinin máu

- Khi bệnh đã ổn định (không có triệu chứng lâm sàng; AST, ALT < 2lần giá trị bình thường và có đáp ứng vi rút ban đầu): mỗi 12 tuần làm các xétnghiệm công thức máu, AST, ALT, creatinin huyết thanh, HBeAg (nếuHBeAg còn dương tính), anti-HBe (khi đã mất HBeAg); đánh giá xơ hóa ganmỗi 24-48 tuần

- Tải lượng HBV DNA thực hiện ở tuần điều trị thứ 12, 24 và 48, sau đóthực hiện mỗi 24-48 tuần hoặc khi ALT tăng không rõ nguyên nhân để đánhgiá đáp ứng điều trị và khả năng tái phát HBV hoặc khi người bệnh khôngtuân thủ điều trị

- Định lượng HBsAg (hoặc định tính nếu không làm được định lượng)

mỗi 24-48 tuần để đánh giá khả năng mất HBsAg khi tải lượng HBV DNAdưới ngưỡng và HBeAg âm tính.

- Các xét nghiệm khác theo chỉ định lâm sàng

1.5.6 Đánh giá thất bại điều trị

 Tiêu chuẩn thất bại điều trị [45]:

- Không đáp ứng vi rút ban đầu (Primary non-response): tải lượng HBV

DNA giảm < 10 lần sau 12 tuần điều trị kháng vi rút, thường liên quan đếntình trạng bệnh nhân không tuân thủ điều trị

- Đáp ứng vi rút một phần (Partial virological response): tải lượng HBV

DNA giảm > 10 lần nhưng trên ngưỡng phát hiện sau ít nhất 48 tuần điều trịthuốc kháng vi rút ở người bệnh tuân thủ điều trị

- Bùng phát vi rút (Virological breakthrough): tăng HBV DNA >10 lần

so với trị số thấp nhất trong quá trình điều trị hoặc HBV DNA ≥ 100 IU/mLsau khi đáp ứng vi rút đạt mức dưới ngưỡng phát hiện

 Muốn khảng định thất bại điều trị cần [44], [45]:

- Đánh giá tuân thủ điều trị và độ tin cậy của xét nghiệm HBV DNA

- Giải trình tự gen xác định đột biến kháng thuốc

1.6 Tình trạng kháng thuốc

1.6.1 Quản lý kháng thuốc kháng vi rút của HBV [44]

Bệnh nhân cần được theo dõi định kỳ:

- Xét nghiệm HBV DNA định kỳ 3-6 tháng/lần trong suốt thời gianđiều trị

- Trong trường hợp có bùng phát vi rút, cần kiểm tra sự tuân thủ điều trị

và khảng định kháng thuốc bằng kỹ thuật giải trình tự gen

1.6.2 Cơ chế kháng thuốc kháng vi rút của HBV [51]

Kháng thuốc là một trong những khó khăn lớn nhất trong quản lý điều trịviêm gan vi rút B mạn Thuốc kháng vi rút chính được sử dụng để điều trị

viêm gan B mạn tính là NUCs, đóng vai trò như là áp lực chọn lọc đột biến

gen ở gen P, làm giảm tính nhạy cảm của HBV với thuốc, ngăn cản tác dụng

của thuốc

Động lực của HBV thể hiện ở khả năng sản sinh ra 1012 đến 1013 hạt virút trong thời gian một ngày Nửa chu kỳ vòng đời của HBV tự do thay đổi từ3-24 giờ, còn nửa chu kỳ vòng đời của tế bào gan bị nhiễm HBV khoảng 100ngày Sự khác nhau về thời gian sống là một trong những nguyên nhân chínhđòi hỏi thời gian điều trị viêm gan B mạn tính phải kéo dài

Đột biến phát sinh một cách tự phát trong quá trình nhân lên của vi rút làquá trình sao mã ngược của HBV, bản chất của sự sai sót này là enzymePolymerase thiếu đi khả năng đọc sửa lỗi sao chép trong quá trình sao chépvật liệu di truyền Tỷ lệ thay thế một nucleotide trong một chu kỳ sao chép làkhoảng 10-4 Hậu quả là xuất hiện các thế hệ biến thể vi rút mang đột biến,chúng tồn tại và nhân lên Về lý thuyết, tất cả các nucleotide của bộ gen HBVđều có khả năng bị thay thế hàng ngày ở bệnh nhân bị nhiễm HBV Như vậy,đột biến kháng thuốc có thể đã tồn tại trước đó ở những bệnh nhân bị nhiễmHBV nhưng chưa điều trị thuốc kháng vi rút (còn gọi là đột biến tự nhiên)

Áp lực chọn lọc của thuốc kháng vi rút có thể tác động đến quá trìnhchọn lọc các biến thể vi rút kháng thuốc trước đó Tốc độ chọn lọc gen khángthuốc chủ yếu phụ thuộc vào số lượng acid nucleic của vi rút đóng vai trò nhưnguồn dự trữ cho bộ gen của những vi rút mới

Đột biến gen được cho là được lưu trữ trong cccDNA, là những phân tửxuất hiện trong nhân của tế bào gan bị nhiễm HBV và mang tính bảo thủ Độtbiến gen kháng thuốc được chọn lọc lúc đầu chỉ là những biến thể về gen,chúng cần phải có thời gian dài để phát triển thành quần thể ưu thế Quá trìnhnày phụ thuộc vào khả năng đột biến của vi rút trong môi trường có sự hiệndiện của thuốc kháng vi rút và không gian sao chép có sẵn trong gan để cácđột biến được nhân lên

Đối với viêm gan B mạn tính, không gian sao chép được cung cấp bởi số

lượng tế bào gan Trong quá trình chọn lọc đột biến gen kháng thuốc, các tếbào gan bị nhiễm HBV kiểu gen hoang dại sẽ dần biến mất, còn các tế bàogan chưa bị nhiễm sẽ nhạy cảm với nhiễm HBV mới bị đột biến Nhưngnhững tế bào bị nhiễm có thời gian sống dài nên chỉ có cơ hội rất nhỏ cho việcthay thế quần thể vi rút ban đầu bởi một quần thể mới của các biến thể vi rútkháng thuốc, và nếu có thì quá trình này thường rất chậm Đây là một trongnhững lý do tại sao động lực chọn lọc kháng thuốc rất khác nhau giữa HBV

và HIV

Động lực vi rút cũng là một trong những yếu tố quan trọng trong cơ chế

chọn lọc đột biến kháng thuốc Đột biến gen P có thể làm giảm tính nhạy cảm

của HBV với NUCs, nhưng để đạt được khả năng kháng thuốc cao thì cần cóquá trình bổ sung các đột biến sau đó Điều này được thể hiện trong trườnghợp với ETV Đột biến kháng thuốc đầu tiên tại rt204 và lần thứ 2 tại rt184,rt202 hoặc rt250 Nhiều đột biến kháng thuốc có liên quan với các đột biếnthêm vào để phục hồi khả năng sao chép của vi rút bị đột biến Như vậy, độnglực của vi rút không chỉ bao gồm khả năng sao chép các đột biến khi có sựhiện diện của NUCs mà còn có cả sự tác động ngược lại của các đột biến lênkhả năng sao chép đột biến

Biểu hiện đầu tiên của kháng thuốc là sự phát triển trở lại của vi rút.Nồng độ HBV-DNA có khuynh hướng thấp lúc đầu khi mới sử dụng thuốcbởi vì hầu hết các chủng kháng thuốc đều giảm sao chép đúng so với HBV tựnhiên Tuy nhiên, sự đột biến bù có thể hồi phục lại việc sao chép với mức độnhanh hơn dẫn tới tăng nồng độ HBV-DNA cao hơn trước khi điều trị Việcphát triển trở lại của vi rút thường đi theo sau biến đổi về sinh hóa (tăng nồng

độ ALT) Đột biến nhanh chóng của chủng kháng thuốc có thể dẫn đến tìnhtrạng không đáp ứng lần đầu, một vài trường hợp có thể bị viêm gan nặng độtngột và viêm gan mất bù

Do bộ gen của HBV là những vùng đọc hiểu chồng lên nhau nên việc

thay đổi một vị trí trên gen P cũng có thể tác động đến cấu trúc và chức năng

của protein S Vì vậy, vài đột biến kháng thuốc liên quan LAM có thể làmthay đổi kháng nguyên của kháng nguyên bề mặt HBsAg

Tác động của đáp ứng miễn dịch kháng vi rút đặc hiệu đến chọn lọc độtbiến kháng thuốc chưa được biết rõ

Tỉ lệ chủng đột biến kháng thuốc có liên hệ với nồng độ HBV-DNAtrước khi điều trị, tốc độ ức chế vi rút, thời gian điều trị và các biểu hiện trướckhi điều trị NUCs Tỉ lệ kháng thuốc theo kiểu gen cũng khác nhau theo độnhạy của phương pháp được sử dụng để xác định chủng kháng và bệnh nhânđược xét nghiệm

Đột biến kháng thuốc có thể xác định được sau nhiều tháng hoặc vài nămtrước khi bùng phát về sinh hóa Do đó, việc xác định và can thiệp sớm có thểngăn chặn viêm gan nặng đột phát và viêm gan mất bù, điều này đặc biệt quantrọng ở những bệnh nhân bị ức chế miễn dịch và xơ gan

Hình 1 5 Polymerase/enzyme phiên mã ngược (Pol/rt) biểu thị đột biến thay thế kháng thuốc tiên phát liên quan đến các L-nucleoside (LAM và LdT), các acyclic phosphonate (ADV và TDF) và nhóm D-Cyclopentane

(ETV) *S/A/I/L/G/C/M [52]

1.6.3 Tỷ lệ kháng thuốc

Tỷ lệ kháng thuốc kháng vi rút của HBV đã giảm rõ cùng với sự pháttriển của các NUCs thế hệ mới Kháng LAM xuất hiện thường xuyên ở 80%bệnh nhân điều trị trong 5 năm [53], [54] Trong số những bệnh nhân đượcđiều trị bằng ADV thì tổng tỷ lệ kháng thuốc trên 5 năm là 29% với HBeAg (-)

và 42% với HBeAg (+) [55], [56] Tỷ lệ kháng LdT thấp hơn nhưng cũng làcon số đáng kể sau 2 năm điều trị: 25%với HBeAg (+) và 11% với HBeAg (-)[57] Điều trị lâu dài với ETV đơn trị liệu cho thấy kháng thuốc còn thấp1,2% sau 6 năm điều trị [58] Kháng TDF chưa được phát hiện ở những bệnhnhân sau 4 năm điều trị [59] ETV và TDF đã được chứng minh là nhữngthuốc có rào cản cao đối với sự kháng thuốc của HBV Những thuốc có ràocản thấp đối với sự kháng thuốc sẽ có nguy cơ cao phát triển những đột biến

1.6.4 Hậu quả kháng thuốc

Tình trạng kháng thuốc, đặc biệt là đa kháng, kháng chéo hiện nay đã

gây ra những khó khăn cho điều trị viêm gan B mạn tính Sự phát triển đềkháng vi rút có thể dẫn đến đợt bùng phát vi rút, giảm tỷ lệ chuyển đổi huyếtthanh HBeAg ở bệnh nhân HBeAg (+), cơn tái phát viêm gan khi đang vàngưng điều trị, tiến triển mô học của bệnh gan Cùng với sự phát triển mạnhcủa HBV, bệnh lý về gan diễn biến phức tạp và nhanh chóng tiến triển đếnsuy gan cấp, xơ gan, ung thư gan, tử vong [54], [61], [62]

1.6.5 Phân loại kháng thuốc

Cho đến nay, nhiều loại đột biến kháng thuốc của HBV đã được các nhàkhoa học phát hiện và tất cả các đột biến này đều nằm trên vùng sao chép ngược

của gen P Các đột biến kháng thuốc cơ bản trên gen P của HBV, dẫn đến sự

thay đổi các bộ ba mật mã (codons), nghĩa là làm thay đổi các acid amin trongchuỗi polypeptide của enzyme reverse polymerase (rt) Các thay đổi acid aminnày có thể riêng lẻ hoặc kết hợp, tạo nên mức độ kháng thuốc khác nhau của cácchủng HBV kháng thuốc này

 Các đột biến kháng thuốc trong quá trình điều trị một thuốc duy nhất(monotherapy) [63], [64], [65] là:

- Các đột biến kháng LAM gồm: rtL180M + rtM204V/I/S, rtM204I,rt80VI + rtM204I, rtV173L + rtL180M + rtM204V, rtI169T + rtV173L +rtL180M + rtM204V/, rtA181T, rtT184S + rtL180M + rtM204V hoặcrtQ215S + rtL180M + rtM204V

- Các đột biến kháng ADV gồm: rtN236T, rtA181V/T, rtV84M/ rtS85A/rtL80V/I hoặc rtV214A/ rtQ215S

- Các đột biến kháng ETV: rtI169T + ntV173L + rtL180M + rtT184G +rtM204V, rtI169T + ntV173L + rtL180M + rtM204V + rtM250V hoặc có sựkết hợp các đột biến ở các codon 184, 202 và 250

- Các đột biến kháng LdT gồm: rtM204I hoặc có các đột biến liên quanđến kháng LAM

- Các đột biến kháng TDF gồm: rtL180M + rtA194T + rtM204V,rtV204A, rtQ215S hoặc rtA181V + rtM204I.

 Các đột biến kháng đa thuốc khi điều trị phối hợp (combination therapy)

từ hai thuốc trở lên gồm các nhóm [63],[64],[ 65]

- Nhóm 1 : Các đột biến kháng đa thuốc LAM + ADV gồm:

Quy trình thí nghiệm theo nguyên tắc thông thường của phản ứng tổnghợp chuỗi, trong đó đặc điểm chính là đoạn DNA được nhân lên sẽ được pháthiện trong thời gian thực (real time) Đây là phương pháp tiếp cận mới so vớiphản ứng PCR thông thường-khi mà sản phẩm chỉ được xác định khi phảnứng đã kết thúc.

Realtime PCR cho phép phát hiện và định lượng nồng độ sản phẩm saumỗi chu kỳ nhiệt dựa trên cường độ phát huỳnh quang Mức độ nhiễm đượcđịnh lượng bằng số bản sao HBV DNA trên một đơn vị HBV DNA là căn cứ

để điều trị viêm gan B hay không, khi được phát hiện vượt ngưỡng 104-105copies/ ml máu thì người bệnh cần phải được điều trị Trong quá trình điều trị,người bệnh thường phải kiểm tra định kì từ 3-6 tháng/ lần và xét nghiệm HBVDNA cũng là xét nghiệm không thể thiếu Xét nghiệm này giúp theo dõi đượchiệu quả điều trị bệnh Nếu vi rút có dấu hiệu tăng trở lại và không ngừngphát triển có nghĩa là vi rút có thể đã kháng thuốc Trình tự HBV đột biến cóthể được khuếch đại và phát hiện nhờ kỹ thuật realtime PCR

Kỹ thuật realtime PCR so với PCR-điện di: Có thao tác đơn giản và thờigian ngắn hơn, độ nhạy và đặc hiệu cao hơn; tránh được ngoại nhiễm sảnphẩm PCR dẫn đến dương tính giả Hơn nữa kit real-time có thể sử dụng cho

3 Máy MX3000P Agilent – Stratagene

4 Máy Rotor-Gene – Qiagen

5 Máy của Eppendorf

6 Máy của Roche

1.7.2 Giải trình tự gen [66]

Giải trình tự gen là kỹ thuật tìm ra trình tự sắp xếp các nucleotide trên

đoạn gen được quan tâm Khi ứng dụng vào nghiên cứu HBV, trình tự cácnucleotide được xác định và được so sánh với thư viện gen, từ đó xác địnhđược HBV genotype và một số đột biến kháng thuốc của HBV, đưa ra đượcphác đồ điều trị tối ưu.

Năm 1975, kỹ thuật giải trình tự gen (nguyên lý enzym) được công bốbởi Sanger và đến năm 1977, Maxam- Gilbert công bố kỹ thuật giải trình tựgen dựa trên nguyên lý phân giải hóa học Hiện nay, các kỹ thuật này đã đượccải tiến rất nhiều nhờ những tiến bộ mới về khoa học và công nghệ, làm chohiệu suất của giải trình tự gen ngày càng cao, một trình tự dài hàng nghìn cặpbase có thể được phiên giải trong vài tiếng đồng hồ thay vì hàng tuần nhưtrước đây

So sánh kỹ thuật giải trình tự gen và realtime PCR cho thấy realtimePCR chỉ có thể phát hiện được rất ít các đột biến kháng thuốc của HBV vì cóquá nhiều các biến thể của HBV đã làm cho việc thiết kế các probe phát hiệnhay thiết kế các vị trí để enzym cắt giới hạn nhận diện bị khó khăn rất nhiều.Giải trình tự gen do đó sẽ có ưu điểm hơn trong việc xác định kiểu gen và cácđột biến kháng thuốc

Một số hệ thống giải trình tự gen hiên đang sử dụng tại Việt Nam

1 Hệ thống giải trình tự và phân tích đoạn ABI 3500, nhà sản xuất:Applied Biosystem- Mỹ/Nhật

2 Hệ thống OpenGene

3 Máy giải trình tự gen Pyromark Q24 hãng Qiagen Đức

1.8 Một số nghiên cứu về đột biến kháng thuốc điều trị viêm gan B mạn tính ở Việt Nam

Đột biến kháng thuốc điều trị viêm gan B ở Việt Nam đã được nghiêncứu khá nhiều Một số nghiên cứu có thể kể đến như:

- Từ tháng 8/2004 đến tháng 5/2006, Hồ Tấn Đạt cùng đồng nghiệp đãứng dụng kỹ thuật giải trình tự gen để xác định kiểu gen và các đột biến

kháng thuốc của HBV trên 122 bệnh nhân viêm gan B mạn tính đang điều trịLAM Nghiên cứu xác định được 2 kiểu gen của HBV là kiểu gen B và C với

tỷ lệ lần lượt là 62,3% và 37,7% Đột biến kháng LAM chiếm 63,9%, trong

đó, tỷ lệ đột biến kháng LAM sau 1, 2, 3, 4 năm điều trị LAM là 27,8%;63,4%; 71,1%; 83,3% [6]

- Năm 2010, Lê Thị Dung xây dựng quy trình phát hiện đột biếnrtA181V/T và rtN236T kháng ADV của HBV bằng kỹ thuật realtime PCR,xác định được 45,11% ca xuất hiện đột biến kháng ADV Trong đó, đột biếnrtA181V chiếm 5,71%; đột biến rtN236T chiếm 5,71% và đột biến rtA181Tchiếm 11,43% [7]

- Lao Đức Thuận-Trương Kim Phượng cùng đồng nghiệp nghiên cứuứng dụng kỹ thuật Realtime-PCR để xác định kiểu gen, lượng vi rút trongmáu và đặc điểm kháng thuốc điều trị của vi rút viêm gan B trên người bệnhcủa bệnh viện đa khoa Đồng Tháp năm 2014 [68] Kết quả:

+ Kiểu gen nhiễm: kiểu gen B nhiều hơn kiểu gen C, đồng nhiễm cảhai kiểu gen B và C

+ Đột biến kháng LAM và ADV đi kèm với tỷ lệ HBeAg dương tínhcao và ngược lại

+ Bệnh nhân có đột biến kháng thuốc có tải lượng vi rút cao cả trongtrường hợp kháng LAM và ADV

- Đặng Mai Anh Tuấn, Võ Đức Xuyên An, Phạm Hùng Vân đã thựchiện một nghiên cứu trên 894 bệnh nhân viêm gan B mạn tính để tìm hiểu tìnhhình đột biến kháng thuốc ADV và LAM Thông qua việc giải trình tự vùnggen phiên mã ngược của HBV, kết quả cho thấy, tỷ lệ HBV kháng LAM tuycao hơn ADV nhưng vẫn ở mức thấp (4,7%) [69]

- Nguyễn Thị Hải Yến, Trần Thị Như Lê, Cao Minh Nga nghiên cứu trên

42 bệnh nhân viêm gan B mạn tính đã và/hoặc đang được điều trị với LAM > 12

tháng Tác giả tiến hành định lượng HBV-DNA, xác định genotype cũng nhưtìm các vị trí đột biến (rt204V/I và rt180) trên gen polymerase bằng kỹ thuậtRealtime PCR với các đoạn mồi và các mẫu dò đặc hiệu Kết quả là đột biếnkháng LAM của HBV chiếm 47,6%, trong đó, đột biến ở vị trí rt204I chiếm21,9%, vị trí rt204V + rt204I chiếm 23,7% và rt180 + rt204V + rt204I chiếm2,4% [70].

1.9 Tình hình bệnh nhân đến khám và điều trị viêm gan B mạn tính tại bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương

Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương là một trong những tuyến caonhất khám, chữa bệnh và phục hồi các chức năng về bệnh truyền nhiễm vànhiệt đới, trong đó có các bệnh về gan do HBV Khoa xét nghiệm, nay làkhoa Vi sinh và sinh học phân tử của bệnh viện được đầu tư các trang thiết bịhiện đại như xét nghiệm căn nguyên vi rút bằng PCR, RT-PCR dùng để địnhlượng vi rút viêm gan B, hệ thống giải trình tự để xác định đột biến khángthuốc, từ đó hỗ trợ điều trị hiệu quả

Trung bình một tháng có khoảng 2.500 đến 3.000 bệnh nhân viêm gan Bđến khám và điều trị tại bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương với nhiều độtuổi khác nhau, ở nhiều tỉnh thành khác nhau, con đường lây nhiễm khác nhau

và tình trạng bệnh không giống nhau Trong số đó, một số loài HBV có cácđột biến liên quan đến kháng thuốc điều trị HBV ở bệnh nhân viêm gan mạn

đã được xác định

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Những bệnh nhân đến khám và làm xét nghiệm đột biến kháng thuốc củaHBV tại bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương từ tháng 1 năm 2014 đếntháng 12 năm 2017

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân

- Bệnh nhân bị viêm gan mạn do HBV theo tiêu chuẩn của Bộ Y tế

- Đang điều trị thuốc kháng vi rút NUCs

- Được chỉ định làm xét nghiệm kháng thuốc NUCs của HBV

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ

- Bệnh nhân đồng nhiễm với HCV, HIV

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Địa điểm nghiên cứu: Khoa Xét nghiệm, bây giờ là khoa Vi sinh vàsinh học phân tử, Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương

- Thời gian nghiên cứu: từ tháng 1 năm 2014 đến tháng 12 năm 2017

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.3 Các biến số, chỉ số nghiên cứu

2.3.3.1 Một số đặc điểm chung

- Số bệnh nhân được lựa chọn vào nghiên cứu.

- Phân bố tuổi, giới, nghề nghiệp, vùng địa lý

- Tiền sử bệnh lý và phác đồ điều trị thuốc kháng vi rút

Ngưỡng bình thường: AST < 37 IU/L, ALT < 40 IU/L

Dưới 2 lần ngưỡng: 37≤AST<74 IU/L, 40 ≤ALT<80 IU/L

Trên 2 lần ngưỡng: AST ≥74 IU/L, ALT ≥80 IU/L

 Bilirubin toàn phần: ≤17µmol/l

- F4: Xơ gan hoặc xơ hóa gan tiến triển

 Kết quả giải trình tự gen: