Nghiên cứu sự biến đổi của Super Oxidase Dimutase, Glutathion Peroxidase và tình trạng chống oxy hóa toàn phần (TAS) ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính (FULL TEXT)

ĐẶT VẤN ĐỀ Trong các bệnh gan mạn tính, viêm gan vi rút B là một bệnh truyền nhiễm ở người do vi rút viêm gan B (Hepatitis B virus, HBV) gây nên, một bệnh để lại nhiều hậu quả nghiêm trọng [7], [96]. Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới năm 2012, ước tính có hơn 2 tỷ người đã nhiễm HBV và khoảng 240 triệu người đang mang HBV mạn tính [111]. Bệnh nhân viêm gan B mạn tính (Chronic Hepatitis B - CHB) không được điều trị thường tiên lượng xấu, có thể sẽ dẫn đến xơ gan hoặc ung thư tế bào gan [75]. Hàng năm trên thế giới có khoảng 500 - 700 nghìn người tử vong vì hậu quả của nhiễm HBV [111]. Nhiễm HBV mạn tính là một yếu tố nguy cơ quan trọng trong sinh bệnh học của viêm gan mạn tính, xơ gan và ung thư gan [51], [85]. Đột biến vùng lõi, vùng Pres và gen X là những yếu tố quan trọng trong sinh bệnh học của ung thư biểu mô tế bào gan [32], [51], [91]. Cả hai yếu tố này đều được gắn liền với quá trình stress oxy hóa, quá trình này có thể gây tổn thương lipid, protein và DNA ở mức độ tế bào. Trong cơ thể luôn hình thành một sự cân bằng giữa các dạng oxy hoạt động và các chất chống oxy hóa, đây là một trạng thái cân bằng nội môi nhằm duy trì hoạt động bình thường. Khi mất cân bằng làm gia tăng các dạng oxy hoạt động, được gọi là trạng thái stress oxy hóa… Như vậy, trạng thái stress oxy hóa chính là rối loạn cân bằng giữa các chất chống oxy hóa và chất oxy hóa theo hướng thiên về tạo ra các chất oxy hóa [36]. Tình trạng strees oxy hóa đóng có một vai trò nhất định trong bệnh sinh của bệnh gan mạn tính [19]. Tế bào gan sẽ bị tổn thương khi có dư thừa các gốc tự do trong cơ thể có nguồn gốc từ oxy và nitơ [51]. Ngoài ra stress oxy hóa cũng liên quan đến mức độ của bệnh, ở những bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính, quá trình peroxy hóa lipid và tổn thương DNA tăng cao [19], [53], [58]. Các enzym như superoxid dismutase (SOD) và glutathion peroxidase (GPx) là những enzym chống oxy hóa cơ bản nhất của cơ thể, trong đó SOD có tác dụng thu dọn các gốc tự do khơi mào phản ứng; GPx có tác dụng làm giảm nồng độ các gốc tự do hoạt động [22]. Bên cạnh đó, tình trạng chống oxy hoá toàn phần trong cơ thể (TAS) có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong việc dự báo khả năng đáp ứng cơ thể với hiệu quả loại bỏ gốc tự do sinh ra. Nhiều nghiên cứu cho thấy hoạt độ SOD, GPx và nồng độ TAS giảm đáng kể ở nhóm bệnh nhân viêm gan B mạn tính so với nhóm chứng khỏe mạnh hoặc nhóm người mang vi rút không triệu chứng [18], [24]; đồng thời theo một số tác giả qua việc xác định hoạt độ của các chất chống oxy hóa có thể đánh giá tình trạng stress oxy hóa [41]. Những vấn đề này ở Việt Nam chưa được nghiên cứu có hệ thống ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính. Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài này nhằm mục tiêu: 1. Xác định hoạt độ SOD, GPx và tình trạng chống oxy hóa toàn phần (TAS) huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính. 2. Đánh giá mối liên quan hoạt độ SOD, GPx và TAS trong huyết tương với lâm sàng và cận lâm sàng ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO – BỘ QUỐC PHÒNG

HỌC VIỆN QUÂN Y

NGUYỄN BẠCH ĐẰNG

NGHIÊN CỨU SỰ BIẾN ĐỔI CỦA SUPER OXIDASE DIMUTASE, GLUTATHION PEROXIDASE VÀ TÌNH TRẠNG CHỐNG OXY HÓA TOÀN PHẦN (TAS) Ở BỆNH NHÂN VIÊM GAN B MẠN TÍNH

LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC

HÀ NỘI 2017

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong các bệnh gan mạn tính, viêm gan vi rút B là một bệnh truyền nhiễm ở người do vi rút viêm gan B (Hepatitis B virus, HBV) gây nên, một bệnh để lại nhiều hậu quả nghiêm trọng [7], [96] Theo báo cáo của Tổ chức

Y tế Thế giới năm 2012, ước tính có hơn 2 tỷ người đã nhiễm HBV và khoảng 240 triệu người đang mang HBV mạn tính [111] Bệnh nhân viêm gan

B mạn tính (Chronic Hepatitis B - CHB) không được điều trị thường tiên lượng xấu, có thể sẽ dẫn đến xơ gan hoặc ung thư tế bào gan [75] Hàng năm trên thế giới có khoảng 500 - 700 nghìn người tử vong vì hậu quả của nhiễm HBV [111]

Nhiễm HBV mạn tính là một yếu tố nguy cơ quan trọng trong sinh bệnh học của viêm gan mạn tính, xơ gan và ung thư gan [51], [85] Đột biến vùng lõi, vùng Pres và gen X là những yếu tố quan trọng trong sinh bệnh học của ung thư biểu mô tế bào gan [32], [51], [91] Cả hai yếu tố này đều được gắn liền với quá trình stress oxy hóa, quá trình này có thể gây tổn thương lipid, protein và DNA ở mức độ tế bào

Trong cơ thể luôn hình thành một sự cân bằng giữa các dạng oxy hoạt động và các chất chống oxy hóa, đây là một trạng thái cân bằng nội môi nhằm duy trì hoạt động bình thường Khi mất cân bằng làm gia tăng các dạng oxy hoạt động, được gọi là trạng thái stress oxy hóa… Như vậy, trạng thái stress oxy hóa chính là rối loạn cân bằng giữa các chất chống oxy hóa và chất oxy hóa theo hướng thiên về tạo ra các chất oxy hóa [36] Tình trạng strees oxy hóa đóng có một vai trò nhất định trong bệnh sinh của bệnh gan mạn tính [19] Tế bào gan sẽ bị tổn thương khi có dư thừa các gốc tự do trong cơ thể có nguồn gốc từ oxy và nitơ [51] Ngoài ra stress oxy hóa cũng liên quan đến mức độ của bệnh, ở những bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính, quá trình peroxy hóa lipid và tổn thương DNA tăng cao [19], [53], [58]

Các enzym như superoxid dismutase (SOD) và glutathion peroxidase (GPx) là những enzym chống oxy hóa cơ bản nhất của cơ thể, trong đó SOD

có tác dụng thu dọn các gốc tự do khơi mào phản ứng; GPx có tác dụng làm giảm nồng độ các gốc tự do hoạt động [22] Bên cạnh đó, tình trạng chống oxy hoá toàn phần trong cơ thể (TAS) có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong việc dự báo khả năng đáp ứng cơ thể với hiệu quả loại bỏ gốc tự do sinh ra Nhiều nghiên cứu cho thấy hoạt độ SOD, GPx và nồng độ TAS giảm đáng kể

ở nhóm bệnh nhân viêm gan B mạn tính so với nhóm chứng khỏe mạnh hoặc nhóm người mang vi rút không triệu chứng [18], [24]; đồng thời theo một số tác giả qua việc xác định hoạt độ của các chất chống oxy hóa có thể đánh giá tình trạng stress oxy hóa [41]

Những vấn đề này ở Việt Nam chưa được nghiên cứu có hệ thống ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài này nhằm mục tiêu:

1 Xác định hoạt độ SOD, GPx và tình trạng chống oxy hóa toàn phần (TAS) huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính

2 Đánh giá mối liên quan hoạt độ SOD, GPx và TAS trong huyết tương với lâm sàng và cận lâm sàng ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Một số hiểu biết về gốc tự do trong y sinh học

1.1.1 Khái niệm về gốc tự do

Gốc tự do là những nguyên tử, nhóm nguyên tử hay phân tử mà lớp ngoài cùng của chúng có các điện tử đơn độc ở quỹ đạo ngoài cùng (điện tử không cặp đôi) [89], chúng có thể mang điện tích âm hoặc không mang điện

và có khả năng phản ứng cao Quá trình sinh gốc tự do là một quá trình chuyển hóa bình thường của cơ thể

Bình thường gốc tự do tồn tại trong cơ thể với nồng độ thấp và tham gia vào một số chức năng sinh lý nhất định Với việc nhận một điện tử đầu tiên oxy đã tạo ra gốc superoxyd (O2-), gốc tự do đã hình thành và có khả năng phản ứng cao như hydro peroxyd (H2O2), oxy đơn bội (1O2), gốc hydroxyl (HO), lipid peroxyd (LO) …, người ta gọi là dạng oxy hoạt động

1.1.2 Đặc điểm của gốc tự do (R ∙ )

Các gốc tự do có tính oxy hóa rất mạnh, có xu hướng lấy điện tử của phân tử bên cạnh ghép đôi với điện tử của gốc tự do Phân tử bị mất điện tử lại trở thành gốc tự do mới và tác dụng cứ lan truyền, đây chính là nguyên nhân sinh ra chuỗi phản ứng gốc

Vì chứa điện tử không cặp đôi nên gốc tự do bất ổn định về năng lượng

và cả mặt động học Gốc tự do có xu hướng mất điện tử để trở thành gốc khử hoặc nhận điện tử để trở thành gốc oxy hóa Các gốc tự do chủ yếu là dạng oxy hoạt động được hình thành qua chuỗi hô hấp tế bào, trong quá trình peroxyd hóa lipid của các acid béo chưa bão hòa có nhiều liên kết đôi

Các gốc tự do và các dạng oxy hoạt động có khả năng phản ứng hóa học mạnh, chúng có thể tác dụng dễ dàng với các phân tử sinh học gồm lipid, protein, acid nucleic và có thể gây tác hại đến tính chất sinh học của các phân

tử trên Hậu quả của quá trình này là bẻ gãy các liên kết, tạo ra gốc tự do mới

để hình thành liên kết mới, chất mới qua phản ứng giữa các gốc

Trong đời sống tế bào bình thường, oxy là nhiên liệu chủ yếu cần thiết cho sự sống của tế bào và cũng là nguồn gốc chính sản sinh ra gốc tự do Các dạng oxy hoạt động (reactive oxygen species - ROS) là những gốc tự do, những ion hoạt động, phân tử có chứa nguyên tử oxy, có khả năng sinh ra gốc

tự do hoặc được hoạt hóa bởi các gốc tự do [89] Các gốc tự do trong cơ thể được tạo ra thường xuyên: qua chuỗi hô hấp tế bào, tác nhân phóng xạ, hội chứng viêm, trong hiện tượng thiếu máu cục bộ - tưới máu lại, các tác nhân xenobiotic và một số tác nhân khác

Những dạng ROS quan trọng trong cơ thể sinh vật gồm: anion superoxyd O2-, hydrogen peroxyde (H2O2), gốc hydroxyl (•OH), oxy đơn bội

1O2, gốc alkoxyl (LO•) hoặc peroxyl (LOO•) …

Hình 1.1 Các dạng oxy hoạt động trong cơ thể

Nguồn: Jes´us Medina and Ricardo Moreno-Otero (2006)[76]

+ Superoxyd được tạo thành từ chuỗi hô hấp tế bào hoặc từ một số phản ứng tự oxy hóa và trong quá trình bùng nổ hô hấp của hiện tượng thực bào

e- + •O-O• O2

-+ Hydrogen peroxyd (H2O2) có thể được hình thành sau phản ứng dị ly của O2- hoặc do phản ứng khử hai điện tử của oxy [89] H2O2 có hoạt tính hóa học hạn chế, là chất tan trong lipid và có thể xuyên qua các màng sinh học

+ Gốc hydroxyl (•OH) được hình thành từ phản ứng Fenton hoặc phản ứng Haber-Weiss xảy ra chậm [89]

H2O2 + Fe2+ Fe3+ + -OH + -OH Khả năng phản ứng của gốc hydroxyl là rất lớn trong môi trường sinh học, có khả năng phản ứng với rất nhiều thành phần của tế bào

+ Gốc alkoxyl (LO•) hoặc peroxyl (LOO•), có thể được tạo ra dưới tác động của một gốc tự do có chứa oxygen (O2-, HO• ) trên những chuỗi acid béo có nhiều nối đôi

+ Oxy đơn bội (1O2) là một dạng oxy có năng lượng cao, hình thành khi

O2 được cung cấp năng lượng, nó không phải là gốc tự do nhưng có khả năng oxy hóa cực mạnh Oxy đơn bội được tạo thành ở hệ thống sinh học trong một

số sắc tố như chlorophyll, retinal và flavin khi chúng được chiếu sáng với sự

có mặt của oxy

Tất cả các gốc tự do của oxy và dạng oxy hoạt động được gọi là các chất oxy hóa (oxydant) hoặc tác nhân gây stress oxy hóa

1.1.3 Quá trình hình thành các gốc tự do

Các gốc tự do trong cơ thể được tạo ra thường xuyên: qua chuỗi hô hấp

tế bào, tác nhân phóng xạ, hội chứng viêm, trong hiện tượng thiếu máu cục bộ

- tưới máu lại, các tác nhân xenobiotic và một số tác nhân khác

1.1.3.1 Chuỗi hô hấp tế bào

Hô hấp tế bào được thực hiện trong ty thể, bao gồm các phản ứng oxy hóa khử oxy để sinh ra nước và năng lượng dưới dạng ATP (phản ứng oxy hóa khử là quá trình cho và nhận điện tử, do vậy sản sinh ra các gốc), O2 mà chúng ta hít thở nhận một điện tử ở bước đầu tiên tạo ra O2-

O 2 - sinh ra tỷ lệ thuận với cường độ hô hấp tế bào (tỷ lệ với năng lượng sinh ra), là một gốc anion độc hại ở mức trung bình và chúng bị phân hủy bởi

nhiều cơ chế khác nhau Sự phân huỷ O 2 - được xúc tác bởi enzym SOD, chuyển thành H2O2 theo cơ chế tự oxy hóa khử

2 O 2 - + 2H+ H2O2 + O2

H2O2 thường xuyên sinh ra do sự phân hủy O 2 -, nồng độ H2O2 (10-8

mol/L) và O 2 - (10-12 mol/L) trong tế bào tương đối ổn định Tuy nồng độ thấp như vậy, nhưng sự tồn tại đồng thời của chúng trong môi trường sinh học là rất nguy hại Phản ứng giữa chúng sinh ra những sản phẩm 1O2 cũng rất nguy hại, gốc •OH với hoạt tính cao, có khả năng phá hủy những cấu trúc hữu cơ bền vững nhất của cơ thể và gây ra các quá trình bệnh lý

Khi không có mặt của ion Fe2+, Cu2+ thì phản ứng này xảy ra chậm, gọi

là phản ứng Harber-Weiss

O 2 - + H2O2 HO• + HO- + 1O2

Khi có mặt của các ion Fe2+, Cu2+ thì tốc độ phản ứng xảy ra rất nhanh

(phản ứng Fenton) Hai tiểu phân O 2 - và H2O2 không độc có thể tạo ra 1O2,

•OH có khả năng phản ứng rất cao, dễ dàng phản ứng với các chất hữu cơ tạo

ra các peroxyd và từ đó tạo ra nhiều sản phẩm độc hại cho tế bào

2 O 2 - + 2 H+ H2O2 + O2

Và khi đó ion kim loại chuyển tiếp (Fe2+, Cu2+) dễ dàng phân tách H2O2

thành gốc hydroxyl [89]

Fe2+ + H2O2 HO• + HO- + Fe3+

Gốc •OH có khả năng phản ứng mạnh với hầu hết các phân tử sinh học

ở tốc độ khuếch tán, vì vậy nó thường phản ứng trước khi khuếch tán tới những nơi có khoảng cách xa trong tế bào

1.1.3.2 Tác nhân phóng xạ

Các tia phóng xạ hoặc bức xạ có năng lượng cao, có khả năng bẻ gãy một phân tử tạo ra 2 hay nhiều gốc tự do Trong cơ thể chúng ta chiếm phần lớn là nước, do vậy khi các bức xạ có năng lượng cao tác động trên cơ thể, sẽ phân huỷ nước tạo thành các phân tử khác và sản sinh gốc tự do

1.1.3.3 Trong hội chứng viêm

Khi các tác nhân (là các kháng nguyên) xâm nhập vào cơ thể sẽ bị bạch cầu đa nhân trung tính bắt giữ, đồng thời lại kích hoạt bạch cầu đa nhân trung tính tăng tiêu thụ oxy, kích thích enzym của màng tế bào là NADPH-oxydase,

từ đó gây phản ứng xúc tác bởi enzym này, kết quả cuối cùng là tạo ra O 2 - Nếu số lượng gốc tự do sinh ra quá nhiều sẽ gây nên một tỷ lệ bạch cầu bị chết, giải phóng các gốc ROS ra ngoại bào gây nên hiện tượng viêm

1.1.3.4 Trong quá trình thiếu máu cục bộ và tưới máu lại

Khi thiếu máu cục bộ do lòng mạch máu bị hẹp hoặc có cục máu đông, các chất xanthine được tích lũy do tăng thoái hóa ATP và xanthine oxydase được hoạt hóa Khi có sự tưới máu trở lại, với sự có mặt của oxy, xanthine oxydase xúc tác phản ứng chuyển điện tử từ hypoxanthine và xanthine sang

O2 và phản ứng oxy hóa xảy ra rất mạnh, một lượng lớn gốc O 2 - hình thành lại chuyển thành H2O2, •OH và 1O2 [89]

2 H+

Xanthin + O2 Xanthin dạng oxy hoá + O 2

2 H+

2 O 2 - H2O2 + 1O2

1.1.3.5 Tác nhân xenobiotic

Các chất xenobiotic (thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ, chì, CCl4, dioxyn ) xâm nhập vào cơ thể bằng nhiều con đường khác nhau, khi vào cơ thể sẽ bị chuyển hóa và làm biến đổi sinh học Sau quá trình chuyển hóa đó, cấu trúc xenobiotic bị biến đổi rõ rệt, chúng có thể gắn thêm nhóm -OH, -NH2, -SH, -COOH tạo thành các chất dễ tan trong nước và tiếp tục liên hợp với các chất, đào thải ra khỏi cơ thể

Trong quá trình chuyển hóa các chất xenobiotic, tạo ra các dạng ROS

như O 2 -, 1O2 có độc tính cao và gây ra tình trạng stress oxy hóa Các chất chống oxy hóa trong cơ thể như SOD, catalase, protein có nhóm SH, ceruloplasmin trong hồng cầu và gan rất nhạy cảm với các xenobiotic Do vậy, khi có các xenobiotic xâm nhập vào cơ thể, các chất chống oxy hóa này

sẽ thay đổi theo hướng chống lại các tác nhân đó

1.1.3.6 Một số tác nhân khác

Trong một số bệnh lý: bệnh đái đường, vữa xơ động mạch, bệnh lý nhãn khoa, lão hóa, bệnh Parkinson và Alzheimer…cũng tăng tạo các dạng ROS

1.1.4 Trạng thái Stress oxy hóa

Khoa học đã minh chứng, oxy vào cơ thể tham gia nhiều phản ứng hóa học và kết quả của quá trình phản ứng đó là tạo ra năng lượng cho hoạt động sống và đồng thời cũng là nguồn sinh ra gốc tự do

Bình thường gốc tự do tồn tại trong cơ thể với nồng độ thấp và tham gia vào một số chức năng sinh lý nhất định Với việc nhận một điện tử đầu tiên

oxy đã tạo ra gốc superoxyd (O 2 -), gốc tự do đã hình thành và có khả năng phản ứng cao như hydro peroxyd (H2O2), oxy đơn bội (1O2), gốc hydroxyl (HO), lipid peroxyd (LO) …, người ta gọi là dạng oxy hoạt động

Các nghiên cứu cho thấy nhiều chất có khả năng loại bỏ các dạng oxy hoạt động và được gọi là chất chống oxy hóa Các chất chống oxy hóa có bản

chất enzym như: SOD, GPx, glutathion (GSH) Các chất chống oxy hóa có bản chất không enzym như vitamin C, vitamin E, vitamin A, selen, β-caroten [22], [89]

Trong cơ thể luôn hình thành một sự cân bằng giữa các dạng oxy hoạt động và các chất chống oxy hóa Nếu vì một lý do nào đó (cơ thể nhiễm xạ, hóa chất, độc tố, nhiễm vi rút, viêm nhiễm cấp tính ) sẽ làm gia tăng các dạng oxy hoạt động, khi đó không còn sự cân bằng giữa các chất oxy hóa và chất chống oxy hóa, người ta gọi đó là trạng thái stress oxy hóa [36]

Nếu stress oxy hóa ở mức độ nhẹ, các phân tử sinh học bị tổn thương có thể được sửa chữa hoặc thay thế Ở mức độ nặng nề hơn, stress oxy hóa có thể gây tổn thương không hồi phục hoặc chết tế bào [116]

1.2 Hệ thống chống oxy hóa trong cơ thể

Hệ thống chống oxy hóa (antioxydant - system) của cơ thể rất đa dạng và phức tạp bao gồm các enzym và các chất không có bản chất enzym [22] Trong cơ thể luôn tồn tại các dạng oxy hoạt động, đồng thời cũng tồn tại một

hệ thống chống oxy hóa để loại bỏ các tác hại của chúng Hệ thống này hoạt động theo 4 con đường sau: (1) Tạo phức làm mất khả năng xúc tác của các kim loại chuyển tiếp (transferin); (2) Làm gián đoạn các phản ứng lan truyền (α-tocoferol); (3) Làm giảm nồng độ các gốc tự do hoạt động (glutathion); (4) Thu dọn các gốc tự do tham gia khơi mào phản ứng (superoxyd dismutase)

1.2.1 Các chất chống oxy hóa có bản chất là enzym

1.2.1.1 Superoxyd dismutase (SOD)

Superoxyd dismutase là một enzym chống oxy hóa có chứa kim loại thuộc lớp oxydoreductase thực hiện chức năng xúc tác phản ứng chuyển hóa superoxyd thành O2 và H2O2 [22]:

2 O 2 - + 2H+ 2H2O + O2

Hoạt độ SOD càng cao thì nồng độ O 2 - càng giảm đi SOD là một chất

chống oxy hóa rất cơ bản, làm hạ thấp nồng độ O 2 - là chất khởi đầu cho phản ứng tạo sinh tất cả các dạng ROS (Reactive oxygen species) khác

1.2.1.2 Catalase

Catalase (EC 1.11.1.6) [22] là một enzym chống oxy hóa, xúc tác phản ứng phân hủy hydrogen peroxyd [89]:

H2O2 H2O + O2

Catalase có mặt trong hầu hết các tế bào và các mô động vật nhưng hoạt

độ mạnh nhất là ở gan và thận, ít nhất là ở mô liên kết Trong các mô, catalase

có chủ yếu ở trong ty thể cùng peroxysome Catalase tồn tại dưới dạng dung dịch trong tế bào hồng cầu và được tìm thấy trong các loài thực vật nhưng với hoạt độ thấp hơn nhiều

Catalase là enzym chống oxy hóa, xúc tác phản ứng phân hủy hydrogen peroxyd Catalase chỉ hoạt động trong môi trường H2O2 có nồng độ cao còn khi ở nồng độ thấp thì catalase bị ức chế và GPx sẽ hoạt hóa để xúc tác phân hủy H2O2

1.2.1.3 Peroxydase

Peroxydase là một nhóm enzym xúc tác các phản ứng oxy hóa khử, thuộc lớp oxydoreductase Phương trình phản ứng tổng quát của quá trình này:

peroxydase

AH2 + H2O2 A + 2H2O

* Vai trò và tính chất của peroxydase: Cũng như catalase và SOD,

peroxydase là những enzym chống oxy hóa quan trọng trong hệ thống sinh học Chúng có vai trò chính là giải độc tế bào bằng cách chuyển hóa H2O2

thành H2O [22] Peroxydase còn tham gia vào những phản ứng sinh hóa quan trọng khác trong cơ thể như quá trình chuyển hóa và tổng hợp lignin, sinh

tổng hợp thành tế bào, sinh tổng hợp một số hormon như prostaglandin, thyrosin, ethylen Ngoài ra, peroxydase còn có vai trò chống lại các tác nhân gây bệnh xâm nhiễm vào tế bào và mô và đáp ứng bảo vệ những tổn thương

1.2.1.4 Glutathion peroxydase

Các enzym chống oxy hóa và glutathione đóng một vai trò quan trọng trong việc bảo vệ chống lại ROS [61] Glutathion peroxydase (GPx) là enzym xúc tác phản ứng loại bỏ các peroxyd hữu cơ và vô cơ:

Glutathion tồn tại ở 2 dạng: dạng khử (thiol GSH) và oxy hóa (disulfide GS-SG) GSH bị oxy hóa trở thành dạng disulfide GS-SG nhờ enzym GPx xúc tác, kèm theo phản ứng oxy hóa khử này, H2O2 và hợp chất peroxyd bị phân giải Sau đó GS-SG bị khử trở lại dạng GSH bởi GR, enzym này sử dụng NADPH làm nguồn cung cấp điện tử Con đường chủ yếu để tái sinh NADPH là glucose-6-phosphat (G6P) chuyển hướng vào chu trình pentose phosphat được thực hiện bởi glucose-6-phosphat dehydrogenase (G6PDH) Hoạt độ của GPx và catalase phụ thuộc vào nồng độ H2O2 Khi nồng độ

H2O2 cao, GPx bị ức chế và chỉ có catalase hoạt động Ngược lại, khi nồng độ

H2O2 còn lại rất thấp, catalase không còn tác dụng thì GPx lại được hoạt hóa, xúc tác phản ứng phân hủy H2O2, hệ thống glutathion peroxydase bao gồm GPx, GR và G6PDH đây là hệ thống phòng thủ chống lại những tổn thương gây nên bởi quá trình oxy hóa

1.2.2 Hệ thống chống oxy hoá có bản chất không enzym

Đây là hệ thống “bẫy” gốc tự do Hệ thống này hỗ trợ hệ thống chất chống oxy hóa có bản chất enzym Những chất này cần được cung cấp thêm,

hỗ trợ từ bên ngoài thông qua thực phẩm và các chất bổ sung đưa vào cơ thể

1.2.2.1 Nhóm các thiol -SH

Do tính khử mạnh, chúng cùng vitamin C chuyển vitamin E từ dạng oxy hoá sang dạng khử, hồi phục chức năng dập tắt mạch peroxy hoá lipid của vitamin E, có khả năng trung hoà gốc OH∙, tạo gốc thiyl

Tuy vậy nhóm thiol (-SH) cũng rất dễ bị biến đổi dưới tác nhân oxy hoá, tia phóng xạ, các chất độc kim loại nặng khi cơ thể bị nhiễm các chất đó Những chất có ái tính như chì, các chất phóng xạ và gần đây người ta thấy TNT cũng gây giảm nồng độ -SH, nó có tác dụng cạnh tranh với cơ chất, giải phóng Enzym bị ức chế bởi xenobiotic (chất lạ sinh học)

1.2.2.2 β-caroten

Trong cơ thể, β-caroten chống lại các gốc tự do, dập tắt phản ứng dây chuyền Nó vô hiệu hóa đặc hiệu đối với oxy đơn bội (1O2) nhờ có hệ dây nối đôi luân phiên trên mạch cacbon dài, một phân tử β-caroten có thể hấp thu năng lượng của hàng ngàn phân tử 1O2, rồi giải phóng năng lượng ấy dưới dạng nhiệt vô hại Có một lượng β-caroten trong cơ thể chuyển thành vitamin

A [72]

1.2.2.3 Vitamin A

Vitamin A có tác dụng chống oxy hóa tương tự như vitamin E, chúng có khả năng thu dọn các gốc tự do alkoxyl và peroxyl, bảo vệ acid béo chưa bão hòa và các protein của màng tế bào

1.2.2.4 Vitamin E (Tocopherol)

Do đặc điểm cấu tạo phân tử, vitamin E là chất chống các gốc tự do đặc biệt là loại bỏ gốc lipoperoxyd LOO∙ và H2O2 giúp duy trì độ bền, sự nguyên vẹn của màng tế bào [22], [72]

2LOO∙ + Vit.E(OH)2 2LOOH + Vit.E(O2)

Vitamin E bảo vệ cơ thể chống lại các bệnh tim mạch, ung thư, nhiễm khuẩn, đục thủy tinh thể, parkinson Không đủ vitamin E, hồng cầu dễ bị vỡ bởi sự tấn công của hydroperoxyd (H2O2)

1.2.2.5 Selen

Selen được coi là nguyên tố vi lượng rất quan trọng không thể thiếu cho

hệ thống bảo vệ cơ thể chống gốc tự do và có nhiều vai trò sinh học khác Selen có trong thành phần của nhiều enzym, tạo ra các nhóm chức -S-SeH, -S-Se-S là những tâm hoạt động sinh học mạnh Glutathion peroxydase chứa

Se đặc biệt tập trung nhiều ở gan để hóa giải các chất độc, ở cơ tim để bảo vệ các tế bào có cường độ hoạt động lớn Selen có hiệu quả hơn trong việc ngăn ngừa các gốc tự do so với vitamin E [42]

1.2.2.6 Vitamin C (Acid ascorbic)

Vitamin C là chất chống oxy hóa, chống gốc tự do điển hình ở ngoại bào

vì tan được trong môi trường nước [22] Vitamin C loại bỏ các gốc tự do

superoxyd (O 2 -), gốc hydroxyl (∙OH), chặn đứng các phản ứng dây chuyền theo cơ chế gốc tự do Vì vậy, vitamin C giúp cơ thể chống lại có hiệu quả nhiều bệnh nghiêm trọng, trong đó có bệnh ung thư, tim mạch, suy giảm miễn dịch và thần kinh [72]

1.2.2.7 Các flavonoid

Là một họ chất rất phổ biến trong thực vật, có bản chất hóa học là những polyphenol Các flavonoid có các nhóm hydroxyl phenolic, nhóm carbonyl, vòng thơm benzen nên chúng có khả năng phản ứng rất lớn Chúng

có khả năng triệt tiêu các gốc tự do sinh ra trong quá trình bệnh lý của cơ thể, tạo nên những gốc tự do của chúng bền vững hơn và không tham gia vào dây chuyền phản ứng gốc

1.2.2.8 Nhóm các phối tử sắt và đồng

Ion sắt và đồng xúc tác phản ứng Fenton, tạo nên hai dạng oxy hoạt động rất độc hại cho cơ thể là gốc hydroxyl (•OH) và oxy đơn bội Ion sắt nếu tạo được phức qua đủ 6 liên kết phối trí thì không có khả năng xúc tác phản ứng trên nữa Một số chất tạo phức chelat với sắt có đủ 6 liên kết phối trí như:

+ Transferrin: là dạng protein vận chuyển sắt của huyết tương, ở

người khỏe mạnh chỉ cần huy động 20 - 30% lượng transferrin là đủ làm mất hoạt tính xúc tác của sắt Trong một số trường hợp quá tải sắt (hồng cầu vỡ nhiều trong huyết tán, uống thuốc chứa sắt quá nhiều, tổn thương cơ ), huyết tương không đủ transferrin và phản ứng Fenton xảy ra rất mạnh

+ Lactoferin: có nhiều trong dịch sữa, dịch nước mắt, nước mũi, nước

bọt Lactoferin làm mất hoạt tính xúc tác của sắt trong các dịch trên

+ Ceruloplasmin: là một protein chứa đồng, có khả năng tạo phức với

đồng và làm mất hoạt tính xúc tác phản ứng Fenton của đồng, nó cũng oxy hóa Fe2+ thành Fe3+, ngăn cản sự tạo thành các gốc oxy hoạt động từ phản ứng Fenton

1.2.3 Trạng thái chống oxy hóa toàn phần (TAS)

TAS (total antioxydant status) là tình trạng chống oxy hóa toàn phần của huyết tương dựa trên khả năng ức chế của các chất chống oxy hóa [41] TAS được quy cho các chất chống oxy hóa có trong cơ thể chúng gồm nhiều hệ thống bảo vệ nhằm chống lại những ảnh hưởng có hại của các gốc tự do và hiện tượng peroxyd có hại đối với cơ thể

Theo định nghĩa những chất có khả năng ngăn ngừa, chống lại và loại bỏ tác dụng độc hại của các dạng oxy hoạt động đều được gọi là chất chống oxy hoá, trong đó có các chất chống oxy hoá có bản chất enzym như SOD, GPx

và các chất chống oxy hoá có bản chất không enzym [22] Trong nhiều nghiên cứu, TAS được dùng làm chỉ số để đánh giá tổng quát nhất về tình trạng hoạt động của hệ thống chống oxy hoá của cơ thể, biểu thị tính sẵn sàng ứng phó

của cơ thể đối với stress oxy hoá

Tình trạng chống oxy hoá toàn phần trong cơ thể có bảo toàn hay không tùy thuộc vào nhiều yếu tố như chất chống oxy hóa có bản chất enzym, chất chống oxy hóa không có bản chất enzym Như vậy khi khảo sát giá trị TAS có

ý nghĩa vô cùng quan trọng trong việc dự báo khả năng đáp ứng cơ thể với hiệu quả loại bỏ gốc tự do sinh ra

1.3 Bệnh gan mạn tính do vi rút B

1.3.1 Tình hình nhiễm HBV mạn tính trên thế giới và Việt Nam

1.3.1.1 Trên thế giới

Viêm gan B mạn tính là bệnh truyền nhiễm có ở khắp nơi trên thế giới

và HBV là nguyên nhân thường gặp nhất trong số những vi rút gây bệnh gan mạn ở người Tỷ lệ nhiễm HBV và mô hình lây truyền ở các nước khác nhau

là khác nhau Theo thống kê của WHO (2012), ước tính có khoảng 50 triệu người nhiễm HBV mới hàng năm và trên toàn thế giới có khoảng 500 - 700 nghìn người tử vong mỗi năm vì hậu quả của bệnh như suy gan cấp, xơ gan

và HCC [111]

Hình 1.2 Phân bố tỷ lệ nhiễm vi rút viêm gan B trên thế giới

Nguồn: Jules L Dienstag (2008) [39]

Vi rút viêm gan B là nguyên nhân của khoảng 50% HCC trên toàn thế giới [29], [78] và là 1 trong 3 nguyên nhân gây tử vong ở châu Phi, châu Á

Tỷ lệ nhiễm HBV trên thế giới thay đổi từ 0,1% ở vùng lưu hành thấp đến 20% ở vùng lưu hành cao, theo từng khu vực địa lý và quần thể dân cư Những nơi trên thế giới được coi là lưu hành HBV cao khi ít nhất 8% dân số

có HBsAg dương tính [7] Lứa tuổi nhiễm HBV có tác động lớn đến tiến triển lâm sàng, nguy cơ tiến triển thành mạn, tuổi càng nhỏ thì nhiễm HBV tiến triển thành viêm gan mạn càng cao Nhiễm HBV ở trẻ sơ sinh, có 90% chuyển thành mạn [3]; từ 1 - 5 tuổi có 25 - 50% chuyển thành mạn; ở những đứa trẻ lớn hơn, nhiễm HBV có 5% - 10% chuyển thành mạn [7]

1.3.1.2 Ở Việt Nam

Việt Nam là nước có tỷ lệ nhiễm HBV cao trên thế giới và nhiễm HBV vẫn còn là vấn đề y tế quan trọng Tỷ lệ nhiễm HBV hiện tại (HBsAg dương tính) dao động từ 8,8% [40] đến 19% [54], [108] Nghiên cứu của Cuong NH

và cộng sự (2011) [37] trong quần thể các đối tượng nguy cơ cao ở Hải Phòng cho thấy, tỷ lệ mắc HBV tích lũy (HBsAg + anti-HBs) là 53,2% (10,7% + 42,5%) ở người nghiện ma túy, 51,6% (11,0% + 40,6%) ở phụ nữ mại dâm, 54,3% (9,6% + 44,7%) trong thuyền viên, 50,5% (12,5% + 38,0%) ở phụ nữ mang thai, và 51,0% (18,1% + 32,9%) trong hiến máu Một nghiên cứu về tỷ

lệ nhiễm HBV trong nhóm người có nguy cơ cao bao gồm người cho máu, tiêm chích ma túy, người chạy thận nhân tạo, gái bán dâm ở khu vực Hà nội trong 3 năm 2008 – 2010 cho thấy tỷ lệ nhiễm HBV ở các đối tượng này dao động 5,4% - 16,5% [9] Theo báo cáo của Ott J.J và cộng sự (2012) [84] tỷ lệ nhiễm HBV của trẻ em Việt Nam trong độ tuổi 5 – 9 nằm ở mức thấp < 2%

Một nghiên cứu của Nguyễn Đức Cường và cộng sự [4] tiến hành trong cộng đồng dân cư tại 24 xã/ phường/ thị trấn của 8 huyện/ thị xã/ thành phố của tỉnh Quảng Bình với 2019 đối tượng cho thấy tỷ lệ nhiễm HBV 11,89%

Ngô Viết Lộc (2011) [12] nghiên cứu tình hình nhiễm vi rút viêm gan

B trong cộng đồng dân cư tại tỉnh Thừa Thiên Huế năm 2006 – 2009, kết quả cho thấy tỷ lệ HBsAg (+) là 16,36%

1.3.2 Đặc điểm cấu trúc và hệ gen của HBV

1.3.2.1 Đặc điểm cấu trúc hình thái

Năm 1965, Blumberg và cộng sự đã phát hiện ra kháng nguyên bề mặt HBV trong khi nghiên cứu huyết thanh người người thổ dân Úc mắc bệnh máu gọi là kháng nguyên Au [23] Năm 1970, dưới kính hiển vi điện tử, Dane

đã mô tả hạt HBV hoàn chỉnh gọi là thể Dane và năm 1973, WHO đổi tên kháng nguyên Au thành kháng nguyên bề mặt HBV gọi là HBsAg [47] Ở các bệnh nhân châu Á, nồng độ HBsAg <100-200 IU / mL vào cuối giai đoạn điều trị có thể dự đoán giảm nguy cơ tái phát vi rút viêm gan B và có thể xem xét ngưng điều trị ở những bệnh nhân HBeAg âm tính [30]

HBV thuộc họ Hepadnaviridae [96], là một loại vi rút hướng gan, có vỏ

bao ngoài, AND 2 sợi xoắn kép, trên bề mặt vỏ có kháng nguyên bề mặt HBsAg; bên trong là lớp nucleocapsid bao quanh AND có các kháng nguyên lõi (HBcAg), kháng nguyên hòa tan (HBeAg) và AND – polymerase phụ thuộc AND HBV tồn tại dưới 3 loại tiểu thể khác nhau quan sát được dưới kính hiển vi điện tử [6]:

+ Tiểu thể hình cầu nhỏ (small particle) có đường kính 22 nm

+ Tiểu thể hình ống (tubular particle) kích thước 22nm dài 40 - 400nm + Tiểu thể hình cầu lớn (large particle) có kích thước 42 - 45 nm Đây chính là hạt vi rút hoàn chỉnh (tiểu thể Dane) [67]

Khi nhiễm HBV mạn tính, tiểu thể Dane lưu hành trong hệ tuần hoàn thường xuất hiện kèm theo kháng nguyên hòa tan HBeAg Hai tiểu thể còn lại chỉ có lớp protein vỏ (HBsAg) do đó còn gọi là các tiểu thể HBs, đây không phải là các virion hoàn chỉnh và các tiểu thể này không có tính lây nhiễm [6]

1.3.2.2 Bộ gene HBV

Bộ gene của HBV là một phân tử DNA mạch kép dạng vòng không

hoàn chỉnh, kích thước 3,2Kb và được cấu tạo bởi 2 chuỗi đơn ngược dấu có chiều dài không bằng nhau [33], [62] Chuỗi dài (chuỗi âm) nằm ngoài tạo nên một vòng tròn liên tục có chiều dài cố định là 3200 cặp base (basepair; bp) mã hoá toàn bộ thông tin di truyền của HBV, chuỗi ngắn (chuỗi dương) nằm trong có kích thước thay đổi, dung lượng ít hơn chuỗi dài

Genome của HBV bao gồm bốn đoạn gen cấu trúc có chức năng (ORF: open reading frames) ký hiệu là: S, C, P và X [33] Các ORFs này có đặc điểm chồng gối lên nhau, có thể chồng gối toàn bộ như giữa S và P, hoặc chồng gối một phần như giữa X và P hay giữa C và P Các gene này mã hóa cho toàn bộ các protein của vi rút Sự bắt cặp bổ sung của các nucleotide trên vùng gối của 2 sợi âm và dương được giới hạn bởi hai trình tự lặp trực tiếp DR1 và DR2 cho phép quá trình khép vòng của hệ gene xảy ra khi protein P liên kết đồng hóa trị với đầu 5’ của sợi âm

ORF của gene S: có kích thước khá dài, chứa bộ ba mã hóa (codon)

khởi đầu bằng ATG chia ORF này thành ba vùng, vùng S, PreS1 và PreS2 có chức năng mã hoá tổng hợp phân tử kháng nguyên bề mặt (HBsAg) bao gồm HBsAg nhỏ, HBsAg trung bình và HBsAg lớn Gần đây, nghiên cứu của Kim

H và Kim B.J (2015) [63] tại Hàn Quốc công bố cho thấy có sự liên quan giữa đột biến vùng preS/S liên quan đến mức độ trầm trọng của các bệnh nhân viêm gan mạn tính do nhiễm vi rút viêm gan B thể ẩn (HBsAg âm tính, nhưng nồng độ HBV – DNA vẫn tăng cao)

ORF của gene C: Ở đầu 5’ của gene C có 2 codon khởi đầu cho quá

trình đọc mã, trình tự nucleotide nằm giữa 2 codon này được gọi là vùng PC (precore) Nếu quá trình đọc mã được bắt đầu từ codon AUG thứ nhất ở vị trí

1814 và đọc suốt chiều dài của đoạn gene PC và Core (C) sẽ tổng hợp nên HBeAg (Hepatitis B e Antigen) Các nucleotide đầu tiên vùng C sẽ mã hóa cho việc tạo nên một đoạn peptide gồm 19 aa gọi là peptide tín hiệu, peptide này giúp HBeAg được bài tiết qua hệ thống lưới nội bào của tế bào gan, đồng

thời cũng giúp cho kháng nguyên này hòa tan trong huyết thanh và còn được gọi kháng nguyên hòa tan Sự xuất hiện của HBeAg có liên quan đến tính lây nhiễm và phản ánh tình trạng HBV đang ở giai đoạn nhân lên Nếu quá trình đọc mã bắt đầu từ codon AUG thứ hai ở vị trí 1901 và đi suốt đoạn gene C sẽ tổng hợp kháng nguyên lõi (HbcAg - Hepatitis B c Antigen) Đây là kháng nguyên cấu trúc của phần nucleocapsid, vì HBcAg không có đoạn peptide tín hiệu cho nên nó không được bài tiết ra ngoài tế bào gan và không xuất hiện trong huyết thanh

ORF của gene P: Chiếm 80% chiều dài toàn bộ gene, mã hóa bộ enzym

đa chức năng có kích thước 831aa được gọi là protein P (polymerase P; Pol) Enzym này có trách nhiệm thực hiện các chức năng trong quá trình tái tạo vi rút gồm: đóng khung RNA tiền hệ gene của vi rút, “mồi” cho quá trình tổng hợp DNA, phiên mã ngược RNA tiền hệ gene thành DNA sợi đôi, có hoạt tính RNAse-H để biến tính RNA tiền hệ gene, Pol là mục tiêu lý tưởng cho các thành phần kháng vi rút được sử dụng trong điều trị viêm gan B mạn tính Cấu trúc của gene polymerase HBV bao gồm 4 vùng bảo toàn đã được xác định thông qua so sánh với trình tự enzym phiên mã ngược của HBV và được xác nhận lại bởi các nghiên cứu di truyền và chức năng vi rút

ORF của gene X: Mã hóa cho kháng nguyên X (HBxAg), protein này

có trọng lượng phân tử khoảng 17,5 kD với chiều dài 154 axit amin [26] đây

là một protein nhỏ nhất trong các protein của HBV Protein HBx là một protein đa chức năng có vai trò trung tâm của quá trình nhiễm vi rút và bệnh sinh UTG [114] HBx có thể truyền đạt thông tin trực tiếp hoặc gián tiếp cho nhiều gene đích của tế bào, làm trung gian hay đối lập cho nhiều chức năng khác nhau của tế bào như điều hòa chu trình tế bào, mã hóa tổng hợp các phân

tử kết dính, hoạt hóa các gene sinh ung thư hoặc các gene ức chế ung thư của

tế bào [82]

1.3.2.3 Kiểu gen của vi rút viêm gan B

Tiêu chuẩn để phân loại HBV là dựa trên sự khác nhau của chuỗi trong toàn bộ gen của HBV và đã xác định HBV ở người có 10 kiểu gen được đặt tên từ A đến J [60], [71] trong đó với 2 kiểu gen mới là I và J thì kiểu gen I gặp ở Việt Nam và Lào [60], [83] và kiểu gen J đã được xác nhận ở quần đảo Ryukyu, Nhật Bản [60], [104] Một số kiểu gen HBV được tiếp tục phân loại dưới kiểu gen (subtyp) [95] Khi trình tự bộ gen HBV khác nhau trên 8% nucleotit được phân loại kiểu gen và 4 - 8% được phân loại dưới kiểu gen

Phân bố kiểu gen khác nhau giữa các nước và thậm chí giữa các vùng trong một nước Sự khác biệt bệnh học giữa các kiểu gen đã được hiểu rõ một phần Ví dụ, kiểu gen A có xu hướng mạn tính, trong khi đột biến thường gặp trong kiểu gen C, kiểu gen D có xu hướng gặp cả mạn tính và đột biến, trong khi nguy cơ từ viêm gan mạn tính tiến triển đến ung thư gan lại hay gặp ở kiểu gen C hoặc D [101] Nồng độ HBV – DNA trong huyết thanh của bệnh nhân có kiểu gen C có xu hướng cao hơn so với kiểu gen B [113] Một nghiên cứu của Bùi Xuân Trường và cộng sự (2007) [105] ở 183 bệnh nhân nhiễm HBV, kết quả cho thấy 67,8% là genotuyp B và 27,9% là genotuyp C Theo nghiên cứu của tác giả Bùi Hữu Hoàng (2003) [10] tiến hành ở 87 bệnh nhân người lớn, trong đó 38 bệnh nhân ung thư gan, 24 bệnh nhân xơ gan và 25 người mang HBsAg mạn tính, kết quả cho thấy genotuyp A là 3,4%; genotuyp B là 45,5% và genotuyp C là 34,1%; 1 trường hợp đồng nhiễm genotuyp A và C; 17% không xác định được genotuyp

1.3.3 Quá trình nhân lên của HBV

Có thể tóm tắt quá trình nhân lên của HBV như sau: đầu tiên HBV thâm nhập vào tế bào gan qua sự gắn kết của HBV vào các thụ cảm thể trên

bề mặt tế bào gan Sau khi hòa màng, HBV cởi bỏ vỏ protein bao bọc bên ngoài và giải phóng lõi ADN vào trong nhân tế bào gan Tại đây, bộ gen của HBV biến đổi tạo thành cccDNA (covalently closed circular DNA) hoạt động

như một khuôn phiên mã tạo các ARN thông tin của vi rút Các ARN thông tin này được vận chuyển qua màng nhân ra bào tương của tế bào và dịch mã tạo ra các protein vỏ (HBsAg), protein lõi (HBcAg), kháng nguyên hòa tan (HBeAg), polymerase, HBx protein và một số protein chưa xác định khác Sau khi các protein trên được dịch mã tại bào tương sẽ thực hiện quá trình

"lắp ghép" các protein mới được mã hóa tạo thành với genom ARN của vi rút

Từ ARN của vi rút này sẽ phiên mã ngược tổng hợp hai chuỗi đơn ADN của HBV để tạo thành HBV hoàn chỉnh rồi đi qua hệ thống lưới nội sinh chất (ER) bằng hình thức “nẩy chồi” và sau đó thoát ra khỏi tế bào gan vào hệ thống tuần hoàn Trong quá trình này một số HBV-DNA mới được hình thành

ở trong bào tương sẽ quay trở lại nhân tế bào, rồi tổng hợp thành cccDNA, một số HBV trong hệ thống tuần hoàn tiếp tục gây nhiễm vào tế bào gan khác tiếp tục chu trình nhân lên mới của vi rút Quá trình đó cứ tái diễn nhiều lần trong suốt thời gian tồn tại của HBV trong cơ thể vật chủ Người ta ước tính ở mỗi cá thể mang HBV mạn tính mỗi ngày có khoảng 1011 hạt vi rú t được tạo thành Tất cả HBV hoàn chỉnh cũng như các tiểu thể không hoàn chỉnh đều được đổ vào máu và lưu hành trong hệ tuần hoàn

Hình 1.3 Mô hình chu trình thâm nhập và nhân lên của HBV

*Nguồn: theo Ganem and Prince (2004) [45]

1.3.4 Đáp ứng miễn dịch trong nhiễm HBV mạn tính

Các nghiên cứu trên các bệnh nhân viêm gan B cấp tính và viêm gan B

tự hồi phục cho thấy một sự đáp ứng mạnh mẽ của hệ thống miễn dịch qua trung gian tế bào T đối với các kháng nguyên của HBV Các đáp ứng miễn dịch này liên quan với cả hệ thống phức hợp hoà hợp mô chủ yếu lớp II, tế bào lymphô giúp đỡ CD4 và với lớp I, tế bào lymphô gây độc tế bào CD8 [45] Đáp ứng kháng vi rút trực tiếp qua trung gian tế bào T gây độc tế bào đối với các quyết định kháng nguyên trong các đoạn nhân, polymerase, và vỏ cũng như các đáp ứng tế bào lymphô T giúp đỡ đối với các kháng nguyên đoạn lõi và polymerase đã được chứng minh rõ ràng trong nhiễm HBV cấp tính

Ngược lại trong các trường hợp mang HBV mạn tính thì đáp ứng của tế bào lymphô T đặc hiệu là rất yếu [5] Các nghiên cứu trên mô hình động vật

đã chứng minh rằng mức độ tổn thương gan do đáp ứng viêm không đặc hiệu

với các kháng nguyên thứ cấp quyết định, như đáp ứng miễn dịch qua tế bào TCD8, và các cytokine như TNF, các gốc tự do, cũng như protease Các tế bào khác như tế bào giết tự nhiên (NK) cũng đóng vai trò quan trọng Các nghiên cứu gần đây cho thấy các cytokine viêm như IFN gamma, TNF alfa có tác dụng kháng vi rút mà không liên quan tới việc huỷ hoại tế bào gan [5] Khả năng diệt vi rút mà không ảnh hưởng tới tế bào gan đích của các cytokine trên có ý nghĩa rất quan trọng trong quá trình đào thải vi rút tự nhiên

Đáp ứng miễn dịch dịch thể đối với các kháng nguyên vi rút là rất tốt

và duy trì bền vững trên cả viêm gan cấp tính và mạn tính, mặc dù kháng thể kháng HBsAg (anti HBs) là ít khi tìm thấy vì có một lượng quá lớn của HBsAg luôn được tổng hợp Điều đó gợi ý rõ ràng rằng đáp ứng tế bào T, đặc biệt là đáp ứng tế bào T gây độc tế bào đóng một vai trò rất quan trọng trong

cơ chế loại trừ vi rút

Bên cạnh tế bào T, các tế bào hình sao cũng đóng vai trò quan trọng trong bệnh sinh nhiễm HBV mạn tính Tế bào này đóng vai trò chủ yếu trong khởi phát hoạt động tế bào T Thay đổi chức năng của các tế bào hình sao, có thể dẫn đến tình trạng đáp ứng yếu của các tế bào T và B ở bệnh nhân CHB

1.3.5 Diễn biến tự nhiên của nhiễm HBV mạn tính

Diến biến tự nhiên của nhiễm HBV mạn tính trải qua 4 giai đoạn kế tiếp nhau

- Giai đoạn dung nạp miễn dịch (Immune tolerance phase) Xảy ra ở giai đoạn sớm của nhiễm HBV mạn Giai đoạn này gặp ở những trẻ sơ sinh bị lây nhiễm HBV từ mẹ và thường xảy ra trong 20 năm đầu Trong giai đoạn này ALT và AST thường không tăng nhưng tải lượng HBV - DNA thường tăng cao, sinh thiết gan thường không phát hiện phản ứng viêm và xơ hóa [119] Các chủng HBV trong giai đoạn dung nạp miễn dịch chủ yếu là các chủng HBV tự nhiên có HBeAg dương tính với rất ít hoặc không có đột biến HBeAg âm tính

- Giai đoạn thanh thải miễn dịch (Immune clearance phase) Chuyển đổi

từ dung nạp miễn dịch sang thanh thải miễn dịch thường xảy ra ở tuổi từ 20 -

40 tuổi, nhưng có thể bắt đầu sớm hơn thậm chí xảy ra ở trẻ em Trong giai đoạn này HBeAg dương tính, ALT tăng [119] Sinh thiết gan ở những BN này

có tổn thương mô học và giảm HBcAg trong nhân tế bào gan với tăng HBcAg trong nguyên sinh chất Hầu hết BN trong giai đoạn thanh thải miễn dịch thường không có triệu chứng nhưng tăng ALT từ trung bình đến cao Vì vậy gọi là viêm gan vi rút B mạn HBeAg dương tính [119] Đáng chú ý trong thực hành lâm sàng có thể được nhấn mạnh bởi bùng phát viêm gan cấp với ALT tăng gấp 5 lần ULN Giai đoạn thanh thải miễn dịch có thời gian thay đổi và thường kéo dài trong nhiều năm đến khi chuyển đảo huyết thanh HBeAg

- Giai đoạn nhân lên thấp hay không nhân lên (Inactive or residual phase): xảy ra sau khi chuyển đảo huyết thanh từ HBeAg dương tính thành anti-HBe dương tính Hầu hết những BN đã chuyển đảo huyết thanh duy trì suốt đời tình trạng HBeAg âm tính và anti-HBe dương tính Tuy nhiên có khoảng 10% số bệnh nhân có vi rút cao dai rẳng trong máu và ALT tăng cao, mặc dù có sự chuyển đảo từ HBeAg dương tính thành anti-HBe dương tính [35]

- Giai đoạn tái hoạt động (Reactivation phase) Sau một thời gian nhất định, một số BN xuất hiện giai đoạn tái hoạt động với tăng tải lượng HBV-ADN huyết thanh, xuất hiện các đột biến PC/BCP Đột biến PC tạo ra mã (codon) dừng nằm trong bộ gen của HBV và ngừng tổng hợp HBeAg, trong khi đó đột biến BCP ảnh hưởng trực tiếp trên hiện tượng sao chép mã để tổng hợp HBeAg Những đột biến này có thể đơn thuần hay phối hợp với nhau nhưng HBV vẫn tiếp tục tăng sinh mặc dù HBeAg âm tính tạo ra nhóm bệnh viêm gan vi rút B mạn HBeAg âm tính Diễn biến của viêm gan vi rút B mạn HBeAg âm tính có đặc điểm ALT tiếp tục tăng và dao động, xuất hiện triệu chứng lâm sàng và tổn thương tế bào gan ngày một nhiều dễ dẫn đến xơ gan

1.3.6 Chẩn đoán viêm gan B mạn tính

Chẩn đoán viêm gan B mạn tính phải dựa vào căn cứ:

1.3.6.1 Căn cứ lâm sàng

Viêm gan B mạn tính là một bệnh thường có tiến triển thầm lặng, biểu hiện lâm sàng nghèo nàn, không đặc hiệu Việc chẩn đoán xác định viêm gan mạn do HBV chủ yếu dựa trên các kết quả huyết thanh học và giải phẫu bệnh học

Phần lớn bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính không có triệu chứng lâm sàng Trong số các bệnh nhân viêm gan B mạn hoạt động được phát hiện chỉ

có khoảng 50% có tiền sử mắc viêm gan vi rút cấp trước đó

Triệu chứng lâm sàng thường gặp nhất là hơi mệt mỏi nhưng không thường xuyên, ăn ngủ kém, đầy bụng, khó tiêu, đau tức hạ sườn phải Chỉ những đợt bột phát mới thường kèm theo sốt nhẹ Các triệu chứng gan to, mật

độ chắc, vàng da, lách to, sao mạch, thường gặp ở 25% trường hợp các bệnh nhân và chủ yếu là bệnh nhân lớn tuổi và nhóm bệnh nhân có tổn thương gan tiến triển trên mô học

Enzym trasaminase thường tăng trung bình khoảng 2-5 lần giới hạn trên bình thường [15] Bilirubin thường tăng ở mức độ nhẹ và vừa nhưng ở một số bệnh nhân có thể tăng cao Tỷ lệ prothrombin giảm, albumin giảm, globulin tăng có thể gặp ở những trường hợp viêm gan B mạn hoạt động mức độ nặng, giai đoạn chuyển xơ gan

Những triệu chứng ngoài gan gần giống như viêm gan vi rút cấp do sự lắng đọng các phức hợp miễn dịch Ag-Ab như đau khớp, viêm khớp, ban da, viêm cầu thận, viêm mạch

1.3.6.2 Căn cứ miễn dịch

Viêm gan B mạn tính được xác định khi HBsAg tồn tại trên 6 tháng sau giai đoạn khởi phát Nhưng trên thực tế phần lớn các bệnh nhân viêm gan B mạn tính không rõ tiền sử HBsAg Anti HBc là dấu ấn quan trọng giúp phân

biệt viêm gan B trong giai đoạn cấp tính hay mạn tính Trong giai đoạn mạn thường chỉ có anti HBc type IgG(+)

HBV-DNA có giá trị chẩn đoán sớm nhất khi thấy dương tính kéo dài trên 8 tuần sau khi có triệu chứng lâm sàng Trong viêm gan B mạn tính, HBV-DNA thường dương tính cùng với HBeAg, DNA polymerase và HBcAg trong tế bào gan Trong những trường hợp viêm gan mạn HBeAg(-)

do đột biến pre-core và core-promoter, HBV-DNA dương tính là dấu ấn quan trọng để xác định tình trạng nhân lên của vi rút Do vậy việc xác định HBV- DNA là rất cần thiết HBV-DNA còn có giá trị trong theo dõi hiệu quả điều trị bằng các thuốc kháng vi rút

1.3.6.3 Căn cứ giải phẫu bệnh

Chẩn đoán mô bệnh học được coi là tiêu chuẩn vàng không những đánh giá được mức độ viêm và hoại tử của gan mà còn dự đoán tiên lượng, theo dõi mức đáp ứng điều trị

Chẩn đoán mô bệnh học được tiến hành trên một sinh thiết gan Một mẩu sinh thiết gan đáp ứng được yêu cầu phục vụ cho chẩn đoán khi nó tối thiểu phải bao gồm 3 khoảng cửa nguyên vẹn Hiện nay có nhiều bảng phân loại mô bệnh học viêm gan mạn khác nhau, trong đó phân loại theo bảng tính điểm của Knodell được áp dụng rộng rãi hơn cả [15]

Đặc điểm tổn thương mô học của viêm gan mạn hoạt động: Là sự thâm nhiễm dày đặc của các tế bào đơn nhân ở khoảng cửa và xâm lấn vào tiểu thuỳ gan (ở viêm gan mạn do tự miễn có nhiều plasmocyt xâm nhập) Hoại tử mối gặm và hoại tử cầu nối và hiện tượng tái tạo các đám tế bào tạo nên những tiểu thùy giả hoặc đảo lộn tiểu thùy khi tổ chức xơ phát triển mạnh Về tiêu chuẩn mô học của viêm gan mạn hoạt động ít nhất phải có là hoại tử mối gặm Hoại tử cầu nối có thể thấy ở viêm gan cấp nhưng ở viêm gan mạn hoạt động có hoại tử cầu nối là biểu hiện tiến triển đến xơ gan bởi vì những vùng

hoại tử cầu nối sẽ phát triển thành cầu xơ chia cắt các tiểu thùy gan hình thành các cục tân tạo (nodules) và phát triển tới xơ gan

Đánh giá mức độ hoạt động của viêm gan mạn tính dựa vào chỉ số hoạt động mô bệnh học (Histological activity index: HAI) Theo đó, Knodell chia thành 4 mức độ hoạt động của viêm gan mạn như sau [64]:

HAI = 0 điểm: không hoạt động

HAI = 1 – 3 điểm: viêm gan hoạt động mức độ tối thiểu

HAI = 4 – 8 điểm: viêm gan hoạt động mức độ nhẹ

HAI = 9 – 12 điểm: viêm gan hoạt động mức độ vừa

HAI = 12 – 18 điểm: viêm gan hoạt động mức độ nặn

1.4 Stress oxy hóa trong bệnh lý viêm gan B mạn tính

Trong bệnh lý gan mạn tính có rất nhiều yếu tố bệnh sinh độc lập với các yếu tố gây bệnh (vi rút, rượu, phản ứng tự miễn dịch…) gây ra quá trình tổn thương gan Trong hầu hết các trường hợp từ tổn thương gan ban đầu, dần dần sẽ dẫn tới viêm gan mạn tính, xơ gan và cuối cùng là ung thư gan Tình trạng strees oxy hóa có một ý nghĩa nhất định góp phần làm sáng tỏ cơ chế bệnh sinh trong các bệnh gan như bệnh gan do rượu, viêm gan vi rút mạn tính, bệnh gan tự miễn và bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu Tế bào gan sẽ bị tổn thương khi có dư thừa các gốc tự do trong cơ thể có nguồn gốc từ oxy và nitơ [51]

Trong những năm gần đây, dưới góc độ sinh học phân tử, đã có những tiến bộ trong nghiên cứu về các tế bào kiểm soát sự cân bằng giữa các chất chống gốc tự do và gốc tự do Trên cơ sở các bằng chứng này, trong những năm gần đây, các chất chống oxy hóa được sử dụng như một chiến lược hợp

lý trong điều trị bệnh gan mạn tính Chưa có một nghiên cứu lâm sàng với số lượng lớn bệnh nhân, tuy nhiên với các nghiên cứu nhỏ, thực hiện ở nhiều trung tâm khác nhau đã chỉ ra rằng việc sử dụng các chất chống oxy hóa trong điều trị bệnh gan mạn tính là có giá trị đặc biệt là sự kết hợp chất chống oxy

hóa với kháng viêm và/ hoặc thuốc kháng vi rút Việc sử dụng các chất chống oxy hóa như S-adenosylmethionine (SAMe; ademetionine), tocopherol (vitamin E), polyenylphosphatidylcholine hoặc silymarin đã cho kết quả hứa hẹn trong một số bệnh lý [43], [76], [90]

1.4.1 Stress oxy hóa ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính

Các nhóm oxy hoạt động (ROS) và các loại nitơ phản ứng (RNS) được hình thành từ các chất nội sinh và ngoại sinh khác nhau gây tổn thương lipid, protein và DNA tế bào ở các mức độ khác nhau [28] Ti thể là nguồn sản xuất ROS [20] ROS có thể hình thành thông qua sự rò rỉ electron từ chuỗi hô hấp

ti thể [93] ROS có thể gây tổn thương DNA ở các mức độ khác nhau theo những con đường khác nhau [112] Bản thân HBx có mục tiêu là ty lạp thể và trực tiếp tương tác với kênh anion phụ thuộc vào điện áp từ đó làm thay đổi điện thế màng ty thể và làm tăng ROS nội sinh cấp [68], [92] HBx gây ra stress oxy hóa thông qua kênh canxi và kích hoạt tế bào kinase, dẫn đến kích hoạt các yếu tố phiên mã NF - κB, bộ chuyển đổi tín hiệu và kích hoạt phiên

mã 3, và những quá trình khác thông qua phosphoryl hóa [110] Ngoài ra, khi HBV gây ra stress oxy hoá cũng kích thích sự phiên mã của kinase protein Raf -1 đến ty thể Kích hoạt này liên quan đến cả Src kinase qua trung gian của miền kích hoạt Raf – 1 [32] HBx cũng gây ra peoroxy hóa lipid thông qua sự xuất hiện SEP, kết quả làm gia tăng TNF – α [118]

Mặc dù ROS và RNS là những dấu hiệu có giá trị tốt nhất trong đánh giá trạng thái stress oxy hóa, nhưng ROS và RNS là những chất không ổn định và dễ bay hơi [48] Do đó, để đánh giá trạng thái stress oxy hóa do ROS

và RNS gây ra, chúng ta có thể xác định thông qua các "sản phẩm phụ" được ROS / RNS in dấu trên các protein, lipid và DNA hoặc thông qua hoạt độ một

số enzym chống oxy hóa như superoxyd dismutase (SOD), glutathion peroxydase (GPx) và trạng thái chống oxy hóa toàn phần (TAS) của cơ thể để

có thể đánh giá tình trạng stress oxy hóa [41]

Nhiễm vi rút viêm gan B mạn tính là một yếu tố nguy cơ quan trọng trong sinh bệnh học của viêm gan mạn tính, xơ gan và ung thư gan [51] Đột biến vùng lõi, vùng Pres và gen X là những yếu tố quan trọng trong sinh bệnh học của ung thư biểu mô tế bào gan [32], [91], [94] Cả hai đều được gắn liền với quá trình stress oxy hóa, quá trình này có thể gây tổn thương lipid, protein

và DNA ở mức độ tế bào Nhiễm HBV gây ra tình trạng stress oxy hóa [69], ở những bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính, quá trình peroxy hóa lipid và tổn thương DNA tăng cao [53], [58] Nghiên cứu của Sen V và cộng sự (2014) [97] trên các bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính, chỉ ra rằng tình trạng stress oxy hóa có liên quan đến mức độ mạn tính của bệnh Stress oxy hóa đóng một vai trò nhất định trong việc hình thành các chất sinh ung thư cũng như ảnh hưởng đến tiến triển của HCC [88]

Mức độ tổn thương gan gây ra bởi sự stress oxy hóa phụ thuộc vào hai yếu tố: (i) các loại và số lượng của gốc tự do và thời gian duy trì của nó trong

cơ thể, (ii) sự sẵn có của cơ chế phòng vệ phù hợp tế bào Nó là sự cân bằng giữa hai quá trình đối lập mà cuối cùng quyết định sự đóng góp của stress oxy hóa vào sinh bệnh học tổn thương gan trong các bệnh gan mạn tính [76]

1.4.1.1 Oxy hóa và tái oxy hóa lipid

Oxy hóa lipid là một quá trình phức tạp bao gồm ba giai đoạn chính: khởi đầu, lan truyền và kết thúc phản ứng Trong đó các axit béo không bão hòa đa (PUFA - thành phần chính ở màng tế bào) dễ bị tấn công nhất bởi các dạng oxy hoạt động (ROS) để tạo thành các gốc peroxyde vì chúng có chứa nhiều liên kết đôi mà ở giữa có cầu nối methylen (-CH2-)

Giai đoạn khởi đầu:

RH + O2 – >Ro + oOOH

RH – > Ro+ Ho Bước khởi đầu này có thể được xúc tác bởi một số yếu tố như: oxy, ánh sáng (tia UV), nhiệt lượng, và cả các ion kim loại của Fe, Cu…

Giai đoạn lan rộng:

Ro + O2 –> ROOo (gốc peroxyde) ROOo + R’H –> R’o + ROOH (hydroperoxyde)

Giai đoạn kết thúc:

ROOo + ROOo — > ROOR + Oo

ROOo + Ro –> ROOR

Ro + Ro –> R-R Trong đó, các gốc ROOo (hay LOO0 gọi là các sản phẩm oxy hóa lipid - Lipid Oxydation Products - LOPs) Những phản ứng này xúc tác cho các phản ứng khác Các gốc tự do sinh ra trong phản ứng oxy hóa lipid gây ra ảnh hưởng không nhiều lên màng tế bào do tuổi thọ ngắn Nhưng lipid peroxyde (LOO0) và các sản phẩm phân hủy của chúng (aldehyde, lipofuscin) là những chất ổn định với thời gian bán hủy dài hơn lại là các trung tâm hoạt động làm gia tăng các phản ứng oxy hóa (hay còn gọi là tái oxy hóa lipid) gây tổn thương màng tế bào, DNA và protein [21]

Các sản phẩm cuối cùng của quá trình oxy hóa lipid được nghiên cứu nhiều nhất bao gồm malondialdehyde (MDA), isoprostanes, acrolein, và 4-hydroxy-2 nonenal (HNE) Trong số đó, MDA là một trong những chỉ số thường được sử dụng để đánh giá tình trạng stress oxy hóa do sự ổn định của

nó Nhiều nghiên cứu cho thấy nồng độ MDA cao hơn đáng kể ở những bệnh nhân bị viêm gan B so với những người khỏe mạnh [66], [80], [97] Ở bệnh nhân nhiễm HBV người ta phát hiện sự gia tăng MDA cấp (một sản phẩm của peoroxy hóa lipid) điều đó chỉ ra rằng stress oxy hóa tăng lên khi bị nhiễm HBV [18] Sau khi điều trị với interferon - α và lamivudine, có giảm nồng độ các sản phẩm của quá trình peoroxy hóa lipid và tăng các enzym chống oxy hóa, chẳng hạn như SOD và GPx , so với trước điều trị [18]

Tuy nhiên một nghiên cứu khác cho thấy có sự gia tăng đáng kể về mức

độ MDA ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính, nhưng không có sự khác biệt

đáng kể giữa những người viêm gan B mạn tính có chỉ định điều trị và những người nhiễm HBsAg không triệu chứng [41] Ngoài ra, Jasim R.H [59] nhận thấy không có sự khác biệt nồng độ MDA giữa bệnh nhân nhiễm HBV không phải giai đoạn cấp với nhóm chứng khỏe mạnh Có tác giả cho rằng quá trình peroxyd hóa chất béo và các sản phẩm phụ của nó có thể kích hoạt các tế bào hình sao gan và dẫn đến sự hình thành xơ gan [115] Bên cạnh đó trong thực nghiệm của mình Severi T và cộng sự [98] sử dụng dòng tế bào HepAD38 để

so sánh sự ảnh hưởng của quá trình nhân lên của vi rút HBV đối với các đặc tính của tế bào, kết quả cho thấy mặc dù sự nhân lên của HBV tạo ra stress oxy hóa, nhưng nó không ảnh hưởng đáng kể đến quá trình oxy hóa lipid (ảnh hưởng đến nồng độ MDA) Kết quả này cho thấy quá trình oxy hóa lipid cũng

có thể xảy ra ở nơi khác bên ngoài tế bào gan

Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu khác nhau được thực hiện trong lĩnh vực này nhưng hầu hết mới dừng lại nghiên cứu MDA ở trong huyết tương,

do đó các nghiên cứu trong tương lai có thể tập trung nhiều hơn vào việc đo các sản phẩm khác của quá trình oxyd hóa lipid chứ không phải là MDA và cũng đánh giá nồng độ trong tế bào gan hơn là giá trị trong huyết tương

1.4.1.2 Oxy hóa protein

Việc dư thừa các gốc tự do cũng có thể gây tổn hại protein bằng nhiều con đường khác nhau Các sản phẩm của quá trình oxy hóa protein bao gồm các oxyt lưu huỳnh, hydroxyd protein, 3-nitrotyrosine, và các dẫn chất carbonyl Trong số đó, các protein được cacbonyl hóa (protein CO) là dấu hiệu thích hợp để nghiên cứu trạng thái stress oxy hóa khi chúng được tạo ra sớm hơn và ổn định hơn [38]

Trái ngược với quá trình oxy hóa lipid, các nghiên cứu oxy hóa protein

là rất ít, mặc dù các sản phẩm oxy hóa protein tương đối ổn định và có các dấu hiệu tương quan thuận với trạng thái stress oxy hóa Trong một nghiên cứu được thực hiện bởi Namiduru E.S và cộng sự [80] không có sự khác biệt

có ý nghĩa giữa mức nitrotyrosine huyết tương của người khỏe mạnh và bệnh nhân viêm gan B mãn tính Ngược lại sự tích tụ nitrotyrosine trong gan đã được báo cáo ở những bệnh nhân bị bệnh gan do vi rút nhưng không xuất hiện

ở những bệnh nhân bị bệnh gan không phải do vi rút [19] Những phát hiện này cho thấy có sự tăng lên của nitơ oxyt trong mô gan của bệnh nhân mắc bệnh gan do vi rút nhưng không thấy phản ánh trong huyết tương của bệnh nhân

Carbonyl có thể được sản xuất bởi hầu hết các loài ROS và do đó không phản ánh nguồn oxy hóa Trong một nghiên cứu được thực hiện bởi Tasdelen Fisgin N và cộng sự [103], ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính có tăng mức carbonyl đáng kể so với nhóm chứng, đồng thời có một sự tương quan mức độ yếu giữa nồng độ HBV - DNA với mức carbonyl Hơn nữa, tăng carbonyl huyết tương cũng được ghi nhận ở những bệnh nhân HCC do HBV [88]

Qua các nghiên cứu trên cho thấy, mức độ gia tăng của mỗi sản phẩm

có thể làm sáng tỏ cơ chế sinh bệnh của cơ thể Mỗi protein có một chức năng duy nhất dẫn đến một rối loạn chức năng duy nhất nếu được sửa đổi Vì vậy, cần tập trung nhiều hơn vào các nghiên cứu quá trình oxy hóa protein Không

có một phương pháp tốt nhất để đo oxy hóa protein và mỗi phép đo có ý nghĩa riêng

1.4.1.3 Oxy hóa DNA

Các gốc tự do có thể gây ra tổn thương DNA ở các mức độ khác nhau,

từ đó có thể dẫn đến đột biến và sự mất ổn định của bộ gen [27]

Các marker 8 hydroxydeoxyguanosine (8- OHdG ) là hữu ích trong việc ước tính thiệt hại DNA gây ra do stress oxy hóa [51], [53], [100] Ở bệnh nhân viêm gan mạn tính B người ta phát hiện thấy sự tích tụ của 8 – OhdG [44]

Nghiên cứu của Piciocchi M và cộng sự (2016) [86] cho thấy có mối tương quan giữa hàm lượng 8OHdG trong mô gan và nồng độ ALT huyết thanh ở những bệnh nhân nhiễm vi rút viêm gan B hoặc C nhưng không mắc ung thư gan Hơn nữa, ở những bệnh nhân viêm gan B mạn tính có sự gia tăng 8OHdG theo tiến triển của bệnh từ giai đoạn sớm (F1) đến giai đoạn sau (F4) và cuối cùng là HCC Sự gia tăng này là có ý nghĩa thống kê khi so sánh

sự gia tăng 8OHdG ở giai đoạn tiến triển so với giai đoạn không xơ hóa (F0)

Những sản phẩm đột biến của vùng Pres được tích tụ, gây ra sự biến đổi protein L ở lưới nội chất (ER) của tế bào gan [87], [102] Một số lượng đáng

kể các dữ liệu thực nghiệm đã khẳng định khả năng gây ung thư do các sản phẩm đột biến của vùng Pres tích tụ ở lưới nội chất bằng con đường stress oxy hóa Sự có mặt của tế bào Huh-7 – sản phẩm đột biến của vùng pre-S (một hình thức cắt ngắn của Pres/ S polypeptide ) thể hiện mức độ tăng cao của ROS và tổn thương DNA thông qua lưới nội chất (ER) bằng con đường strss oxy hóa [51] Stress Oxy hóa gây thiệt hại DNA cũng đã được quan sát thấy trong gan của những con chuột biến đổi gen mang đột biến pre –S [56]

Hình 1.4 Stress oxy hóa gây ra bởi HBV

Nguồn: Martin R Higgs et al (2014)[53]

Như vậy các nghiên cứu trên khẳng định sự có mặt của quá trình oxy hóa và tổn thương DNA ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính, các nghiên cứu tiếp theo nên tập trung nhiều hơn vào quá trình oxy hóa DNA vì đây là điều cần thiết nhất cho sự đột biến và phát triển ung thư

1.4.2 Vai trò của các chất chống oxy hóa ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính

Hệ thống các chất chống oxy hoá trong cơ thể bao gồm các chất có bản chất enzym (ví dụ glutathione, catalase, superoxyde dismutase, glutathione peroxydase .) và các chất chống oxy hoá không có bản chất enzym (ví dụ như vitamin C, vitamin E, carotenoid, polyphenol ) Tìm hiểu rõ hơn về tình trạng chống oxy hoá ở bệnh nhân viêm gan B và những tác động mà liệu pháp

do chất chống oxy hoá mang lại sẽ góp phần nâng cao hiểu biết hơn nữa về bệnh lý viêm gan do vi rút B

Một số nghiên cứu đã cho thấy sự thiếu hụt chất oxy hóa ở bệnh nhân viêm gan B có thể gây trở ngại cho hiệu quả của quá trình điều trị Vì vậy, hệ thống các chất chống oxy hóa này cần được tăng cường để giảm stress oxy hóa và cải thiện kết quả điều trị Tuy nhiên, về mặt lâm sàng, hiệu quả điều trị không phải lúc nào cũng đạt được như mong muốn Ví dụ, nghiên cứu của Shi X.F (2005) [99]cho biết N-acetylcystein là một liệu pháp bổ trợ an toàn và hiệu quả cho bệnh nhân viêm gan do vi rút B, trong khi Shohrati M (2010) [100] lại kết luận ngược lại

Khi đánh giá về hoạt độ các chất chống oxy hóa ở bệnh nhân viêm gan

B mạn tính cũng có nhiều kết quả trái chiều Ví dụ, một số nghiên cứu đã báo cáo hoạt độ GPx giảm ở các bệnh nhân viêm gan B mạn tính [103], [73], trong khi một nghiên cứu khác cho thấy GPx tăng lên [34] Lý giải cho sự bất thường này có thể là do cơ chế bù trừ thường thấy ở giai đoạn đầu của bệnh Một nghiên cứu của Kulinsky V.I và cộng sự [65] báo cáo sự gia tăng GPx huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B cấp tính, nhưng khi phân tích kỹ hơn, tác giả nhận thấy mặc dù mức GPx huyết tương ban đầu tăng, nó bắt đầu giảm khi bệnh trở nên trầm trọng hơn hoặc khi chuyển sang mạn tính Như vậy, cơ chế bù trừ có thể xảy ra, nhưng chủ yếu xuất hiện ở giai đoạn bắt đầu bệnh

Wang K và các cộng sự [109] cho thấy hàm lượng axit ascorbic (vitamin C) tăng ở bệnh nhân viêm gan loại B mạn tính có mức ALT bình thường so với hàm axit ascorbic ở nhóm chứng (p< 0,01), kết quả này là không được mong đợi bởi vì dự kiến theo lý thuyết các chất chống oxy hoá sẽ giảm Tuy nhiên, tác giả cũng nhận thấy có sự tương quan âm (r = - 0.64) giữa hàm lượng axit ascorbic và ALT ở bệnh nhân viêm gan loại B mạn tính

Các kết quả mâu thuẫn trong đánh giá hoạt độ chất chống oxy hoá ở bệnh nhân viêm gan B có thể ít nhất được giải thích một phần thông qua khái

niệm "khoảng trống bù đắp", đây là giai đoạn của bệnh, trong đó mức độ / hoạt động chống oxy hoá tăng lên do cơ chế bù đắp Khi không còn khả năng

bù đắp, hoạt độ chống oxy hóa bắt đầu giảm xuống dưới mức bình thường và mỗi chất chống oxy hoá có thể có khoảng cách bù đắp khác nhau

Tsai S.M và cộng sự [106] nghiên cứu ở các bệnh nhân HCC có nhiễm

vi rút viêm gan B tối thiểu 20 năm và loại trừ các trường hợp nhiễm hoặc đồng nhiễm vi rút viêm gan C Kết quả nghiên cứu cho thấy, hoạt độ SOD tăng (những bệnh nhân này do đó có thể vẫn còn khoảng cách bù trừ); trong khi glutathione, vitamin C, vitamin A giảm (những bệnh nhân này đã qua khoảng cách bù trừ); GPx và vitamin E không có sự thay đổi đáng kể (có thể vượt qua khoảng cách) so với nhóm chứng

Những phát hiện trên có thể là do khoảng trống bù trừ cụ thể của từng chất chống oxy hóa khác nhau, nhưng các yếu tố của cơ địa, của các yếu tố bên ngoài khác cũng có thể ảnh hưởng đến “khoảng trống bù trừ” làm lệch những khoảng trống này sang bên phải hoặc bên trái

Ngoài ra, các yếu tố khác chẳng hạn như phương pháp luận, cỡ mẫu, phân tích thống kê, vị trí lấy mẫu, tiền sử của bệnh, nhóm nghiên cứu, nhà cung cấp, vv có thể tạo ra các kết quả trái ngược nhau

1.5 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về hoạt độ SOD, GPx và TAS

ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính

Acar A và cộng sự (2009) [18] tiến hành nghiên cứu xác định vai trò của stress oxy hóa gây tổn thương gan ở những bệnh nhân bị viêm gan B và hiệu quả của hệ thống enzyme chống oxy hóa Mười chín bệnh nhân nhiễm viêm gan B cấp tính, 17 bệnh nhân viêm gan B mạn tính, 24 bệnh nhân có HBsAg (+) ở thể không hoạt động và 21 người khỏe mạnh đã được đưa vào nghiên cứu Kết quả cho thấy, trong tất cả các nhóm bệnh nhân, mức độ MDA hồng cầu được phát hiện cao hơn so với nhóm chứng (p <0,05) Hoạt động của SOD được tìm thấy là cao nhất trong viêm gan B cấp tính (p <0,05), và thấp

nhất trong nhóm viêm gan B mạn tính (p <0.05) so với các nhóm khác Một mối tương quan tích cực đáng kể đã được xác định giữa MDA giá trị và mức ALT huyết thanh, trước và sau khi điều trị (p <0,05)

Phát hiện của sự gia tăng mức độ MDA (là một sản phẩm của peoroxy hóa lipid) trong tất cả các nhóm bệnh nhân, chỉ ra rằng stress oxy hóa tăng lên

do nhiễm HBV Mối tương quan giữa mức độ MDA hồng cầu và mức ALT huyết thanh hỗ trợ các giả thuyết liên quan đến vai trò của stress oxy hóa trong sinh bệnh học của nhiễm HBV Suy giảm khả năng chống oxy hóa trong nhóm viêm gan B mạn tính và ở nhóm HBsAg (+) ở thể không hoạt động có thể dẫn đến sự tiến triển của bệnh và kết quả ở bệnh nhân xơ Điều trị bằng IFN-alpha cộng với lamivudine làm giảm trong các sản phẩm của peoroxy hóa lipid và cho thấy hoạt động chống oxy hóa thông qua tăng các enzym chống oxy hóa Những dữ liệu này cho thấy rằng việc bổ sung các tác nhân chống oxy hóa IFN-alpha và điều trị kết hợp lamivudin có thể là hữu ích trong điều trị CHBV

Theo tác giả Medina J và Moreno-Otero R (2005) [76]: Mức độ tổn thương gan gây ra bởi sự stress oxy hóa phụ thuộc vào hai yếu tố : (i) các loại

và số lượng của gốc tự do và thời gian duy trì của nó trong cơ thể , (ii) sự sẵn

có của cơ chế phòng vệ phù hợp tế bào Nó là sự cân bằng giữa hai quá trình đối lập mà cuối cùng quyết định sự đóng góp của stress oxy hóa vào sinh bệnh học tổn thương gan trong các bệnh gan mạn tính

Bolukbas C và cộng sự (2005) [24] tiến hành đánh giá tình trạng oxy hóa ở những bệnh nhân với các thể lâm sàng của nhiễm viêm gan B mạn tính Nghiên cứu được tiến hành trên 33 bệnh nhân viêm gan mạn tính, 31 bệnh nhân mang HBsAg ở thể không hoạt động, 12 bệnh nhân xơ gan, và 16 người khỏe mạnh Kết quả cho thấy tổng số chất chống oxy hóa thấp hơn đáng kể ở nhóm xơ gan so với nhóm chứng và nhóm không hoạt động (p = 0.008 và p = 0.008, tương ứng) Tổng số peroxyde và chỉ số oxy hóa cao hơn đáng kể trong

xơ gan (p <0.001) và viêm gan B mạn tính (p <0.001) so với nhóm không hoạt động và nhóm chứng Nồng độ alanine amino transferase tương quan thuận với tổng mức peroxyde và chỉ số oxy hóa chỉ có trong 2 nhóm nhiễm vi rút viêm gan B (p = 0,002, r = 0,519 và p = 0.008, r = 0,453, tương ứng với từng nhóm)

Tsai S.M và cộng sự (2009) [106] nghiên cứu trên 54 bệnh nhân HCC

có nhiễm HBV trên 20 năm và 57 bệnh nhân khỏe mạnh bình thường trong nhóm chứng để xác định trạng thái oxy hóa khử ở các bệnh nhân HCC gây ra bởi HBV Kết quả cho thấy ở 54 bệnh nhân HCC, hoạt độ của SOD và GPx máu cao hơn đáng kể hơn so với nhóm chứng Ngoài ra, có không có thay đổi đáng kể hoạt độ của GPx so với lượng vitamin E

Chrobot A.M và cộng sự (2000) [34], nghiên cứu ở 100 trẻ em nhiễm vi rút viêm gan B hoặc C mạn tính Tất cả các bệnh nhân đều được đo nồng độ catalase (CAT), superoxyde dismutase (SOD) và Glutathione peroxydase (GPx) Kết quả cho thấy, có sự giảm đáng kể hoạt động CAT và SOD và tăng GPx ở trẻ em nhiễm vi rút viêm gan B hoặc C mạn tính

Çıragil P và cộng sự (2011) [36] tiến hành nghiên cứu đánh giá tình trạng oxy hóa / chất chống oxy hóa trong huyết thanh bệnh nhân viêm gan B

và C Nghiên cứu được tiến hành trên 20 bệnh nhân viêm gan B, 20 bệnh nhân viêm gan C và 30 người khỏe mạnh Kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt

độ SOD ở nhóm chứng là 31,5 ± 0,53 U/ mg protein cao hơn hẳn so với nhóm bệnh nhân viêm gan B 3,20 ± 0,58 U/ mg protein và nhóm bệnh nhân viêm gan C 2,60 ± 0,47 U/ mg protein, sự khác biệt là có ý nghĩa với p < 0,001

Ở Việt Nam, hiện đã có những công trình nghiên cứu về các chất chống oxy hóa ở những bệnh nhân tim mạch, nghiện rượu, nhiễm độc mạn tính… nhưng chưa có công trình nào nghiên cứu một cách đầy đủ ở bệnh nhân nhiễm vi rút B mạn tính Đây cũng là lý do vì sao chúng tôi thực hiện luận văn này

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành trên 2 nhóm (nhóm bệnh và nhóm chứng) Đối tượng được chọn vào 2 nhóm tương đương nhau về tuổi và giới

- Nhóm bệnh: gồm 55 bệnh nhân được chẩn đoán viêm gan B mạn tính hoạt động, điều trị nội trú tại Khoa Nội truyền nhiễm Bệnh viện 103 trong thời gian từ tháng 4/ 2013 – tháng 1/ 2015