BÀN LUẬN
4.1. Kết quả tách chiết DNA
Trong những năm gần đây, sinh học phân tử đã có những bước phát triển vượt bậc với nhiều thành tựu to lớn ứng dụng rộng rãi vào các lĩnh vực của đời sống, đặc biệt là trong lĩnh vực y học. Các kỹ thuật sinh học phân tử đã giúp cho việc chẩn đoán và điều trị bệnh nhanh, chính xác góp phần đáp ứng nhiệm vụ chăm sóc, bảo vệ sức khỏe con người đạt hiệu quả hơn. Nhóm nghiên cứu đã tiến hành xác định đột biến trên gen SRD5A2 gây bệnh thiếu hụt enzym 5α-reductase tuýp 2. Nhóm nghiên cứu sử dụng phương pháp giải trình tự gen trên máy tự động để xác định đột biến. Gen SRD5A2 gồm 5 exon, tuy nhiên trong khuôn khổ nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu chỉ tiến hành trên 2 exon 2, 3 của gen.
Bước đầu tiên trong quy trình nghiên cứu là thu thập mẫu và tách chiết DNA. Khi tách chiết DNA cần phải đảm bảo DNA ở trạng thái nguyện vẹn tối đa, không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học, hóa học hoặc tác nhân sinh học do một số enzym nội bào, ngoại bào. DNA có thể được tách chiết từ nhiều tế bào có nhân trong cơ thể với nhiều phương pháp khác nhau. Chất lượng DNA có ảnh hưởng trực tiếp đến phản ứng PCR và các kỹ thuật sinh học phân tử tiếp theo. Do đó, tách chiết DNA là bước đầu tiên cũng là bước quan trọng để đảm bảo cho các bước tiếp theo của quy trình nghiên cứu. Tùy vào mục đích nghiên cứu mà người ta sử dụng kỹ thuật tách chiết DNA sao cho phù hợp, trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp tách chiết DNA từ máu ngoại vi theo kit QIAGEN, cụ thể là từ tế bào bạch cầu do có lượng lớn DNA. Đây là kit đã được thương mại hóa, và được thẩm định để tách chiết DNA trên mẫu bệnh nhân. Ưu điểm của phương pháp này dễ sử dụng, thực
hiện đơn giản, dễ làm, tốn ít thời gian hơn phương pháp PCI mà sản phẩm DNA thu được vẫn đảm bảo về nồng độ và độ tinh sạch. Tuy nhiên, phương pháp này vẫn còn một số nhược điểm như giá thành cao.
DNA được tách chiết không chỉ cần đảm bảo về số lượng mà còn đảm bảo về độ tinh sạch, không bị đứt gãy, không nhiễm hoặc lẫ
n ít tạp chất như protein, lipid, glucid và các thành phần khác gây ức chế phản ứng PCR. Nồng độ và độ tinh sạch của DNA cao đảm bảo cho phản ứng PCR tốt, giúp cho hình ảnh giải trình tự rõ nét, không bị nhiễu, dễ dàng nhận định hơn. Do đó, tất cả các mẫu DNA sau khi tách chiết cần được kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng phương pháp đo mật độ quang học trên máy NanoDrop One tại bước sóng 260nm và 280nm để kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA. Phương pháp này dựa trên khả năng hấp thụ ánh sáng khác nhau của các chất có trong dung dịch. Trong thành phần cấu tạo của DNA có các base purin và pyrimidine hấp thụ ánh sáng tử ngoại và đỉnh hấp thụ cực đại ở bước sóng 260nm. Do đó, giá trị mật độ quang ở bước sóng 260nm cho phép xác định nồng độ DNA trong mẫu theo công thức:
CDNA mạch đôi (ng/µl) = 50 x A260nm x n Trong đó:
A260nm: độ hấp thụ của dung dịch DNA ở bước sóng 260nm. 50: hệ số chuyển đổi của dung dịch có nồng độ DNA sợi đôi. n: hệ số pha loãng.
Ở bước sóng 280nm, các protein có mức hấp thụ cao nhất, tuy nhiên protein cũng hấp thụ ánh sáng tại bước sóng 260nm như DNA nên làm sai lệch giá trị thật của DNA. Do đó, tỷ số A260/A280 cho biết độ tinh sạch của mẫu tách chiết xem mẫu có lẫn nhiều hay ít tạp chất protein, tỷ lệ này thường dao động trong khoảng 1,8-2,0. Ngoài ra, máy còn tính được tỷ lệ A260/A230 cho
biết mẫu lẫn nhiều hay ít tạp chất như carbonhydrat, EDTA… mẫu được coi là sạch khi tỷ lệ này lớn hơn 2. Sau khi tách chiết, các mẫu DNA được bảo quản ở 4°C nếu sử dụng trong thời gian ngắn và -20°C nếu sử dụng trong thời gian dài.
Từ số liệu Bảng 3.1 về các thông số nồng độ và độ tinh sạch cho biết: Tất cả các mẫu DNA đều đảm bảo về nồng độ để thực hiện phản ứng PCR đạt hiệu quả tốt.
Tất cả các chỉ số A260/A280 đều nằm trong khoảng 1,8-2,0 và A260/A230 đều lớn hơn 2 cho thấy các mẫu DNA được tách chiết đều sạch, đảm bảo cho phản ứng PCR được thực hiện.