Xây dựng phương pháp phát hiện một số chủng Human Papilloma virus nguy cơ cao gây ung thư cổ tử cung ở Việt Nam bằng kỹ thuật Realtime PCR

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Thanh Tâm XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN MỘT SỐ CHỦNG HUMAN PAPILLOMAVIRUS NGUY CƠ CAO GÂY UNG THƢ CỔ TỬ CUNG Ở VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT REALTIME PCR LUẬN VĂNTHẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2016 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Thanh Tâm XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN MỘT SỐ CHỦNG HUMAN PAPILLOMAVIRUS NGUY CƠ CAO GÂY UNG THƢ CỔ TỬ CUNG Ở VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT REALTIME PCR Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂNTHẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN VÂN TRANG TS LÊ HỒNG ĐIỆP Hà Nội – 2016 Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thanh Tâm – K22 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Vân Trang, người thầy tận tình bảo, hướng dẫn suốt thời gian học tập thực luận văn Tôi xin trân trọng cảm ơn TS Lê Hồng Điệp thầy giáo, cô giáo khoa Sinh học, đặc biệt thầy giáo, cô giáo môn Sinh lý Thực vật Hóa sinh học tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, giảng dạy dìu dắt tơi thời gian thực luận văn suốt thời gian học tập trường Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới anh chị, bạn làm việc Phòng Miễn dịch Vắc xin –Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương tận tình giúp đỡ bảo tơi suốt q trình học tập thực luận văn phịng Cuối cùng, tơi vơ biết ơn gia đình bạn bè ln khích lệđộng viên tơi suốt thời gian qua Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Học viên Nguyễn Thanh Tâm Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thanh Tâm – K22 BẢNG KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt ADN/ ARN (Deoxi)ribonucleic acid Vật chất di truyền Primer Mồi - HPV Human Papillomavirus Papillomavirus gây bệnh người Hr-HPV High risk HPV Nhóm HPV nguy cao Lr-HPV Low risk HPV Nhóm HPV nguy thấp LRC Long Control Region Vùng kiểm soát dài gen PCR Polymerase Chain Reaction Probe - Đầu dò gắn huỳnh quang Reverse - Primer ngược ORF Open Reading Frame Khung đọc mở gen ORI Origin Vị trí khở đầu tái OD Optical density Mật độ quang mẫu ADN URR Upstream Regulatory Region Vùng điều hòa gen UTCTC - Ung thư cổ tử cung Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thanh Tâm – K22 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG………………………………………………………………… DANH MỤC CÁC HÌNH…………………………………………………………………… MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu Human Papillomavirus 1.1.1 Đặc điểm hình thái HPV 1.1.2 Đặc điểm sinh học phân tử 1.1.3 Phân loại HPV 1.2 HPV ung thƣ cổ tử cung 12 1.2.1 Tình hình nhiễm HPV Việt Nam giới 12 1.2.2 Đường lây truyền HPV 14 1.2.3 Các bệnh lý thường gặp HPV, cách phòng nhiễm điều trị 14 1.2.4 Chu kỳ nhân lên chế gây bệnh HPV 15 1.2.5 Các phương pháp phát HPV 18 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 26 2.1 Vật liệu 26 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 26 2.1.2 Sinh phẩm vật tư tiêu hao 26 2.1.3 Máy móc thiết bị 27 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 27 2.2.1 Xây dựng kỹ thuật realtime PCR phát chủng HPV 16, 18 33/52 27 2.2.2 Tạo chứng dương xác định giới hạn phát kỹ thuật realtime PCR phát chủng HPV 16, 18 33/52 29 2.2.3 Thẩm định phương pháp phát chủng HPV16, 18, 33/52 32 2.3 Nội dung thực 34 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Xây dựng kỹ thuật Realtime PCR phát chủng HPV 16, 18 33/52 35 3.1.1 Kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer probe 35 3.1.2 Kỹ thuật realtime PCR đa cặp primer probe 40 3.2 Tạo chứng dƣơng xác định giới hạn phát kỹ thuật realtime PCR phát chủng HPV 16, 18 33/52 42 3.2.1 Khuếch đại trình tự đích 42 3.2.2 Nhân dòng gen tạo chứng dương 43 3.2.3 Xác định giới hạn phát kỹ thuật Realtime PCR 48 3.3 Thẩm định phƣơng pháp phát chủng HPV16, 18 33/52 50 3.3.1 Xác định độ xác kỹ thuật realtime PCR phát chủng HPV16, 18 33/52 51 3.3.2 Xác định độ chụm (hệ số tái lâp hệ số lặp lại) kỹ thuật realtime PCR phát chủng HPV16, 18 33/52 52 3.3.2.1 Xác định hệ số lặp lại phương pháp 52 3.3.2.2 Xác định hệ số tái lập phương pháp 56 3.3.3 Xác định độ đặc hiệucủa kỹ thuật realtime PCR phát chủng HPV16, 18 33/52 60 3.3.4 Xác định độ nhạycủa kỹ thuật realtime PCR phát chủng HPV16, 18 33/52 61 KẾT LUẬN 67 KIẾN NGHỊ 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO 68 Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thanh Tâm – K22 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các type HPV bệnh có liên quan 11 Bảng 1.2 Tỷ lệ nhiễm HPV số tỉnh thành phố Việt Nam .13 Bảng 1.3 Các cặp mồi dùng cho PCR phát HPV………………………………… 22 Bảng 2.1 Thành phần kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer probe 29 Bảng 2.2 Thành phần kỹ thuật realtime PCR đa cặp primer probe………………….29 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng khuếch đại trình tự đích .30 Bảng 2.4 Chu kì nhiệt phản ứng khuếch đại trình tự đích 30 Bảng 3.1 Kết kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer probe phát HPV16….34 Bảng 3.2 Kết kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer probe phát HPV18….36 Bảng 3.3 Kết kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer probe phát HPV33/52.37 Bảng 3.4 Kết kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer probe IC………………… 38 Bảng 3.5 Kết kỹ thuật realtime PCR cặp primer probe phát HPV16, HPV18 HPV33/52…………………………………………………………………………… 39 Bảng 3.6 Kết phản ứng Realtime PCR đa cặp primer probe với chứng dương….47 Bảng 3.7.Kết thí nghiệm xác định độ xác phương pháp…………………50 Bảng 3.8.Kết thí nghiệm xác định hệ số lặp lại phương pháp………………… 52 Bảng 3.9 Giá trị trung bình độ lệch chuẩn thí nghiệm đánh giá hệ số lặp lại…….53 Bảng 3.10.Kết thí nghiệm xác định hệ số tái lập phương pháp…………………55 Bảng 3.11 Giá trị trung bình độ lệch chuẩn thí nghiệm đánh giá hệ số tái lập….57 Bảng 3.12 Kết thí nghiệm xác định độ đặc hiệu phương pháp…………………58 Bảng 3.13.Kết thí nghiệm xác định độ nhạy phươngpháp…………………… 61 Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thanh Tâm – K22 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hạt vi rút HPV …………………………………………………………… Hình 1.2 Cấu trúc bộgen Papillomavirus HPV 16 ……………………………….4 Hình 1.3 Cây phả hệ 118 genotype Papilomavirus dựa trình tự gen vùng L1 ORF Hình 1.4 Tỷ lệ nhiễm HPV nữ giới giới .12 Hình 1.5 Chu kỳ nhân lên HPV …………………………………………………….16 Hình 1.6 Phương pháp lai phân tử phát HPV 21 Hình 3.1 Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang phản ứng Realtime PCR đơn cặp primer probe phát HPV16 ……………………………………………………….35 Hình 3.2 Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer probe phát HPV18 ………………………………………………………………36 Hình 3.3 Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer probe phát HPV33/52 ………………………………………………………… 37 Hình 3.4 Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer probe IC ………………………………………………………………………………39 Hình 3.5 Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang kỹ thuật realtime PCR cặp primer probe phát HPV16, 18 33/52 …………………………………………………40 Hình 3.6 Ảnh điện di sản phẩm khuếch đại trình tự HPV16E6-E7, HPV18L1 …………41 Hình 3.7 Ảnh điện di sản phẩm khuếch đại trình tự HPV52L1 ……………………… 42 Hình 3.8 Kiểm tra kết nhân dịng trình tư HPV16E6-E7 43 Hình 3.9 Kết tinh Plasmid mang đoạn chèn HPV16E6-E7 44 Hình 3.10 Kiểm tra kết nhân dịng trình tự HPV18L1 44 Hình 3.11 Kết tinh Plasmid mang đoạn chèn HPV18L1 45 Hình 3.12 Kiểm tra kết nhân dịng trình tự HPV52L1 46 Hình 3.13 Kết tinh Plasmid mang đoạn chèn HPV52L1 46 Hình 3.14 Kết kỹ thuật realtime đa cặp primer probe với chúng dương ……… 48 Hình 3.15 Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang thí nghiệm xác định độ xác …………………………………………………………………………………………….51 Hình 3.16 Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang thí nghiệm xác định hệ số lặp lại …………………………………………………………………………………………….52 Hình 3.17 Biến động giá trị Ct thí nghiệm đánh giá hệ số lặp lại ………………… 53 Hình 3.18.Đường tín hiệu huỳnh quang thí nghiệm xác định hệ số tái lập kỹ thuật viên …………………………………………………………………………………… 56 Hình 3.19.Đường tín hiệu huỳnh quang thí nghiệm xác định hệ số tái lập kỹ thuật viên …………………………………………………………………………………… 56 Hình 3.20.Đường tín hiệu huỳnh quang thí nghiệm xác định hệ số tái lập kỹ thuật viên …………………………………………………………………………………… 56 Hình 3.21 Biến động giá trị Ct thí nghiệm đánh giá hệ số tái lập ………………… 57 Hình 3.22.Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang thí nghiệm đánh giá độ đặc hiệu …………………………………………………………………………………………….59 Hình 3.23 Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang thí nghiệm đánh giá độ nhạy … 62 Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thanh Tâm – K22 MỞ ĐẦU Human papillomavirus (HPV) tác nhân thường gặp nhiễm trùng lây truyền qua đường tình dục nguyên nhân quan trọng dẫn tới ung thư cổ tử cung (UTCTC), loại ung thư xếp thứ tư loại ung thư mà nữ giới thường mắc phải xếp thứ hai với nữ giới độ tuổi 15-44[41] HPV mối liên quan mật thiết với UTCTC mà cịn có vai trị quan trọng ngun nhân dẫn đến ung thư hậu môn, âm đạo, dương vật, ung thư phổi số ung thư vùng hầu họng Đồng thời, HPV nguyên nhân nhiều bệnh lý lâm sàng da niêm mạc hạt cơm, sùi mào gà sinh dục-hậu môn, u nhú quản trẻ sơ sinhv.v…[32] Hàng năm giới ước tính có khoảng 529.000 ca mắc UTCTC, tử vong khoảng 275.000 trường hợp, 85% tổng số trường hợp bệnh gặp nước phát triển[21] Mỗi năm, Châu Á có thêm khoảng 312.000 bệnh nhân UTCTC, chiếm 59% trường hợp mắc toàn giới – đặc biệt khu vực Nam Á Đơng Nam Á, nơi có tỷ lệ nhiễm HPV cao châu lục[21, 34].Cùng với lây nhiễm HPV cộng đồng, UTCTC thực trở thành gánh nặng bệnh tật toàn cầu, gây ảnh hưởng nặng nề đến sức khỏe tâm lý nữ giới Tại Việt Nam, theo thống kê Tổ chức Y tế giới năm 2012, UTCTC loại ung thư chiếm tỷ lệ cao nữ giới, xếp thứ số loại ung thư mà nữ giới độ tuổi 15-44 hay mắc phải, với 5000 ca nhiễm (tỷ lệ: 8.1/100.000 phụ nữ) tử vong 2000 trường hợp năm[40] Điều đặc biệt quan tâm phần lớn trường hợp UTCTC thường phát giai đoạn muộn, trình diễn biến từ nhiễm virus đến ung thư thường trải qua thời gian dài Quá trình tiến triển từ mức dộ loạn sản nhẹ, loạn sản vừa, loạn sản nặng đến ung thư chỗ (giai đoạn tổn thương phục hồi) đến giai đoạn ung thư xâm nhập kéo dài từ 10 – 25 năm[22].Đây hội cho việc phát nhiễm HPV, sàng lọc người có nguy mắc ung thư cổ tử cung nhằm giúp trình điều trị hiệu tổn thương tiền ung thư ung thư giai đoạn sớm.Hiện Việt Nam, xét nghiệm tế bào mô bệnh học (Pap smear) đưa vào thành thường quy chương trình sàng lọc UTCTC, xét nghiệm HPV phổ biến nhiên chi phí cịn cao kit chẩn đốn thương mại hóavà yêu cầu đảm bảo chất lượng xét nghiệm với xét nghiệm nước[8] Với tầm quan trọng ý nghĩa việc xác định genotype HPV, Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thanh Tâm – K22 xuất phát từ thực tiễn nêu trên, đề tài “Xây dựng phƣơng pháp phát số chủng Human Papillomavirus có nguy cao gây ung thƣ cổ tử cung Việt Nam kỹ thuật Realtime PCR” thực với mục tiêu sau: Xây dựng phương pháp phát chủng HPV 16, 18 33/52 kỹ thuật multiplex Realtime PCR Thẩm định phương pháp phát chủng HPV 16, 18, 33/52 kỹ thuật multiplex realtime PCR mẫu dịch quét cổ tử cung Đề tài nàyđược chúng tơi thực phịng Miễn dịch Vắc xin,ViệnVệ sinh Dịch tễ Trung ương Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thanh Tâm – K22 CHƢƠNG1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu Human Papillomavirus Papillomaviruslàcác thành viên họ Papillomaviridae, tìm thấy nhiều lồi động vật có vú có người Các loài vật chủ khác nhiễm loại Papillomavirus đặc thù cho lồi đó.CácPapillomavirusgây bệnh cho người gọi Human papillomavirus(HPV) 1.1.1Đặc điểm hình thái HPV HPV nhóm virus có kích thước nhỏ, khơng vỏ.Hạt virus có đường kính 5255nm, vỏ gồm 72 đơn vị capsomer.Mỗi đơn vị capsid gồm pentamer protein cấu trúc L1 kết hợp với protein L2 (protein thành phần kháng nguyên sử dụng phản ứng miễn dịch đặc hiệu) Hình 1.1.Hạt vi rút HPV[14] Cả hai protein cấu trúc virus tự mã hóa: Protein capsid (L1) có kích thước khoảng 55 kDa chiếm khoảng 80% tổng số protein virus Protein capsid phụ (L2) có kích thước khoảng 70 kDa[14] 1.1.2Đặc điểm sinh học phân tử 1.1.2.1 Cấu trúc hệ gen HPV virus có vật liệu di truyền ADN, mạch đơi khơng hồn chỉnh, tồn dạng siêu xoắn hình vịng (circular ds-ADN).ADN virus liên kết với histone tạo thành cấu trúc phức hợp giống Chromatin (Chromatin-like conplex) nằm lớp vỏ capsid protein Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thanh Tâm – K22 Phụ lục 3: Kết giải trình tự plasmid Kết giải trình tự plasmid mang đoạn chèn HPV16 E6-E7 với cặp mồi T7SP6GCAGGCGGCCGCGAATTCACTAGTGATTCATTACATCCCGTACCCTCTTCCCCATTGG TACCTGCAGGATCAGCCATGGTAGATTATGGTTTCTGAGAACAGATGGGGCACACAATTCC TAGTGTGCCCATTAACAGGTCTTCCAAAGTACGAATGTCTACGTGTGTGCTTTGTACGCAC AACCGAAGCGTAGAGTCACACTTGCAACAAAAGGTTACAATATTGTAATGGGCTCTGTCCG GTTCTGCTTGTCCAGCTGGACCATCTATTTCATCTTCCTCCTCTGAGCTGTCATTTAATTG CTCATAACAGTAGAGATCAGTTGTCTCTGGTTGCAAATCTAACATATATTCATGCAATGTA GGTGTATCTCCATGCATGATTACAGCTGGGTTTCTCTACGTGTTCTTGATGATCTGCAACA AGACATACATCGACCGGTCCACCGACCCCTTATATTATGGAATCTTTGCTTTTTGTCCAGA TGTCTTTGCTTTTCTTCAGGACACAGTGGCTTTTGACAGTTAATACACCTAATTAACAAAT CACACAACGGTTTGTTGTATTGCTGTTCTAATGTTGTTCCATACAAACTATAACAATAATG TCTATACTCACTAATTTTAGAATAAAACTTTAAACATTTATCACATACAGCATATGGACTC CCATCTCTATATACTATGCATAAATCCCGAAAAGCAAAGTCATATACCTCACGTCGCAGTA ACTGTTGCTTGCAGTACACACATTCTAATATTATATCATGTATAGTTGTTTGCAGCTCTGT GCATAACTGTGGTAACTTTCTGGGTCGCTCCTGTGGGTCCTGAAACATTGCAGTTCTCTTT TGGTGCATAAAATGTCTGCTTTTATACTAACCGGTTTCGGTTCAACCGATTTCAATCGAAT TCCCGCGGCCGCCATGGCGGCCGGGAGCATGCGACGTCGGGCCCAATTCGCCCTATAGTGA GTCGTATTACAATTCACTGGGCCGTC Kết giải trình tự plasmid mang đoạn chèn HPV18L1 với cặp mồi M13 GAGCAATGCTTTTTTATAATGCCAACTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCGCGGCCCCCACCC TTCACCATGTGCCTGTATACACGGGTCCTGATATTACATTACCATCTACTACCTCTGTATG GCCCATTGTATCACCCACAGCCCCTGCCTCTACACAGTATATTGGTATACATGGTACACAT TATTATTTGTGGCCATTATATTATTTTATTCCTAAGAAACGTAAACGTGTTCCCTATTTTT TTGCAGATGGCTTTGTGGCGGCCTAGTGACAATACCGTATATCTTCCACCTCCTTCTGTGG CAAGAGTTGTAAATACCGATGATTATGTGACTCGCACAAGCATATTTTATCATGCTGGCAG CTCTAGATTATTAACTGTTGGTAATCCATATTTTAGGGTTCCTGCAGGTGGTGGCAATAAG CAGGATATTCCTAAGGTTTCTGCATACCAATATAGAGTATTTAGGGTGCAGTTACCTGACC CAAATAAATTTGGTTTACCTGATACTAGTATTTATAATCCTGAAACACAACGTTTAGTGTG GGCCTGTGCTGGAGTGGAAATTGGCCGTGGTCAGCCTTTAGGTGTTGGCCTTAGTGGGCAT CCATTTTATAATAAATTAGATGACACTGAAAGTTCCCATGCCGCCACGTCTAATGTTTCTG AGGACGTTAGGGACAATGTGTCTGTAGATTATAAGCAGACACAGTTATGTATTTTGGGCTG TGCCCCTGCTATTGGGGAACACTGGGCTAAAGGCACTGCTTGTAAATCGCGTCCTTTATCA CAGGGCGATTGCCCCCCTTTAGAACTTAAAAACACAGTTTTGGAAGATGGTGATATGGTAG ATACTGGATATGGTGCCATGGACTTTAGTACATTGCAAGATACTAAATGTGAGGTACCATT GGATATTTGTCAGTCTATTTGTAAATATCCTGATTATTTACAAATGTCTGCAGATCCTTAT GGGGATTCCATGTTTTTTTGCTTACGGCGTGAGGTCCAAGGGGATATTGATCTAAGTCTAA AGAAAACTTTTCCTTTAAATCCACATTCCAAAACTTTAACTTATCATAGGGATCCTTATTT TCAGCCGGTGCAGCATCCTTTTGACAGGTAATAGCAACAGATTGTACAAAACGATATGTAT CCACCAAACTAGTAGTTGGCGGGGGGGGAACACCAAAGTTCCAATCCTCTAAAATACTGCT iv Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thanh Tâm – K22 ATTCATACTATGAATATAGGACATAACATCTGCAGTTAAAGTAATAGTACACAACTGAAAA ATAAACTGCAAATCATATTCCTCAACATGTCTGCTATACTGCTTAAATTTGGTAGCATCAT ATTGCCCAGGTACAGGAGACTGTGTAGAAGCACATATTGTTAAATTGGTACTGCGAGTGGT ATCTACCACAGTAACAAATAATTGATTATGCCAGCAAACACCATTGTTATGACCCTGTGCC TTATGTAACCAATATGGTTTATTAAACAACTGGGAGTCAGAGGTAACAATAGAGCCACTTG GAGAGGGAGAATACACACAGCTGCCAGGTGAAGCACGCATACCTGTGCCTTTAATATATAA GGATTGAGGCACAGTGTCACCCATAGTACCTGCTCTATTCCAAAAATGCCTAGCAAAAAGC TGCTCACGCCGTAAGCAAAAAAACATGGAATCCCCATAAGGATCTGCAGACATTTGTAAAT AATCAGGATATT Kết giải trình tự plasmid mang đoạn chèn HPV52L1 với cặp mồi M13 AACAAATTGATGAGCAATGCTTTTTTATAATGCCAACTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCGC GGCCGCCCCCTTCACCATGGTACAGATTTTATTTTACATCCTAGTTATTTTTTACTACGTC GCAGGCGTAAACGTTTTCCATATTTTTTTACAGATGTCCGTGTGGCGGCCTAGTGAGGCCA CTGTGTACCTGCCTCCTGTACCTGTCTCTAAGGTTGTAAGCACTGATGAGTATGTGTCTCG CACAAGCATCTATTATTATGCAGGCAGTTCTCGATTACTAACAGTAGGACATCCCTATTTT TCTATTAAAAACACCAGTAGTGGTAATGGTAAAAAAGTTTTAGTTCCCAAGGTGTCTGGCC TGCAATACAGGGTATTTAGAATTAAATTGCCGGACCCTAATAAATTTGGTTTTCCGGATAC ATCTTTTTATAACCCAGAAACCCAAAGGTTGGTGTGGGCCTGTACAGGCTTGGAAATTGGT AGGGGACAGCCTTTAGGTGTGGGTATTAGTGGGCATCCTTTATTAAACAAGTTTGATGATA CTGAAACCAGTAACAAATATGCTGGTAAACCTGGTATAGATAATAGAGAATGTTTATCTAT GGATTATAAGCAGACTCAGTTATGCATTTTAGGATGCAAACCTCCTATAGGTGAACATTGG GGTAAGGGAACCCCTTGTAATAATAATTCAGGAAATCCTGGGGATTGTCCTCCCCTACAAC TCATTAACAGTGTAATACAGGATGGGGACATGGTAGATACAGGATTTGGTTGCATGGATTT TAATACCTTGCAAGCTAGTAAAAGTGATGTGCCCATTGATATATGTAGCAGTGTATGTAAG TATCCAGATTATTTGCAAATGGCTAGCGAGCCATATGGTGACAGTTTGTTCTTTTTTCTTA GACGTGAGCAAATGTTTGTTAGACACTTTTTTAATAGGGCTGGTACCTTAGGTGACCCTGT GCCAGGTGATTTATATATACAAGGGTCTAACTCTGGCAATACTGCCACTGTACATGTATGT CATAACATCAGCTGTTAATGTAATTTTGCACAATTGAAAAATAAATTGTAAATCAAATTCC TCGCCATGACGAAGGTATTCCTTAAAATTTTCATTTTTATATGTGCTTTCCTTTTTAACTT CAGCACATAAAGTCATGTTAGTGCTACGAGTGGTATCCACAACTGTGACAAACAACTGATT GCCCCAACATATGCCATTATTGTGGCCCTGCGCACGTTGTAACCAGTACGGTTTATTAAAT AATTGGGATTCTGAGGTTACCATAGAACCACTAGGAGTAGGAAAAAAAGCACTGCTTTGTA CAGTGGCAGTATTGCCAGAGTTAGACCCTTGTATATATAAATCACCTGGCACAGGGTCACC TAAGGTACCAGCCCTATTAAAAAAGTGTCTAACAAACATTTGCTCACGTCTAAGAAAAAAG AACAAACTGTCACCATATGGCTCGCTAGCCATTTGCAAATAATCTGGATACTTACATACAC TGCTACATATATCAATGGGCACATCACTTTTACTAGCTTGCAAGGTATTAAAATCCATGCA ACCAAATCCT v