Khảo sát rối loạn số lượng nhiễm sắc thể ở phôi 5 ngày tuổi thụ tinh trong ống nghiệm​

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Phùng Thị Mùi KHẢO SÁT RỐI LOẠN SỐ LƯỢNG NHIỄM SẮC THỂ Ở PHÔI NGÀY TUỔI THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Phùng Thị Mùi KHẢO SÁT RỐI LOẠN SỐ LƯỢNG NHIỄM SẮC THỂ Ở PHÔI NGÀY TUỔI THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 842010121 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân TS Nguyễn Thanh Tùng Hà Nội – Năm 2018 LỜI CÁM ƠN Để hồn thành luận văn này, tơi may mắn nhận nhiều giúp đỡ quý báu vật chất, tinh thần thầy cô, bạn bè Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân (ĐHKHTN - ĐHQGHN) TS Nguyễn Thanh Tùng (Học Viện Quân Y), người trực tiếp hướng dẫn nhiệt tình bảo tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Đồng thời gửi lời cám ơn chân thành tới cán thuộc Trung tâm Hỗ trợ sinh sản Bệnh viện Tâm Anh, Bệnh viện Nam Học Hiếm muộn Hà Nội Viện Mô phôi lâm sàng Quân đội – Học viện Quân Y giúp sinh thiết phân loại mẫu phôi bào sử dụng nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới BS Đặng Tiến Trường (Học viện Qn Y) người ln tận tình hướng dẫn kinh nghiệm làm việc tạo điều kiện thuận lợi động viên, giúp đỡ nhiều suốt thời gian học tập, nghiên cứu phịng ADN – Bộ mơn Giải Phẫu, Học viện Quân Y Tôi muốn gửi lời cảm ơn tới thầy cô giáo môn Di truyền học, Khoa Sinh học, Trường ĐHKHTN tạo điều kiện thuận lợi động viên tơi q trình học tập Bộ môn Qua đây, xin cám ơn Bộ môn Giải Phẫu Học viện Quân Y tạo điều kiện thuận lợi trang thiết bị sở vật chất cho tơi q trình học tập thực luận văn phịng thí nghiệm ADN Cuối cùng, muốn gửi lời cám ơn chân thành tới gia đình, người thân, bạn bè em sinh viên, bên cổ vũ động viên tơi vượt qua khó khăn trình học tập nghiên cứu Hà Nội, tháng 11 năm 2018 Học viên Phùng Thị Mùi i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt a-CGH Nghĩa tiếng Anh Array Comparative Genomic Hybridization Lai so sánh hệ gen ADN Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic ARN Ribonucleic acid Axit ribonucleic Bp Base pair Cặp bazơ nitơ Bất thường số lượng nhiễm sắc BT SLNST dNTP FISH thể Deoxyribonucleotide triphosphate Fluorescence in Situ Hybridization GTT Deoxyribonucleotit triphosphat Lai huỳnh quang chỗ Giải trình tự IVF In Vitro Fertilization Thụ tinh ống nghiệm Mbp Megabase pair Triệu cặp bazơ nitơ NGS Next Generation Sequencing Giải trình tự gen hệ thứ hai NST PCR PGS Nhiễm sắc thể Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase Preimplantation Genetic Sàng lọc di truyền trước chuyển Screening phôi TTTON WGA Nghĩa tiếng Việt Thụ tinh ống nghiệm Whole Genome Amplification Khuếch đại toàn hệ gen MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Thụ tinh ống nghiệm (TTTON) 1.2 Sự phát triển phôi trước làm tổ 1.2.1 Phôi giai đoạn tiền nhân 1.2.2 Phôi giai đoạn phân chia (2-3 ngày sau thụ tinh) 1.2.3 Phôi dâu 1.2.4 Phôi nang 1.3 Bất thường số lượng NST chế hình thành 1.3.1 Cơ chế phát sinh bất thường số lượng NST 1.3.2 Phân loại dạng bất thường số lượng NST 10 1.3.3 Các bất thường số lượng NST giai đoạn phôi 10 1.3.4 Tỷ lệ rối loạn nhiễm sắc thể phơi nỗn 13 1.4 Các yếu tố ảnh hưởng tới bất thường NST TTTON 15 1.5 Các phương pháp phân tích NST phơi 18 1.5.1 Phương pháp lai huỳnh quang chỗ - FISH 18 1.5.2 Phương pháp lai so sánh hệ gen (a-CGH) 20 1.5.3 Phương pháp sàng lọc di truyền truyền trước chuyển phơi sử dụng giải trình tự gen hệ thứ hai NGS 23 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Đối tượng nghiên cứu 27 2.2 Phương pháp nghiên cứu 27 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 27 2.2.2 Cỡ mẫu nghiên cứu 27 2.2.3 Hóa chất sử dụng nghiên cứu 28 2.2.4 Thiết bị sử dụng nghiên cứu 29 2.2.5 Sinh thiết phôi bào rửa phôi bào 30 iii 2.2.6 Khuếch đại toàn hệ gen 31 2.2.7 Kiểm tra nồng độ ADN sau q trình khuếch đại tồn hệ gen 33 2.2.8 Chuẩn bị thư viện 33 2.2.9 Giải trình tự 35 2.2.10 Phương pháp phân tích số liệu 35 2.3 Các tiêu nghiên cứu 39 2.4 Địa điểm thời gian nghiên cứu 40 2.5 Vấn đề đạo đức nghiên cứu 40 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41 3.1 Kết phân tích rối loạn nhiễm sắc thể phơi ngày tuổi thụ tinh ống nghiệm (TTTON) kỹ thuật giải trình tự gen hệ thứ hai – Next generation sequencing (NGS) 41 3.2 Đánh giá mối tương quan rối loạn số lượng nhiễm sắc thể phôi ngày tuổi thụ tinh ống nghiệm yếu tố tuổi người mẹ 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61 Kết luận 61 Kiến nghị 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Sự phát triển hợp tử từ giai đoạn phôi bào đến giai đoạn phơi nang Hình Cơ chế khơng phân ly hình thành dạng lệch bội Hình Cơ chế hình thành thể khảm theo Delhanty Hình Sơ đồ giải thích ngun lý kỹ thuật FISH 19 Hình Sơ đồ minh họa bước kỹ thuật array CGH 22 Hình Giới thiệu cơng nghệ giải trình tự gen hệ thứ hai hãng Illumina 24 Hình Kết khuếch đại tồn hệ gen 603 mẫu nghiên cứu 41 Hình Chất lượng liệu giải trình tự máy Miseq 42 Hình Kết kiểm định Binomial test tỷ lệ bất thường NST phôi ngày tuổi TTTON 43 Hình 10 Mức độ lệch bội NST phơi TTTON ngày tuổi 48 Hình 11 Phôi TTTON ngày tuổi không phát bất thường NST 49 Hình 12 Phơi TTTON ngày tuổi phát lệch bội NST 49 Hình 13 Phơi TTTON ngày tuổi phát lệch bội NST 50 Hình 14 Phơi TTTON ngày tuổi phát lệch bội NST 50 Hình 15 Phơi TTTON ngày tuổi phát lệch bội nhiều NST 50 Hình 16 Phôi TTTON ngày tuổi phát bất thường cấu trúc NST 51 Hình 17 Tần suất bất thường cấu trúc NST 578 mẫu phôi TTTON 52 Hình 18 Mối tương quan tuổi mẹ tỷ lệ bất thường số lượng NST 56 Hình 19 Đường hồi quy tuyến tính thể mối tương quan tuổi mẹ tỷ lệ bất thường số lượng NST 57 Hình 20 Đặc điểm rối loạn số lượng NST phân bố theo độ tuổi người mẹ 59 v DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng Kết sàng lọc phôi sử dụng kỹ thuật CGH E Fragouli D Wells 11 Bảng Tần suất bất thường NST phát phôi ngày tuổi sử dụng kỹ thuật CGH theo nghiên cứu E Fragouli D Wells 12 Bảng Hóa chất sử dụng nghiên cứu 29 Bảng Thiết bị sử dụng nghiên cứu 30 Bảng Thành phần phản ứng ly giải tế bào 32 Bảng Thành phần phản ứng tiền khuếch đại toàn hệ gen 32 Bảng Thành phần phản ứng khuếch đại toàn hệ gen 32 Bảng Tỷ lệ bất thường nhiễm sắc thể 578 mẫu nghiên cứu 43 Bảng Đặc điểm bất thường phôi ngày tuổi TTTON 44 Bảng 10 Tỷ lệ rối loạn số lượng nhiễm sắc thể phôi ngày tuổi TTTON 45 Bảng 11 Đặc điểm rối loạn cấu trúc nhiễm sắc thể phôi TTTON ngày tuổi 51 Bảng 12 Sự phân bố số lượng phôi ngày TTTON theo độ tuổi người mẹ 53 Bảng 13 Kết phân tích 578 phôi phân chia theo độ tuổi người mẹ 54 Bảng 14 Đặc điểm bất thường NST phân chia theo độ tuổi người mẹ 58 ĐẶT VẤN ĐỀ PGS (Preimplantation genetic screening) - sàng lọc di truyền trước chuyển phôi, kỹ thuật di truyền thực phơi quy trình thụ tinh ống nghiệm (TTTON – In Vitro Fertilization) Kỹ thuật giúp phát sàng lọc để lựa chọn phơi bình thường mặt di truyền giúp làm tăng hội thụ thai sinh trẻ bình thường Tất phụ nữ có nguy tạo phôi bất thường nhiễm sắc thể (NST) Đặc biệt phụ nữ trì hỗn việc sinh 30 tuổi, xác suất cho phôi bất thường nhiễm sắc thể tăng lên đáng kể, số lượng phôi tạo ra, dẫn tới làm tăng tỷ lệ thất bại TTTON sau chuyển phôi [7] Trước thách thức hội mang lại, có nhiều kỹ thuật PGS đời Đầu tiên phải kể đến kỹ thuật FISH - fluorescence in situ hybridization, kỹ thuật phổ biến với việc sử dụng đầu dị (probe) có gắn huỳnh quang gắn với số vị trí vài nhiễm sắc thể Do số lượng màu huỳnh quang hạn chế, FISH sàng lọc vài nhiễm sắc thể lần thực Tuy nhiên, tình trạng lệch bội (aneuploidy) xảy nhiễm sắc thể với tỷ lệ xấp xỉ [16, 20, 72] Do đó, FISH khơng phải kỹ thuật tồn diện để lựa chọn phơi tốt cho việc chuyển Trong số công nghệ PGS tiên tiến khác, việc kỹ thuật lai so sánh hệ gen (array CGH - Comparative Genomic Hybridization) công nghệ kiểm tra tồn 24 nhiễm sắc thể người (nhiễm sắc thể bình thường, X Y) [18, 20] Cách vài năm, a-CGH phổ biến trở thành tiêu chuẩn vàng cho PGS toàn giới Ngày nay, phát triển cơng nghệ giải trình tự (GTT) gen hệ thứ hai (NGS- Next Generation Sequencing) ứng dụng chúng mang lại giải pháp hữu hiệu Thừa hưởng tính a-CGH, NGS có tính vượt trội việc sàng lọc bất thường số lượng NST phôi với độ phân giải độ xác cao cung cấp thêm thơng tin cho phân tích sâu gene liên quan tới hội chứng bệnh Bên cạnh đó, phân tích lúc nhiều mẫu lần chạy giúp giảm chi phí cho người bệnh Đáng ý theo hai nghiên cứu Yang cộng năm 2012 2015, cho thấy sử dụng phương pháp đánh giá hình thái kết hợp với kỹ thuật giải trình tự gen để đánh giá lựa chọn phôi làm tăng tỷ lệ thành công TTTON lên 74,7% cao nhiều so với phương pháp khác [73, 74] Vì vậy, thực nghiên cứu: “Khảo sát rối loạn số lượng nhiễm sắc thể phôi ngày tuổi thụ tinh ống nghiệm” với mục tiêu: • Xác định tỷ lệ rối loạn số lượng nhiễm sắc thể phôi thụ tinh ống nghiệm ngày tuổi kỹ thuật PGS-NGS • Đánh giá mối tương quan rối loạn số lượng nhiễm sắc thể phôi thụ tinh ống nghiệm ngày tuổi yếu tố tuổi người mẹ Nghiên cứu nằm đề tài “Nghiên cứu ứng dụng phát triển công nghệ tiên tiến phục vụ bảo vệ chăm sóc sức khỏe cộng đồng” mã số KC.10.09/16-20 thực Phịng phân tích ADN – Bộ mơn Giải phẫu – Học viện Quân Y nghĩa Tuy nhiên, ta thấy rõ ràng tỷ lệ bất thường số lượng nhiễm sắc thể tăng nhanh chóng người mẹ sau tuổi 37 Dưới đường hồi quy tuyến tính thể mối tương quan tuổi người mẹ bất thường số lượng NST (hình 19) Nhận thấy, 22,87% biến đổi tỷ lệ bất thường số lượng nhiễm sắc thể giải thích biến đổi yếu tố tuổi mẹ (hệ số xác định R-square = 0,2287) Khi tuổi mẹ tăng thêm đơn vị tỷ lệ bất thường số lượng nhiễm sắc thể tăng thêm 0.01 đơn vị thay đổi có ý nghĩa với độ tin cậy 95% Như vậy, chúng tơi đưa phương trình thể mối liên hệ sau: Tỷ lệ bất thường số lượng NST = -0,7 + 0,01 x (tuổi mẹ) 0.9 y = 0,01x - 0,07 R² = 0,2287 0.8 Tỷ lệ BT SLNST 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 20 25 30 35 40 45 50 Tuổi mẹ Tỷ lệ BT SLNST Linear (Tỷ lệ BT SLNST) Hình 19 Đường hồi quy tuyến tính thể mối tương quan tuổi mẹ tỷ lệ bất thường số lượng NST R2: hệ số xác định Dưới kết đánh giá mối tương quan tuổi người mẹ đặc điểm bất thường nhiễm sắc thể phôi ngày tuổi thụ tinh ống nghiệm 57 Bảng 14 Đặc điểm bất thường NST phân chia theo độ tuổi người mẹ Peasrson chi2 (10) =4,8438 pr = 0,304