Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn acid acetic để sản xuất thử nghiệm giấm ăn từ nguyên liệu chuối tiêu (Musa acuminata Colla) bằng phương pháp lên men nhanh

Acid acetic là một acid hữu cơ quan trọng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp, đặc biệt là công nghiệp chế biến thực phẩm. Mục đích của nghiên cứu nhằm tuyển chọn chủng vi khuẩn acetic có khả năng tạo nhiều acid acetic và xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men. Phân lập được thực hiện trong môi trường YPGD bổ sung 4,0% (v/v) ethanol, 0,5% CaCO3 (w/v).

NGHIÊN CỨU KHOA HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN ACID ACETIC ĐỂ SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM GIẤM ĂN TỪ NGUYÊN LIỆU CHUỐI TIÊU (Musa acuminata Colla) BẰNG PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN NHANH ISOLATION AND SELECTION OF ACETIC ACID BACTERIA FOR THE TRIAL PRODUCTION OF VINEGAR FROM BANANAS (Musa acuminata Colla) USING RAPID FERMENTATION Bùi Văn Tú, Nguyễn Đức Thắng Email: buitu2802@gmail.com Trường Đại học Sao Đỏ Ngày nhận bài: 16/8/2018 Ngày nhận sửa sau phản biện: 21/9/2018 Ngày chấp nhận đăng: 28/9/2018 Tóm tắt Acid acetic acid hữu quan trọng ứng dụng rộng rãi nhiều ngành công nghiệp, đặc biệt công nghiệp chế biến thực phẩm Mục đích nghiên cứu nhằm tuyển chọn chủng vi khuẩn acetic có khả tạo nhiều acid acetic xác định yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men Phân lập thực môi trường YPGD bổ sung 4,0% (v/v) ethanol, 0,5% CaCO3 (w/v) Kết tuyển chọn 01 lồi vi khuẩn dự đốn Acetobacter tropicalis và đặt tên chủng A tropicalis SĐ01 Chủng tạo vịng halo có kích thước lớn thích nghi tốt với môi trường dịch ép chuối Mối quan hệ giá trị pH lên men, thời gian lên men, tỷ lệ men cái/nguyên liệu nồng độ ethanol với hàm lượng acid acetic khảo sát xác định thông qua phương pháp đáp ứng bề mặt Kết khảo sát điều kiện lên men acid acetic chủng Acetobacter tropicalis nhiệt độ phịng (26÷28oC), nồng độ ethanol dịch lên men 4,4%, pH lên men 6,5, thời gian lên men ngày, tỷ lệ giống/nguyên liệu 6,0% (men có mật độ vi khuẩn 107 TB/ml) Lượng acid acetic tạo thành 3,32% Từ khóa: Acetobacter; acid acetic; lên men acid acetic; vi khuẩn acetic; chuối Astract Acetic acid is an important organic acid that is widely used in many fields, especially in food industry The purpose of the study is to isolate and select acetic acid bacteria that could produce high level of acetic acid and determine the factors affecting fermentation Isolation was performed in a YPGD medium supplemented with 4.0% (v/v) ethanol, 0.5% CaCO3 (w/v) One strain was isolated and predicted as Acetobacter tropicalis and designated as A tropicalis SĐ01 This strain is able to create a large halo ring and adapt to banana material The relationship or corelation between factors: fermentation pH, fermentation time, yeast / material ratio and ethanol concentration with acetic acid was investigated by response surface methodology The parameters were determined as follows: fermentation at room temperature (26÷28oC), fermentation ethanol concentration 4.4%, pH 6.5, fermentation time of days, the rate of seed / material is 6.0% (female yeast has a bacterial density of 107 TB/ml) The amount of acetic acid formed is 3.32% Keywords: Acetobacter; acid acetic; acid acetic fermentation; acetic bacteria; banana ĐẶT VẤN ĐỀ Ở Việt Nam từ xa xưa, giấm sử dụng gia vị ẩm thực ngày giấm ứng dụng rộng rãi đời sống Nó khơng sử dụng nhiều cơng nghệ thực phẩm mà cịn ứng dụng nhiều ngành Người phản biện: PGS.TS Phan Thanh Tâm TS Bùi Văn Ngọc công nghiệp nhẹ, y học số loại mỹ phẩm dành cho phái đẹp Giấm loại gia vị truyền thống có tính acid, sản xuất rộng rãi từ gạo, mạch nha, táo, dạng rượu vang khác vật liệu nơng nghiệp (Horiuchi cộng sự, 1999) [2] Q trình lên men giấm trình hai giai đoạn với giai đoạn chuyển đổi kỵ khí loại đường lên men thành ethanol 98 Tạp chí Nghiên cứu khoa học - Đại học Sao Đỏ, ISSN 1859-4190 Số 3(62).2018 LIÊN NGÀNH HÓA HỌC - CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM nấm men, sử dụng lồi Saccharomyces, thứ hai q trình oxy hóa hiếu khí ethanol vi khuẩn, thường loài Acetobacter (Horiuchi cộng sự, 2000) [3] Giấm chuối có hàm lượng chất dinh dưỡng cao, tốt cho sức khoẻ, ngồi cịn có tác dụng làm đẹp Acid acetic chế biến từ nhiều nguồn nguyên liệu khác mật rỉ, nước hoa chín, tinh bột, cồn ứng dụng sản xuất sản phẩm giấm, sorbose, dihydroxyacetone, gluconate, keto-Dgluconates [14] Việt Nam nước thuộc khu vực nhiệt đới nên dồi nguồn nguyên liệu ứng dụng sản xuất acid acetic Chuối có sản lượng cao, giá thấp có thời gian sử dụng ngắn, nhanh chóng suy giảm với tỷ lệ lớn sau thu hoạch Lượng vitamin khoáng chất, đặc biệt kali, vitamin B6, vitamin C dồi [12] Trong báo cáo tổng hợp từ nghiên cứu, tiêu thụ 1,3÷1,4 g kali ngày giảm 26% nguy mắc bệnh tim mạch Catechin tìm thấy chuối chứng minh đem lại nhiều lợi ích cho sức khỏe, giảm nguy mắc bệnh tim mạch [14] Vi khuẩn acetic thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm hiếu khí bắt buộc, với khả oxy hóa ethanol thành acid acetic cho phép chúng sinh trưởng mơi trường có chứa ethanol [1] VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.1.1 Chuối Cây chuối tiêu thuộc Scitaminales, họ Musaceae, họ phụ Musoidae, chi Musa Chuối sử dụng chuối tiêu trồng khu vực Chí Linh, Hải Dương Yêu cầu kĩ thuật: Chuối có màu vàng đặc trưng, không bị hỏng, không bị thối,… Bảo quản nơi khơ ráo, thống mát 6-1:2010/BYT nước khống thiên nhiên nước uống đóng chai 2.1.3 Rượu Sản xuất Công ty cổ phần Cồn Rượu Hà Nội Địa chỉ: 94 Lị Đúc, Phạm Đình Hổ, Hai Bà Trưng, Hà Nội Đảm bảo theo QCVN 6-3:2010/BYT 2.1.4 Môi trường đệm: CH3COOH/CH3COONa Dung dịch pha theo TCVN 4320-86, đủ điều kiện dùng thực phẩm 2.1.5 Chất bảo quản: sorbate kali Yêu cầu: Sorbate kali dạng sùn, màu trắng, mùi đặc trưng dùng phụ gia thực phẩm, độ tinh khiết cao, đảm bảo tiêu chuẩn dùng thực phẩm đồ uống Xuất xứ: Trung Quốc 2.1.6 Enzyme pectinase Ảnh hưởng pH: phạm vi hoạt động pH từ 3,0 đến 5,0; pH tối ưu pH từ 3,5 đến 4,0 Ảnh hưởng nhiệt độ: Nhiệt độ hiệu dụng từ 25 đến 65oC, phạm vi nhiệt độ tối ưu từ 40 đến 55oC Enzyme pectinase phá vỡ thành tế bào trái làm giảm độ nhớt nước trái cây, tăng tốc độ trình lọc, giảm thời gian chế biến tăng cường trái cây, giảm chi phí, nâng cao chất lượng sản phẩm 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Thu thập mẫu để phân lập vi khuẩn acetic Ba mẫu dịch lên men từ thu thập bao gồm: Mẫu dịch lên men chuối; mẫu dịch lên men mơ; mẫu dịch lên men tự nhiên chuẩn bị phịng thí nghiệm Trường Đại học Sao Đỏ cách chuẩn bị dịch chuối, thêm nước, rượu loãng, mở nắp để điều kiện thường Vi khuẩn acid acetic phân lập sau: pha lỗng dịch lên men chuối đến nồng độ thích hợp cấy trải môi trường Yeast extract Peptone Glycerol D-glucose (YPGD: yeast extract g/l, peptone g/l, glycerol g/l D-glucose g/l) có bổ sung 4% v/v ethanol, 2% agar 0,5% CaCO3 Lấy ml mẫu cho vào mơi trường, ủ 30oC 1÷2 ngày, ủ 30°C 2÷3 ngày, cấy chuyển nhiều lần đến khuẩn lạc đạt độ Chọn khuẩn lạc tạo vịng halo mơi trường vi khuẩn acid acetic Quan sát kính hiển vi để xác định độ đồng tế bào vi khuẩn 2.2.2 Phân lập, tuyển chọn dòng vi khuẩn lên men acetic mạnh Hình Chuối tiêu (Musa acuminata Colla) 2.1.2 Nước Sử dụng nước xưởng nước Khoa Thực phẩm Hóa học, Trường Đại học Sao Đỏ Đạt QCVN Cấy ria dịng vi khuẩn lên mơi trường YPGD có bổ sung 0,5% CaCO3 4% ethanol, ủ 30ºC 24÷48 h, xác định tỉ lệ đường kính vịng halo đường kính khuẩn lạc, chọn dịng vi khuẩn có tỉ lệ lớn Thí nghiệm lặp lại ba lần Tạp chí Nghiên cứu khoa học - Đại học Sao Đỏ, ISSN 1859-4190 Số 3(62).2018 99 NGHIÊN CỨU KHOA HỌC Phương pháp định danh vi khuẩn dựa vào hình thái: Quan sát khuẩn lạc mắt thường Quan sát khả di động cách làm tiêu giọt treo Làm tiêu vi khuẩn không nhuộm màu nhuộm Gram theo phương pháp nhuộm vi khuẩn Christian Gram, soi kính hiển vi điện tử vật kính 100 Dự đốn tên vi khuẩn hình thái dựa miêu tả nhiều nguồn tài liệu (Nguyễn Lân Dũng, 1976 [8]; Nguyễn Đức Lượng, 2006 [7]; Nicholas Camu, 2007 [9]; Schwan RF, Wheals AE, 2004 [13] (X1), thời gian lên men (X2), tỉ lệ men cái/nguyên liệu (X3) nồng độ ethanol (X4) Thí nghiệm bố trí theo kiểu trực tâm quay (Rotatable Central Composite Design) ma trận thí nghiệm xây dựng phần mềm Design Expert 11.0 Trong nghiên cứu thăm dị, chúng tơi xác định giá trị biên nhân tố chiết trình bày bảng Trong số 27 thí nghiệm tiến hành (bảng 5), 16 (24) thí nghiệm hai mức (trên dưới), 8(2 × 4) thí nghiệm điểm thí nghiệm tâm Mỗi thí nghiệm tiến hành lặp lại ba lần lấy kết trung bình Mơ hình tốn học mơ tả ảnh hưởng biến độc lập biến phụ thuộc có dạng hàm đa thức bậc hai có dạng tổng quát sau: 2.2.3 Bố trí nghiệm xác định phương pháp xử lý trước ép Chuối sau thu mua bóc vỏ, hấp, cân mẫu Mỗi mẫu cân 100 g Mẫu thứ cấp đông chậm t = -25oC, τ = Mẫu thứ hai sử dụng enzyme pectinase với nồng độ 0,1% (w/w), τ = giờ, nhiệt độ phòng Các mẫu thêm 150 ml nước đem ép để thu dịch tính tốn hiệu Bên cạnh hai cách ta sử dụng phương pháp thu dịch ép thông thường để ép thu dịch so sánh hiệu ép với hai phương pháp 4 Yk = B0 + ∑B j X j ∑ Bij X i X j + ∑Bij B 2j i, j =j = =j đó: Yk : biến phụ thuộc (k = ÷ 4); Xi,j: nhân tố mã hóa biến độc lập ảnh hưởng đến Yk; B0: hệ số hồi qui bậc 0; Bj: hệ số hồi qui bậc mô tả ảnh hưởng biến Xj đến Yk; Bij: hệ số ảnh hưởng đồng thời biến Xi Xj đến Yk; Bjj: hệ số hồi qui bậc hai mô tả ảnh hưởng biến X2j đến Yk 2.2.4 Bố trí nghiệm tối ưu hóa điều kiện lên men Phương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology) lựa chọn để tối ưu hóa điều kiện lên men Bốn thơng số quan trọng trình chiết nghiên cứu bao gồm: pH lên men Bảng Ma trận bố trí thí nghiệm mã hóa biến độc lập Tên biến Mức nghiên cứu Biến thực Biến mã -α -1 +1 +αa X1: pH lên men U1 3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 X2: Thời gian lên men (ngày) U2 3,0 5,0 7,0 9,0 11,0 X3: Tỉ lệ men cái/nguyên liệu (%) U3 0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 X4: Nồng độ ethanol (%) U4 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 Ghi chú: α = 2, Umax, Umin giá trị cận (+1) cận (-1) biến độc lập, U0 = (Umin + Umax)/2 giá trị trung bình cận cận Nguyên liệu chuối xử lý pectinase, 2.3 Phương pháp phân tích sau tiếp tục thêm nước cho tỷ lệ 2.3.1 Phương pháp cảm quan nguyên liệu/nước tương ứng 1/2 Quá trình lên men thực điều kiện nhiệt độ phịng (26÷28oC) Mật độ tế bào dịch men 107 TB/ml pH trình lên men ổn định hệ đệm acetat Kiểm tra chất lượng cảm quan theo tiêu chuẩn TCVN 3215:79 Tiêu chuẩn sử dụng hệ 20 điểm xây dựng thang thống có bậc (từ đến 5) điểm điểm cao cho tiêu Các tiêu lựa chọn màu sắc độ 100 Tạp chí Nghiên cứu khoa học - Đại học Sao Đỏ, ISSN 1859-4190 Số 3(62).2018 LIÊN NGÀNH HĨA HỌC - CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM (hệ số quan trọng 0,8), mùi (hệ số quan trọng 1,2), vị (hệ số quan trọng 2,0) 2.3.2 Phương pháp xác định hiệu ép dịch Cân (m) quả, bóc vỏ, bổ sung v1 (ml) dung dịch đệm cho vào máy xay xay nhuyễn bổ sung 0,2% enzyme để ủ to = 45oC, τ = Lượng dịch thu bổ sung enzyme ủ nhiệt độ thời gian v (ml) trừ số mililit dung dịch đệm ban đầu cho vào với 100 g chuối ta thu số mililit dịch chuối Từ ta tính hiệu ép dịch Hiệu ép dịch: hq= (% v/w) 2.3.3 Phương pháp phân tích Xác định độ ẩm phương pháp sấy đến khối lượng không đổi Xác định hàm lượng ethanol cách sử dụng cồn kế với rượu trắng theo TCVN 8008:2009 Hàm lượng acid dịch lên men xác định phương pháp chuẩn độ với NaOH 0,1 N pH xác định pH kế (Sartorius, PB-20, Đức) Xác định hàm lượng protein phương pháp Kjeldahl Xác định đường tổng số phương pháp Bertrand 2.4 Thiết bị lên men Thiết bị lên men gồm: Thân thiết bị chia hai phần: phần chứa dịch lên men, phần chứa chất mang vi khuẩn acetic nơi lên men giấm Máy bơm (AC 240 V; 50/60 Hz; 24 Vdc; 1,2 A; 110 psi) Thiết bị sục khí (AC 220-240 V; 50 Hz; W; 0,02 MPa; 0,017 A) 2.5 Phương pháp xử lý số liệu Kết nhận giá trị trung bình ba lần lặp lại vẽ biểu đồ phần mềm Microsoft Excel Các thí nghiệm thiết kế xử lý phần mềm Design Expert 11.0 Phân tích ANOVA tiến hành phần mềm SPSS17.0 SPSS (Statistical Product and Services Solutions) KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết phân lập Bảng Kết phân lập vi khuẩn acetic Loại vi khuẩn Hình dạng khuẩn lạc Hình thái tế bào Loại màu trắng sữa Trịn, đều, tạo vành, bóng ướt, bề mặt nhẵn, màu trắng sữa Gram âm, hình que ngắn, que dài, tế bào kết thành cụm đứng riêng rẽ c) b) a) Hình Hình thái tế bào khuẩn lạc chủng Acetobacter tropicalis SĐ1 phân lập (2004) nghiên cứu định danh 3.2 Kết xác định phương pháp xử lý nguyên liệu trước ép Acetobacter tropicalis với đặc điểm hình thái Bảng Bảng kết xác định phương pháp xử lý Nicholas Camu (2007) [9]; Schuwan cộng khuẩn lạc tế bào: Gram âm, hình hạt, hình trụ ngắn, tế bào kết thành đơi, hình cụm đứng riêng rẽ Khuẩn lạc trịn, đều, bóng ướt, bề mặt lồi, màu trắng sữa Từ đặc điểm vậy, so sánh với hình dạng khuẩn lạc hình dạng tế bào vi khuẩn nghiên cứu phân lập được, sơ dự đoán vi khuẩn màu trắng vi khuẩn Acetobacter tropicalis nguyên liệu trước ép Các phương pháp xử lý nguyên liệu trước ép Số ml dịch ép/100 g thịt Độ Bx Đông chậm 50,4 8,5 Pectinase 60,7 8,7 Đối chứng 40,8 8,1 Tạp chí Nghiên cứu khoa học - Đại học Sao Đỏ, ISSN 1859-4190 Số 3(62).2018 101 NGHIÊN CỨU KHOA HỌC tốt Tuy vậy, sử dụng phương pháp chậm đơng thời gian chậm đơng lâu nên tốn thời gian chi phí cho q trình chậm đơng lớn Enzyme pectinase có tác dụng làm phá vỡ thành tế bào nguyên liệu Tế bào thực vật cấu tạo vỏ tế bào (thành tế bào) Vỏ tế bào lớp bảo vệ hữu hiệu tạo hình cho tế bào Ở vỏ tế bào thực vật có nhiều chất pectin, chất pectin xem chất ciment gắn tế bào với Phá vỡ gắn kết tạo điều kiện cho vật chất tế bào thoát khỏi tế bào Xử lý thống kê SPSS 17.0 hiệu thu dịch cho thấy có sai khác có ý nghĩa với hai phương pháp lại (α = 0,05) Do vậy, chọn phương pháp xử lý nguyên liệu enzyme cho nghiên cứu Hình Đồ thị ảnh hưởng phương pháp ép đến lượng dịch thu Kết xử lý thu dịch cho thấy số mililit dịch ép thu mẫu xử lý enzyme lớn (60,7 ml/100 g thịt quả), thứ hai mẫu cấp đông chậm (50,4 ml), mẫu đối chứng (40,8 ml) Lý thuyết lạnh đông chứng minh cấp đơng chậm, tinh thể đá có kích thước lớn hình thành làm rách màng tế bào, phá vỡ cấu trúc tế bào, tạo lỗ màng tế bào lớn làm cho dịch ngồi Lượng dịch thu phương pháp tương đối nhiều, màu sắc, hương vị dịch thu 3.3 Kết xác định ảnh hưởng yếu tố đến trình lên men acid Ảnh hưởng nhân tố X1 (pH), X2 (thời gian lên men, ngày), X3 (tỷ lệ men cái/nguyên liệu), X4 (nồng độ ethanol) trình bày bảng hình Bảng Kết bố trí thí nghiệm đầy đủ theo phương pháp bề mặt đáp ứng Biến mã hóa TT Biến thực Nồng độ Điểm cảm U1 U2 U3 U4 X1 X2 X3 X4 acetic -1 -1 -1 -1 4,5 2,50 14,7 -1 -1 -1 6,5 3,10 18,0 -1 -1 -1 4,5 2,71 16,5 1 -1 -1 6,5 3,21 18,4 -1 -1 -1 4,5 2,78 16,6 -1 -1 6,5 3,21 18,4 -1 1 -1 4,5 2,80 17,0 1 -1 6,5 3,36 18,8 -1 -1 -1 4,5 2,58 14,9 10 -1 -1 6,5 2,85 16,9 11 -1 -1 4,5 2,63 15,2 12 1 -1 6,5 3,11 17,9 13 -1 -1 1 4,5 6 2,65 15,3 14 -1 1 6,5 6 3,21 18,3 15 -1 1 4,5 6 2,72 16,1 16 1 1 6,5 6 3,20 18,1 17 * -2 0 3,5 2,53 14,5 18 * 0 7,5 3,34 18,6 19* -2 0 5,5 2,72 15,8 20 * 0 5,5 11 2,92 17,7 21 * 0 -2 5,5 2,87 17,3 22 * 0 5,5 3,10 17,8 102 Tạp chí Nghiên cứu khoa học - Đại học Sao Đỏ, ISSN 1859-4190 Số 3(62).2018 (%) quan LIÊN NGÀNH HĨA HỌC - CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM Biến mã hóa TT Biến thực Nồng độ Điểm cảm U1 U2 U3 U4 X1 X2 X3 X4 acetic * 0 -2 5,5 2,72 15,6 24* 0 5,5 7 2,48 14,3 25 t 0 0 5,5 2,95 17,7 26 t 0 0 5,5 2,88 17,4 27 0 0 5,5 2,87 17,2 23 t (%) quan Ghi chú: (*) thí nghiệm tiến hành điểm sao; (t) thí nghiệm tiến hành điểm tâm Hình Ảnh hưởng tương tác yếu tố (X1, X2, X3, X4) đến hàm mục tiêu Kết cho thấy bốn yếu tố ảnh hưởng đến hàm mục tiêu nồng độ acid Kết hoàn toàn phù hợp với lý thuyết lên men vi khuẩn Theo đó, nhân tố pH lên men, thời gian lên men, tỷ lệ men cái/nguyên liệu, nồng độ ethanol có ảnh hưởng đến việc tạo thành acid acetic Kết ra, bốn yếu tố có tương tác với tương tác đến hàm mục tiêu Cụ thể, yếu tố X1 (pH), X2 (thời gian lên men), X3 (tỷ lệ men cái/nguyên liệu) có ảnh hưởng đồng biến đến hàm mục tiêu, yếu tố X4 (nồng độ ethanol) có ảnh hưởng nghịch biến với hàm mục tiêu Điều có nghĩa là, phạm vi nghiên cứu tăng giá trị pH, tăng thời gian Tạp chí Nghiên cứu khoa học - Đại học Sao Đỏ, ISSN 1859-4190 Số 3(62).2018 103 NGHIÊN CỨU KHOA HỌC lên men, tăng tỷ lệ men bổ sung vào hàm lượng acid tạo thành lớn Ngược lại, tăng lượng ethanol vào mơi trường lên men q trình lên men bị ức chế, lượng acid tạo thành giảm 3.4 Tối ưu hóa số điều kiện lên men Bảng trình bày kết phân tích phương sai (ANOVA) ảnh hưởng nhân tố đến hàm mục tiêu hàm lượng acid acetic Kết cho thấy biến X1, X2, X3, X4, X23, X24 có ảnh hưởng đến hàm mục tiêu (p0,05) không ảnh hưởng đáng kể đến hàm mục tiêu (xem bảng 5), nhiên biến đơn có ảnh hưởng đáng kể nên giữ lại mơ hình để phục vụ cho việc tối ưu hóa Bảng Bảng phân tích phương sai (ANOVA) nhân tố đến hàm mục tiêu Source Sum of df Mean Square Squares F-value p-value Model 1,70 14 0,1213 19,13 < 0,0001 A-pH 1,25 1,25 197,19 < 0,0001 B-Thời gian lên men 0,0656 0,0656 10,35 0,0074 C-Tỷ lệ men /nguyên liệu 0,1219 0,1219 19,22 0,0009 D-Nồng độ Ethanol 0,0602 0,0602 9,50 0,0095 AB 0,0013 0,0013 0,2044 0,6592 AC 0,0018 0,0018 0,2899 0,6001 AD 0,0060 0,0060 0,9456 0,3500 BC 0,0104 0,0104 1,63 0,2255 BD 0,0009 0,0009 0,1430 0,7119 CD 6,419E-06 6,419E-06 0,0010 0,9751 A² 0,0102 0,0102 1,61 0,2282 B² 0,0008 0,0008 0,1204 0,7346 C² 0,0272 0,0272 4,29 0,0405 D² 0,0821 0,0821 12,94 0,0037 Residual 0,0761 12 0,0063 Lack of Fit 0,0725 10 0,0072 4,00 0,2167 Pure Error 0,0036 0,0018 Cor Total 1,77 26 Tiến hành xử lý phần mềm Design Expert 11.0 thu mơ hình tốn học sau: Y=2,90 + 0,2283X1 + 0,0523X2 + 0,0713X3 – 0,0501X4 + 0,0090X1X2 + 0,0107X1X3 – 0,0194X1X4–0,0254X2X3 – 0,0075X2X4 – 0,0006X3X4 + 0,0357X32 – 0,0560X42 significant not significant Giá trị p kiểm định khơng tương thích (lack of fit) mơ hình 0,2167 > p=0,05 Do đó, mơ hình hồi quy tương thích với thực nghiệm Bằng việc tối ưu hóa phần mềm Design Expert 11.0 thu giá trị tối ưu ứng với cực đại hàm mục tiêu sau: X1 = 6,5; X2 = 9, ngày; X3 = 6,0%; X4 = 4,4% Lượng acid acetic tạo thành 3,32% Hình Ảnh hưởng yếu tố đến hàm mục tiêu nồng độ acetic 104 Tạp chí Nghiên cứu khoa học - Đại học Sao Đỏ, ISSN 1859-4190 Số 3(62).2018 LIÊN NGÀNH HĨA HỌC - CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM Điều kiện lên men hàm lượng acid acetic nghiên cứu công bố số tác giả Trịnh Nguyệt Trân cộng [15] xác định điều kiện lên men giấm từ dịch sơri với tỷ lệ giống 1% (v/v)  A.  senegalensis 1% (v/v/)  Saccharomyces cerevisiae,  mật số giống chủng ban đầu tương ứng 105  tb/ml 107 tb/ml, dịch sơri với nồng độ chất khơ hịa tan 10º Brix pH 5,0 thu sản phẩm giấm sơri có hàm lượng acid đạt 6,99% (w/v) sau ngày lên men 28÷32°C.Huỳnh Xuân Phong cộng [4] lên men acid acetic với chủng A sicerae A18 39°C, nồng độ ethanol ban đầu 4,32%, pH 4,0 số lượng tế bào giống vi khuẩn 105 tb/ml, hàm lượng acid acetic đạt 2,61% (w/v) Kết tương tự với nghiên cứu Gullo cộng [6], Beheshti cộng [5] khả phát triển tốt chủng vi khuẩn acetic mơi trường có bổ sung 5% (v/v) ethanol với hiệu suất chuyển hóa ethanol thành acid acetic cao Với chủng A tropicalis DK4 Phong cộng [11] công bố hàm lượng acid đạt 2,52% (w/v) vào ngày thứ bảy môi trường YPGD bổ sung 4% (v/v) ethanol 39°C Kết luận Phạm Hồng Quang cộng [10] xác định loài Acetobater aceti cho khả lên men cao Dịch lên men đạt nồng độ acid cao sau 7÷9 ngày lên men mật số giống chủng 105 tế bào/ml, nồng độ đường 15ºBx, pH 5,5 nhiệt độ ủ 30°C Như vậy, so với nhiều nghiên cứu tác giả nước, hàm lượng acid acetic nghiên cứu thu mức cao nhiều Nghiên cứu so sánh hàm lượng giấm với giấm toan Hà Nội (1,30%), giấm gạo nếp Hà Nội (2,5%), giấm trắng Trung Thành (2,52%) Sản phẩm sau lên men lọc cặn lơ lửng bổ sung kali sorbate nồng độ 500 mg/l Quá trình trùng tiến hành 85oC, thời gian 10 phút, sau làm nguội đến nhiệt độ phịng đem bảo quản nơi khơ ráo, thống mát, tránh ánh nắng trực tiếp mặt trời KẾT LUẬN Nghiên cứu tuyển chọn 01 chủng dự đoán chủng Acetobacter tropicalis  SĐ1 xây dựng mơ hình tốn thể mối quan hệ giá trị pH lên men, thời gian lên men, tỷ lệ men cái/nguyên liệu nồng độ ethanol với hàm lượng acid acetic Các giá trị tối ưu để thực trình lên men sau: X1 = 6,5; X2 = ngày; X3 = 6,0%; X4 = 4,4% Lượng acid acetic tạo thành 3,32% Sản phẩm giấm ăn hội đồng đánh giá cảm quan theo thang điểm 20, hệ số quan trọng đánh giá 18,7 điểm, đạt loại tốt Sản phẩm bổ sung sorbate kali với nồng độ 500 mg/l TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Bùi Ái (2003) Công nghệ lên men ứng dụng công nghệ thực phẩm Nhà xuất Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh, trang 53-57 [2] Horiuchi, J I., Kanno, T., & Kobayashi, M (1999) New vinegar production from onions Journal of bioscience and bioengineering, 88(1), pp 107-109 [3] Horiuchi, J I., Kanno, T., & Kobayashi, M (2000) Effective onion vinegar production by a two-step fermentation system Journal of bioscience and bioengineering, 90(3), pp 289-293 [4] Huỳnh Xuân Phong cộng (2017) Tuyển chọn vi khuẩn acetic chịu nhiệt ứng dụng lên men acid acetic Tạp chí KHCN Việt Nam, tập 20, số 9, trang 44-49 [5] M Gullo, C Caggia, L.D Vero and P G.iudici (2006) Characterization of acetic acid bacteria in traditional balsamic vinegar International Journal of Food Microbiology, 106(2), pp 209-212 [6] M.K Beheshti, and R Shafiee (2009) Isolation and identification of an Acetobacter strain from Iranian white-red cherry with high acetic acid productivity as a potential strain for cherry vinegar production in food and agriculture biotechnology International Journal of Biological, Biomolecular, Agricultural, Food and Biotechnological Engineering, 3(6), pp 281-283 Hình Sản phẩm giấm chuối [7] Nguyễn Đức Lượng (chủ biên), Phan Thị Huyền, Nguyễn Anh Tuyết (2003) Thí nghiệm cơng nghệ Tạp chí Nghiên cứu khoa học - Đại học Sao Đỏ, ISSN 1859-4190 Số 3(62).2018 105 NGHIÊN CỨU KHOA HỌC sinh học, tập NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh, trang 45-50 [8] Nguyễn Lân Dũng, Đồn Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Thạnh, Phạm Văn Tỵ (1976) Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật, tập 303-328, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội [9] Nicholas Camu, Tom De Winter, Kristof Verbrugghe, Lise Cleenwerck Dynamics and biodiversity of populations of lactic acid bacteria and acetic acid bacteria involved in spontaneoap heap fermentation of cocoa bean in Ghana Applid environment microbiology, Mar, 2007, pp 1809-1824 [10] Phạm Hồng Quang, Nguyễn Vân Sơn, Lê Thị Mỹ Xuyên (2014) Phân lập, tuyển chọn nấm men vi khuẩn acid acetic thử nghiệm lên men trà thủy sâm (kombucha) Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản Công nghệ Sinh học: 34 (2014): 12-19 [11] Phong Huynh Xuan, Chanhom Loinheuang, Gunjana Theeragool, Kazunobu Matsushita, Toshiharu Yakushi (2012) Geographical distribution of thermo-tolerant acetic acid bacteria, Summary Book of Asian Core Program, pp 77-80, International Exchange Core Program in Yamaguchi University, Yamaguchi, Japan [12] Pingyi Zhang, Roy L, Whistler, James N, BeMiller Banana starch: production, physicochemical, and digestibility – a review [13] Schwan RF, Wheals AE (2004) The microbiology of cocoa fermentation and its rule in chocolate quality Crit Rev Food Sci Nutr., 44(4): 205-221 [14] Shinichi Someyaa, Yumiko Antioxidant compounds bananas (Musa cavendish) [15] Trịnh Nguyệt Trân, Ngô Thị Phương Dung, Nguyễn Ngọc Thạnh, Huỳnh Xuân Phong, Huỳnh Diễm Mi (2016) Tuyển chọn vi khuẩn acetic ứng dụng lên men giấm từ dịch sơri Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, Số 11, trang: 96-104 106 Tạp chí Nghiên cứu khoa học - Đại học Sao Đỏ, ISSN 1859-4190 Số 3(62).2018 ... lượng sản phẩm 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Thu thập mẫu để phân lập vi khuẩn acetic Ba mẫu dịch lên men từ thu thập bao gồm: Mẫu dịch lên men chuối; mẫu dịch lên men mơ; mẫu dịch lên men tự... sát kính hiển vi để xác định độ đồng tế bào vi khuẩn 2.2.2 Phân lập, tuyển chọn dịng vi khuẩn lên men acetic mạnh Hình Chuối tiêu (Musa acuminata Colla) 2.1.2 Nước Sử dụng nước xưởng nước Khoa... Mỹ Xuyên (2014) Phân lập, tuyển chọn nấm men vi khuẩn acid acetic thử nghiệm lên men trà thủy sâm (kombucha) Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản Công nghệ Sinh