Sau khi kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA được tách chiết bằng phương pháp đo mật độ quang, tất cả các DNA đều đảm bảo cho phản ứng PCR (trình bày trong Bảng 3.1), bước tiếp theo của nghiên cứu này là khuếch đại exon 2, 3 của gen SRD5A2 với các cặp mồi đặc hiệu bằng kỹ thuật PCR đơn mồi.
Kết quả của phản ứng PCR phụ thuộc vào nhiều yếu tố như chất lượng và nồng độ DNA khuôn, nồng độ và thiết kế mồi, dung dịch đệm, nồng độ các nucleiotid tự do, enzym Taq polymerase và chu trình nhiệt của phản ứng. Đối với phản ứng PCR, chỉ cần một sai sót nhỏ cũng có thể dẫn đến phản ứng không thành công.
Về thành phần phản ứng, thành phần tham gia phản ứng PCR bao gồm: DNA khuôn, dung dịch Master Mix, mồi xuôi, mồi ngược và nước PCR. Chất lượng DNA đều đảm bảo về nồng độ và độ tinh sạch giúp cho phản ứng PCR đạt hiệu suất cao thông qua phương pháp đo mật độ quang học (trình bày trong Bảng 3.1). Mồi được thiết kế trình tự theo các nghiên cứu đã sử dụng
thành công và sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sau khi nhận mồi từ nhà sản xuất, tối ưu nồng độ mồi bằng cách tiến hành pha loãng mồi với các nồng độ khác nhau, sau đó tiến hành mix phản ứng PCR với mỗi nồng độ đã pha loãng và các thành phần khác của phản ứng đều giữ nguyên. Tiến hành điện di các sản phẩm PCR tương ứng với từng nồng độ mồi, dựa vào kết quả điện di, chúng tôi đã chọn được nồng độ mồi tối ưu nhất là 5 pmol/µl. Nước PCR được sử dụng là nước cất được khử ion, không có chứa DNAase, RNAase, enzym cắt giới hạn, không có thành phần gây ức chết phản ứng PCR. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng One Taq Hot Start 2X Master Mix with GC Buffer với thành phần bao gồm enzym Taq polymerase, các nucleotid tự do với nồng độ thích hợp và dung dịch đệm với pH phù hợp giúp rút ngắn thời gian các phản ứng, không phải thực hiện nhiều thao tác thủ công để phản ứng PCR diễn ra tốt nhất.
Để phản ứng PCR đạt hiệu suất cao thì chu trình nhiệt của phản ứng phù hợp là vô cùng quan trọng. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR gồm 3 giai đoạn: (1) giai đoạn biến tính, (2) giai đoạn gắn mồi, (3) giai đoạn kéo dài chuỗi. Giai đoạn biến tính là giai đoạn chuỗi xoắn kép DNA khuôn bị biến tính, tách khỏi nhau thành hai mạch đơn, thường trong khoảng 90-95°C. Giai đoạn gắn mồi là giai đoạn nhiệt độ gắn mồi được hạ xuống thích hợp cho phép các đoạn mồi gắn với DNA sợi khuôn, thường trong khoảng 55-65°C. Giai đoạn kéo dài là giai đoạn nhiệt độ được nâng lên đến nhiệt độ tối ưu của enzym Taq polymerase xúc tác cho quá trình kéo dài chuỗi, thường là 72°C. Nhiệt độ ở giai đoạn biến tính và kéo dài ít có sự biến đổi do không phụ thuộc vào kích thước đoạn gen và đoạn mồi sử dụng với mức nhiệt chung thường 95°C (giai đoạn biến tính) và 72°C (giai đoạn kéo dài). Còn nhiệt độ gắn mồi phụ thuộc vào kích thước và trình tự của đoạn mồi sử dụng do đó cần tính toán, chuẩn nhiệt độ phù hợp với từng trình tự mồi khác nhau. Trong nghiên
cứu này, chúng tôi đã chọn nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho exon 2, 3 của gen SRD5A2 là 57 °C, nhiệt độ kéo dài là 68 °C do enzym Taq polymerase sử dụng trong kit hóa chất được khuyến cáo hoạt động được tối ưu ở 68 °C.
Sau khi lựa chọn thành phần và chu trình nhiệt tối ưu cho phản ứng PCR xong, tiến hành khuếch đại exon 2, 3 của gen SRD5A2 trên ba mẫu bệnh nhân (trình bày trong Bảng 2.2 và 2.3). Phản ứng PCR có độ nhạy rất cao, do đó, cần tiến hành mix phản ứng PCR trong tủ an toàn sinh học, dụng cụ cần đảm bảo và hóa chất cần đảm bảo không nhiễm tạp chất.
Để kiểm tra kết quả của phản ứng PCR, tất cả sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1,5%. Phản ứng PCR đạt hiệu quả khi trên hình ảnh điện di có một băng DNA duy nhất, sáng rõ nét, tương ứng với kích thước mong muốn, không có các băng phụ, không có các hiện tượng nhiễu, đứt đoạn. Sau khi tiến hành phản ứng, kết quả nghiên cứu (Hình 3.2) cho thấy băng kích thước đúng vị trí của exon 2 là 338bp và exon 3 là 350bp, hình ảnh rõ nét, không có tín hiệu nhiễu, chứng tỏ các cặp mồi được sử dụng đặc hiệu, thành phần và chu trình nhiệt tối ưu, giúp phản ứng PCR đạt hiệu quả cao.
4.3. Kết quả giải trình tự exon 2, 3 của gen SRD5A2
Hiện nay, trong lĩnh vực sinh học nói chung và sinh học phân tử nói riêng thì giải trình tự gen là một kỹ thuật hết sức quan trọng. Giải trình tự gen là nhu cầu tất yếu trong xu thế phát triển nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử như định danh, định type virus, trong sản xuất vacxin… trong đó không thể không kể đến xác định đột biến gen. Phương pháp giải trình tự gen giúp việc xác định đột biến gen SRD5A2 trở nên dễ dàng và độ chính xác cao. Năm 1977, F. Sanger và cộng sự đã phát minh kỹ thuật giải trình tự gen bằng phương pháp enzym, trên cơ sở của phương pháp này người ta phát triển máy giải trình tự gen tự động. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng phương
pháp giải trình tự gen trên máy tự động để xác định trình tự các nucleotid của exon 2, 3 trên gen SRD5A2.
Để kết quả giải trình tự chính xác, độ tin cậy cao cần đảm bảo kỹ thuật cũng như các điều kiện của phản ứng diễn ra tốt nhất. Giải trình tự gen trên máy tự động đã hạn chế được các thao tác thủ công, cho kết quả chính xác. Kỹ thuật này sử dụng các đoạn mồi tương ứng với các exon dùng trong phản ứng PCR trước đó. Tuy nhiên, yếu tố quyết định kết quả giải trình tự phải kể đến là sản phẩm PCR. Trong nghiên cứu, chúng tôi đã chuẩn hóa quy trình kỹ thuật, dụng cụ, hóa chất để phản ứng PCR diễn ra tối ưu nhất, trước khi tiến hành giải trình tự chúng tôi đã kiểm tra sản phẩm PCR với hình ảnh băng điện di rõ nét, không bị đứt gãy, không bị có vạch phụ đảm bảo mới tiến hành giải trình tự (Hình 3.2). Từ đó, kết quả giải trình tự thu được hình ảnh rõ nét, tín hiệu nền thấp, không bị nhiễu, có thể đọc và phân tích kết quả rõ ràng, chính xác.
Sản phẩm PCR sau khi kiểm tra được đem tiến hành giải trình tự trên máy tự động và phân tích bằng phần mềm máy tính. Sau khi giải trình tự, chúng tôi tiến hành đọc và phân tích kết quả với exon 2, 3 trên 3 bệnh nhân, chúng tôi không phát hiện được biến đổi nào nằm trên exon 2, 3 của gen SRD5A2 trên các bệnh nhân nghiên cứu. Tuy nhiên, ở một nghiên cứu khác cũng tiến hành với 3 bệnh nhân như nghiên cứu nhưng trên 5 exon của gen SRD5A2, đã phát hiện được các đột biến nằm trên các exon còn lại, các đột biến này đã được tìm thấy trước đó và được chứng minh có liên quan đến bệnh thiếu hụt enzym 5α-reductase tuýp 2. Trong khuôn khổ đề tài nghiên cứu, chỉ tiến hành trên exon 2, 3 chưa thể phát hiện đột biến gen SRD5A2, còn có đột biến trên exon khác nên cần quan sát cụ thể trên toàn bộ gen của bệnh nhân khi so sánh, phân tích chẩn đoán kết quả phân tích gen với các biểu hiện lâm sàng.
Đến nay, hơn 100 đột biến gen SRD5A2 đã được mô tả trên thế giới [18]. Các nghiên trên thế giới có tìm thấy đột biến trên exon 2 như nghiên cứu
diễn ra đại học Bang Campina, Brazil tiến hành trên hai chị em người Brazil được chẩn đoán thiếu hụt enzym 5α-reductase tuýp 2 đã phát hiện được 1 đột biến p.Gln126Arg (c.379 G>A) trên exon 2. Đột biến này gây bất hoạt hoàn toàn hoạt động của enzym 5α-reductase 2 trong tế bào. Nghiên cứu đã cho thấy, xác định đột biến gen SRD5A2 góp phần chẩn đoán thiếu hụt enzym 5α- reductase tuýp 2 trong một gia đình [19]. Mặc dù trong nghiên cứu này chúng tôi đã chọn lựa bệnh nhân có chẩn đoán đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của bệnh rõ ràng, tối ưu tất cả các quy trình, tuy nhiên chúng tôi không phát hiện được đột biến trên exon 2 của gen SRD5A2 trong số 3 bệnh nhân nghiên cứu.
Một nghiên cứu trên 6 bệnh nhân người Ý có bộ nhiễm sắc thể là 46, XY với bộ phận sinh dục ngoài chủ yếu là nữ, trong đó đã xác định được 5 đột biến sai nghĩa, 1 đột biến vô nghĩa và một đa hình được xác định. Bốn bệnh nhân có đột biến đồng hợp tử, đó là các đột biến nằm ở exon 2 (Cys133Gly), exon 4 (Gly196Ser và Ala207Asp) và exon 5 (Tyr235Phe). Một bệnh nhân mang đột biến dị hợp tử vô nghĩa nằm ở exon 1 (Trp53X) và thay đổi trong exon 5 (Tyr235Phe). Nghiên cứa đã chỉ ra rằng đột biến gen SRD5A2 gây ảnh hưởng trên bệnh nhân thiếu hụt enzym 5α-reductase tuýp 2 [20].
Sau khi thực hiện tất cả các quy trình, chúng tôi nhận thấy rằng có thể xác định đột biến gen SRD5A2 theo quy trình đã xây dựng. Trong khuôn khổ khóa luận tốt nghiệp, với cỡ mẫu nhỏ chỉ tiến hành nghiên cứu trên 3 bệnh nhân, cũng như số lượng exon nghiên cứu chưa đủ chỉ nghiên cứu 2 trong tổng số 5 exon của gen SRD5A2 nên chúng tôi chưa thể khẳng định tỷ lệ phát hiện đột biến SRD5A2 cũng như những nghiên cứu chuyên sâu về ảnh hưởng của đột biến đến cấu trúc và chức năng của phân tử protein. Do vậy, cần có những nghiên cứu mở rộng hơn về cỡ mẫu và số lượng exon (5 exon) để đưa ra thống kê về danh sách và tỉ lệ đột biến trên quần thể người Việt Nam, cũng như kết luận về mối liên quan giữa đột biến gen SRD5A2 và bệnh thiếu hụt enzym 5α-reductase tuýp 2. Từ cơ sở đó, các bác sỹ lâm sàng có thể đưa ra
phương pháp điều trị sớm, chăm sóc hiệu quả nhất đối với gia đình và bệnh nhân thiếu hụt enzym 5α-reductase tuýp 2.
KẾT LUẬN
Căn cứ vào kết quả và những phân tích phía trên, chúng tôi đưa ra kết luận như sau:
• Xây dựng được quy trình xác định đột biến gen SRD5A2 trên bệnh nhân thiếu hụt enzym 5α-reductase tuýp 2.
53(1), 1-8.
2. Hughes IA, Houk C, Ahmed SF và các cộng sự. (2006). Consensus statement on management of intersex disorders. Arch Dis Child, 91, 554– 563.
3. New MI, Lekarev O, Parsa A, Yuen T, O’Malley B. Genetic Steroid Disorders.
4. Yuan-Shan Zhua, Guang-Huan Sun. (2005). 5α-Reductase Isozymes in the Prostate. Author manuscript, 25(1), 1-12.
5. Zhu, Y, Imperato-McGinley, J, Glob. (2008). Male Sexual Differentiation Disorder and 5α-Reductase-2 Deficiency. The Global Library of Women s
Medicine, 3-4
6. Costa EMF, Domenice S, Sircili MH và các cộng sự. (2012). DSD Due to 5 alpha-Reductase 2 Deficiency - from Diagnosis to Long Term Outcome.
Seminars in Reproductive Medicine, 30, 427-431.
7. Hay ID, Wass JA. (2009). Clinical Endocrine Oncology, 2, 37.
8. Jean D. Wilson, Geoffrey Shaw và các cộng sự. (2002). The marsupial model for male phenotypic development. Trends in Endocrinology &
Metabolism, 13, 79-80.
9. SRD5A2 gene, https://ghr.nlm.nih.gov/gene/SRD5A2
10. Normington K, Russell DW. (1992). Tissue distribution and kinetic characteristics of rat steroid 5 alpha-reductase isozymes. Evidence for distinct physiological functions. J Biol Chem, 267, 903-904.
11. Leonard S Marks, MD. (2004). 5α-Reductase: History and Clinical Importance. Review in Urology, 6(9), 11-21.
13. Angel On Kei Chan, Betty Wai Man But, Ching Yin Lee và các cộng sự. (2013). Diagnosis of 5α-Reductase 2 Deficiency: Is Measurement of Dihydrotestosterone Essential? Clinical Chemistry, 59(5), 3.
14. Tạ Thành Văn (2010). PCR và một số kỹ thuật y sinh học phân tử, Nhà xuất bản Y học Hà Nội.
15. Sanger F và các cộng sự. (1977). DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A, 74(12), 3-7.
16. Chidgeavadze Z.G, Beabealashvilli R.S, Atrazhev A.M et al. (1984). 2',3'- Dideoxy-3' aminonucleoside 5'-triphosphates are the terminators of DNA synthesis catalyzed by DNA polymerases. Nucleic Acids Res, 12(3), 1671–1686.
17. Heather J.M, Chain B. (2016). The sequence of sequencers: The history of sequencing DNA. Genomics, 107(1), 1-8.
18. Cơ sở dữ liệu đột biến gen người, http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php 19. Leme de Calais FL, SoardiFC, Petroli RJ và các cộng sự. (2011). Molecular diagnosis of 5 α-reductase type II deficiency in Brazilian siblings with 46, XY disorder of sex development. International Journal
of Molecular Sciences, 12(12), 1-2.
20. Baldiontti F, Majore S, Fogli A và các cộng sự. (2007). Molecular characterizatoin of 6 unrelated Italian patients with 5-alpha-reductace type 2 deficiency. Journal of Andronogy, 29(1), 3-6.