Luận văn sư phạm Nghiên cứu đặc điểm sinh học và khả năng sinh CELLULASE của một số chủng xạ khuẩn phân lập được từ đất ở Vĩnh Phúc

TR NG A H C S PH M HÀ N I KHOA SINH-KTNN  TR N TH LY NGHIÊN C U C I M SINH H C VÀ KH N NG SINH CELLULASE C A M T S CH NG X KHU N PHÂN L P T CT T NH V NH PHÚC KHOÁ LU N T T NGHI P IH C CHUYÊN NGÀNH: VI SINH H C Ng ih ng d n khoa h c Ths Nguy n Kh c Thanh HƠ N i, tháng n m 2010 L IC M N Em xin bƠy t lòng bi t n sơu s c t i Ths Nguy n Kh c Thanh t n tình ch b o, h ng d n em su t trình h c t p vƠ th c hi n đ tƠi Em c ng xin chơn thƠnh c m n toƠn th th y cô t vi sinh ch b o vƠ giúp đ , đ em có th hoƠn thƠnh đ c khóa lu n t t nghi p nƠy Em xin chơn thƠnh c m n ban ch nhi m khoa Sinh- KTNN, ban giám hi u nhƠ tr đ ng t o u ki n t t nh t đ em có th hoƠn thƠnh c khóa lu n t t nghi p nƠy Cu i em c m n gia đình vƠ b n bè đ ng viên giúp đ em su t th i gian qua Em xin chơn thƠnh c m n! Xuân Hòa , tháng 05 n m 2010 Sinh viên Tr n Th Ly L I CAM OAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên c u c a riêng tơi Các k t qu nghiên c u, s li u đ c trình bày khóa lu n hồn tồn trung th c khơng trùng v i k t qu c a tác gi khác Tác gi Tr n Th Ly CÁC T VI T T T VSV : Vi sinh v t ISP : International Steptomyces Project CFU : Colony Forming Unit HSKS : H s i khí sinh HSCC : H s i c ch t DANH M C B NG VÀ HÌNH TRONG KHĨA LU N B NG B ng 3.1 Tên b ng Trang ct đ t 22 ng c a th i gian đ n kh n ng sinh cellulase c a ch ng x khu n nghiên c u 27 ng c a ngu n cacbon t nhiên đ n ho t tính 32 Các ch ng x khu n sinh cellulase phân l p đ t nh V nh Phúc 3.2 3.3 nh h nh h cellulase c a ch ng x khu n nghiên c u 3.4 nh h ng c a ngu n nit đ n kh n ng sinh tr ng 33 ho t tính cenlulase c a ch ng x khu n nghiên c u 3.5 nh h ng c a pH đ n kh ho t tính cellulase c a ch ng x khu n nghiên c u 34 HÌNH Hình Tên hình Trang 3.1 M t s hình nh v x khu n 24 3.2 Hình nh khu n l c cu ng sinh bào t c a ch ng 26 x khu n nghiên c u 3.3 nh h ng c a th i gian nuôi c y đ n ho t tính cellulase 29 c a ch ng M10 3.4 Ho t tính cellulase c a ch ng x khu n sinh tr môi tr ng 33 ng cacbon t nhiên BI U Bi u đ Tên bi u đ nh h ng c a th i gian đ n kh n ng sinh cellulase Trang 28 c a ch ng x khu n nghiên c u nh h nh h ng c a ngu n nit đ n ho t tính cellulase c a ch ng x khu n nghiên c u 35 ng c a n ng đ pH đ n ho t tính cellulase 36 c a ch ng x khu n nghiên c u M CL C Ph n m đ u…………………………………………… Ch ng T ng quan tƠi li u…………………………………………… 1.1 c m phân lo i x khu n…………………………… … … 1.1.1 M t s ph ng pháp phân lo i x khu n……………… ….….5 1.1.2 Vai trò c a x khu n…………………………………………… … 1.2 Nhu c u dinh d ng c a x khu n…………………………………… 1.2.1 Nhu c u cacbon …………………………………………………… 1.2.2 Nhu c u nit ……………………………………………………… 1.2.3 Nhu c u vitamin khoáng…………………… ………… 10 1.3 Các y u t nh h ng đ n đ i s ng c a x khu n…………………….10 1.4 Cellulase cellulose………… …………………………………… 12 1.4.1 Cellulose ……………………………………………………….… 13 1.4.1 Cellulase ……………………………………………………….… 14 1.5 Tri n v ng, ng d ng c a cellulase…………………… …………….14 Ch ng V t li u vƠ ph ng pháp nghiên c u……………………… 17 2.1 V t li u……………………………… ………………………………17 2.1.1 Nguyên li u………………………… …………………………… 17 2.1.2 Hóa ch t………………………………… …………………………17 2.1.3 D ng c thi t b …………………… ………………………… 17 2.1.4 Môi tr ng phân l p x khu n…………………… ……………….17 2.1.5 Môi tr 2.2 Ph ng th ho t tính cellulase c a x khu n……………………19 ng pháp nghiên c u…………………… ……………………….20 2.2.1 Ph ng pháp l y m u……… ……………… …………………….20 2.2.2 Ph ng pháp phân l p x khu n t m u đ t…… … ………… 20 2.2.3 Ph ng pháp b o qu n gi ng…………….………………………….21 2.2.4 Ph ng pháp xác đ nh kh n ng sinh cellulase c a x khu n… … 21 Ch ng K t qu vƠ th o lu n…………………………………………22 3.1 Phân l p, n ch n x khu n sinh cellulase t đ t……………… 22 3.2 c m hình thái c a ch ng x khu n nghiên c u………… …25 3.3 Nghiên c u nh h ng c a các y u t môi tr ng u ki n nuôi c y đ n ho t tính cellulase c a m t s ch ng x khu n ………….……….27 3.3.1 nh h ng c a th i gian nuôi c y………………………… …… 27 3.3.2 nh h ng c a ngu n cacbon………………… ………………… 31 3.3.3 nh h ng c a ngu n nit …………………… ………………… 34 3.3.4 nh h ng c a pH……………………… ……………………… 35 K t lu n vƠ đ ngh ……………………………………………………… 37 TƠi li u tham kh o……………………………………………………… 38 Khãa luËn tèt nghiÖp Tr-ờng ĐHSP Hà Nội M U Cellulose l lo i h p ch t h u c d i t nhiên, chi m t i 4050 % hydratcacbon Cellulose thành ph n ch y u t o lên b khung x t bào th c v t Trung bình m i n m đ ng c tính có kho ng 30 t t n ch t h u c c sinh t ng h p trái đ t có 30 % thành t bào th c v t, thành ph n ch y u c a thành t bào th c v t cellulose Hàng n m trái đ t ph i nh n v m t l ng ch t th i kh ng l (ch t th i sinh ho t, ch t th i th c v t nh lá, cành …ch t th i công nghi p) phân gi i l ng l n cellulose khu h vi sinh v t (VSV) đ t đóng vai trò khơng nh Mu n làm đ c u vi sinh v t ph i s n sinh cellulase, enzyme cellulase đóng vai trò phân gi i cellulose Trong đ t có r t nhi u lồi VSV có kh n ng sinh t ng h p cellulase, x khu n m t nh ng loài y X khu n đóng vai trò quan tr ng q trình hình thành đ t, q trình mùn hóa, tham gia vào vòng tu n hồn chuy n hóa h p ch t h u c M c dù x khu n khơng có kh n ng sinh tr ng nhanh b ng n m m c nhiên ho t tính cellulase c a x khu n m nh h n r t nhi u, bên c nh x khu n có kh n ng thích ng t t v i mơi tr tr ng khơng khí N u n m m c c n u ki n đ tri n x khu n sinh tr ng u ki n đ nghiên c u cho th y r ng môi tr tr ng đ t, n ng h n r t nhi u so v i môi tr c c mơi m cao m i có th phát m th p, nh ng m c dù v y ng đ ng l ng, m th p x khu n sinh m t s lồi ho t tính enzyme Ngày v i s phát tri n c a công ngh sinh h c, ngày nhi u enzyme đ c ng d ng đ i s ng nh : proteinase ng d ng công nghi p ch bi n s a, amylase công nghi p r Trần Thị Ly u, cellulase ng d ng K32D – Sinh Khãa luËn tèt nghiÖp Tr-êng §HSP Hµ Néi s n xu t gi y, công nghi p may, s i, s n xu t th c n cho gia súc, x lý ch t th i nông nghi p, s n xu t lo i đ ng probiotin… Nh v y cellulase x khu n đ u có vai trò quan tr ng đ i s ng ng ó c ng lý ch n nghiên c u đ tài: “Nghiên c u đ c i m sinh h c kh n ng sinh cellulase c a m t s ch ng x khu n phân l p đ ct đ t t nh V nh Phúc” nh m hi u rõ h n v kh n ng sinh cellulase c a m t s ch ng x khu n, y u t môi tr h ng u ki n nuôi c y nh ng nh th đ n kh n ng sinh cellulase ho t tính cellulase t đ a h ng phù h p nh m thu đ ch ng x khu n đ c s n l ng cellulase cao nh t t c ch n, ph c v cho ng d ng ti p theo M c tiêu đ tƠi Phân l p, n ch n ch ng x khu n có ho t tính cellulase cao t đ t t nh v nh phúc Nghiên c u nh h ng c a y u t môi tr ng u ki n (th i gian, pH, ngu n cacbon, ngu n nit ) đ n ho t tính cellulase c a ch ng x khu n N i dung c a đ tƠi - Phân l p, n ch n x khu n có ho t tính cellulase cao t đ t t i Xuân Hòa – Phúc Yên – V nh Phúc - Nghiên c u đ c m hình thái c a m t s ch ng x khu n có ho t tính cellulase cao - Nghiên c u nh h ng c a y u t mơi tr c y đ n ho t tính cellulase c a ch ng x khu n đ TrÇn ThÞ Ly + nh h ng c a th i gian + nh h ng c a ngu n cacbon ng u ki n nuôi c ch n K32D – Sinh Khãa luËn tèt nghiÖp C n c vào k t qu thu đ - S phân b x khu n - Cùng m t lo i t Tr-ờng ĐHSP Hà Nội c tụi a m t s k t lu n sau: lo i đ t khác khác đ sâu khác s phân b c a x khu n khác - Các ch ng x khu n phân l p đ c có ho t tính cellulase m nh Trong ch ng M3, M7, M10, M13 có ho t tính cellulase m nh nh t Tôi ch n ch ng đ ti p t c ti n hành nghiên c u ti p theo 3.2 c m hình thái c a ch ng x khu n nghiên c u Tôi ti n hành nghiên c u đ c m hình thái c a ch ng M3, M7, M10, M13 th y r ng môi tr ng Gause I: - Ch ng M3: HSKS màu nâu, HSCC màu vàng x n, s c t tan màu vàng, th i gian xu t hi n khu n l c 24 - 48h, cu ng sinh bào t d ng th ng - Ch ng M7: HSKS màu h ng, HSCC màu đ da cam, s c t tan màu đ g ch, th i gian xu t hi n khu n l c 24-48h, cu ng sinh bào t d ng móc, xo n khơng hồn tồn - Ch ng M10: HSKS màu xám, HSCC màu vàng x n, sinh s c t tan vàng nh t th i gian xu t hi n khu n l c 24 - 48h, cu ng sinh bào t d ng xo n th ng - Ch ng M13: HSKS màu xám, HSCC màu vàng x n, sinh s c t tan màu tr ng đ c, th i gian xu t hi n khu n l c t 24- 48h, cu ng sinh bào t d ng l n súng Trần Thị Ly 25 K32D Sinh Khóa luận tốt nghiệp Tr-ờng ĐHSP Hà Nội M7 a M3 M13 b c Hình 3.2: hình nh khu n l c vƠ cu ng sinh bƠo t c a ch ng x khu n nghiên c u a- Khu n l c x khu n b, c- Cu ng sinh bào t c a ch ng x khu n nghiên c u Trần Thị Ly 26 K32D Sinh Khóa luận tốt nghiệp Tr-ờng ĐHSP Hà Nội 3.3 Nghiờn c u nh h ng c a m t s y u t môi tr ng vƠ u ki n nuôi c y đ n kh n ng sinh cellulase c a ch ng x khu n 3.3.1 nh h ng c a th i gian nuôi c y B ng cách c y ch m m ch ng x khu n M3, M7, M10, M13 h p petri có ch a mơi tr ng 1% CMC, nuôi t mt 1đ n5 ngày, m i ngày mang m u th v i Lugol I K t qu trình bày b ng sau: B ng 3.2: nh h ng c a th i gian đ n kh n ng sinh cellulase c a ch ng x khu n nghiên c u Ch ng M3 M7 M10 M13 MƠu s c vòng phơn gi i Ngày Tím đ m 10 10 14 13 Tím đ m 22 18 24 21 Tím nh t 27 21 29 27 Trong su t 29 25 32 28 Trong su t Ho t tính enzyme : D-d n v : mm Trần Thị Ly 27 K32D Sinh Ho t tính cellulase (D-d) Khãa ln tèt nghiƯp Tr-êng §HSP Hµ Néi 35 30 25 20 15 10 M3 Ngày M7 M10 M13 Bi u đ 1: nh h ng c a th i gian nuôi c y đ n kh n ng sinh cellulase c a ch ng x khu n nghiên c u T b ng 3.2 bi u đ nh n th y th i gian có nh h ng r t l n đ n kh n ng sinh cellulase c a ch ng x khu n, l ng cellulase thu đ nhi u nh t vào th i m 48- 72h nuụi c y Trần Thị Ly 28 K32D Sinh c Khóa luận tốt nghiệp Tr-ờng ĐHSP Hà Nội M10-1 M10-2 M10-3 M10-4 M10-5 Hình 3.3: nh h ng c a th i gian nuôi c y đ n ho t tính cellulase c a ch ng M10 Trần Thị Ly 29 K32D Sinh Khóa luận tốt nghiệp Tr-ờng ĐHSP Hà Nội Mu s c c a vòng phân gi i bi n đ i t tím đ m sang tím nh t r i cu i chuy n sang su t i u có th gi i thích nh sau: th nh t sau c y ch ng x khu n lên môi tr ngày ng th ch đ a ch a ngu n cacbon CMC Các ch ng x khu n bám dính b m t th ch (giai đo n ti m phát) chúng b t đ u sinh t ng h p cellulase Các enzyme khu ch tán môi tr ng, phân gi i cellulose thành oligosaccharide thu n ng l ng cung c p cho trình sinh tr ng Khi nhu m màu Lugol I oligosacharit b t màu nên vòng phân gi i có màu tím đ m Sang ngày th 2-3 ch ng x khu n phân chia nhanh chóng nh m t ng sinh t bào (giai đo n logarid) Quá trình đòi h i c n cung c p m t l ng l n ch t dinh d tr ng, ch t dinh d ng nghèo dinh d ng ta đ a vào c đ nh Khi môi ng, ngu n n ng l ng thu t vi c oxi hóa cellulose thành oligosaccharide khơng đ cung c p cho trình phát tri n, chúng b t đ u sinh t ng h p enzyme phân gi i oligosaccharide thành glucose D n d n l ng cellulose môi tr c n ki t, qu n th x khu n b ng b phân h y hoàn toàn, ngu n dinh d c vào giai đo n suy vong suy vong, vòng phân gi i su t, t ng v khích th môi tr ng c Tuy nhiên enzyme v n có m t ng ni c y Vi c nghiên c u tác đ ng c a th i gian đ n kh n ng sinh cellulase c a ch ng x khu n đem l i nh ng hi u bi t v trình phát tri n c a x khu n nói chung kh n ng sinh enzyme c a ch ng x khu n th i kì sinh tr tr ng nói riêng Ng t ng i ta có th nghiên c u đ ng thái sinh ng, đ ng thái sinh enzyme đ bi t đ c th i m thu đ c nhi u enzyme nh t t thi t l p m t dây truy n s n xu t hoàn ch nh cho phù h p nh t đem l i l i nhu n kinh t cao Trần Thị Ly 30 K32D Sinh Khãa ln tèt nghiƯp 3.3.2 nh h Tr-êng §HSP Hµ Néi ng c a ngu n cacbon Cacbon m t nh ng ngu n dinh d ng không th thi u đ i v i đ i s ng c a b t kì lồi sinh v t nào, ngu n cacbon t n t i nhi u d ng khác t h p ch t vô c đ n gi n (CO 2) đ n h p ch t vô c ph c t p ( ng, polisaccharide…) Cellulose ngu n cacbon ch y u t nhiên, l ng cellulose ph n l n t rác th i (thân, lá, r th c v t, rác th i cơng nghi p…) đ ng hóa đ c l ng cellulose kh ng l đòi h i ch ng x khu n nói riêng VSV nói chung ph i có kh n ng t ng h p cellulase S phát tri n c a công ngh sinh h c Ng i ta b t đ u ngh đ n vi c t n d ng ngu n cellulose ph th i (bã ngô, bã đ u, bã mía, v l c, v tr u…) đ s n xu t lo i th c n cho gia súc nông nghi p d i h u nh ch a đ ây m t ngu n ph th i c t n d ng khu n có ho t tính cellulase m nh sinh tr tìm ch ng x ng mơi tr ng có ngu n cacbon này, tơi ti n hành nuôi c y ch ng x khu n M3, M7, M10, M13 môi tr ng ch a ngu n cacbon t nhiên lõi ngơ, v l c , v tr u t tìm ch ng có ho t tính cellulase cao ng d ng vào đ i s ng s n xu t Tôi ti n hành c y ch ng x khu n M3, M7, M10, M13 l n l t môi tr ng l ng ch a lõi ngô, v l c, v tr u Nuôi l c n nhi t (30 oC, 160v/p) ngày r i li tâm thu l th ho t tính cellulase b ng ph bày ng enzyme thơ, đem ng pháp nh d ch K t qu đ c trỡnh b ng sau: Trần Thị Ly 31 K32D Sinh Khãa luËn tèt nghiÖp B ng 3.3: nh h Tr-ờng ĐHSP Hà Nội ng c a ngu n cacbon t nhiên đ n ho t tính cellulase c a ch ng x khu n nghiên c u Ch ng M3 M7 M10 M13 Ngô 21 26 29 27 L c 31 23 28 28 Tr u 23 29 32 33 C ch t Ho t tính enzyme: D-d n v : mm T b ng ta nh n th y ch ng x khu n ch ng M10 thích h p nh t v i môi tr môi tr ng ch a lõi ngô, ch ng M3 phát tri n m nh nh t ng ch a v l c Ch ng M13 môi tr ng v tr u Trong ch ng x khu n nghiên c u ch ng M10 M13 có kh n ng sinh tr ng phát tri n đ ng đ u môi tr ng ch a ngu n cacbon t nhiên Ba ngu n cacbon: lõi ngô, v l c, v tr u có c u t o ch y u cellulase hemicellulase gi ng v i ngu n cacbon t nhiên có th gi i thích t i nuôi c y ch ng x môi tr i u ng ch a ngu n đ u cho ho t tính cellulase cao Trần Thị Ly 32 K32D Sinh Khóa luận tốt nghiệp Tr-ờng ĐHSP Hà Nội Hỡnh 3.4 Ho t tính cellulase c a ch ng x khu n sinh tr môi tr 3.3.3 nh h ng ng cacbon t nhiên ng c a ngu n nit C y ch ng x khu n M3, M7, M10, M13 l n l t môi tr ng ch a ngu n Nit khác nhau, nuôi l c n nhi t (160v/p) ngày Sau li tâm thu sinh kh i t bào d ch enzyme thô, cân kh i l bào th ho t tính enzyme b ng ph ng khơ t ng pháp nh d ch K t qu trình bày b ng sau B ng 3.4: nh h ng c a ngu n nit đ n kh n ng sinh tr ng ho t tính cellulase c a ch ng x khu n nghiên c u NH4Cl Ch ng D-d (mm) M3 24 M7 26 M10 18 M13 17 Mtb (g) 0,375 0,391 0,351 0,489 (NH4)2SO4 KNO3 D-d (mm) 22 20 32 24 D-d (mm) 28 21 30 32 Mtb (g) 0,450 0,386 0,417 0,417 KNO2 Mtb (g) 0,381 0,405 0,486 0,512 D-d (mm) 19 32 27 28 Mtb (g) 0,367 0,317 0,315 0,283 Mtb : Kh i l ng khơ t bào D-d: Ho t tính cellulase TrÇn ThÞ Ly 33 K32D – Sinh ( D-d) Khãa luËn tốt nghiệp Tr-ờng ĐHSP Hà Nội 35 30 25 20 15 10 M3 M7 M10 M13 (Ch ng x khu n) NH4Cl (NH4)2SO4 KNO3 KNO2 Bi u đ 2: nh h ng c a ngu n nit đ n ho t tính cellulase c a ch ng x khu n nghiên c u T b ng 3.4 bi u đ 2, nh n th y ch ng x khu n sinh tr ng t t nh t ngu n nitrat, đ i v i ngu n nitrit x khu n sinh tr ng y u nh t Ho t tính cellulase c a ch ng M3 M13 m nh nh t nitrat Ng tr môi tr ng c l i ch ng M10 l i có ho t tính cellulase m nh nh t sinh ng mơi tr ng có ch a ngu n amôn Riêng ch ng M7 l i có ho t tính cellulase m nh đ i v i mụi tr Trần Thị Ly ng nitrit 34 K32D Sinh Khóa luận tốt nghiệp Tr-ờng ĐHSP Hà Néi Theo Nguy n Thành khác t, VSV đ ng hóa NO 3- t t h n ngu n i u có th gi i thích t i ch ng x khu n sinh tr môi tr ng t t ng ch a ngu n nitrat [8] M i quan h gi a sinh tr ng kh n ng sinh enzyme r t m t thi t Ph n l n v i lồi sinh v t m t mơi tr kh n ng sinh enzyme cao Tuy nhiên thu enzyme khác bi t so v i môi tr m t u ki n môi tr ng n u sinh tr m t s lồi mơi tr ng thu sinh kh i ng t t ng nuôi c y i u có ngh a là: ng nh t đ nh VSV sinh tr ng t t ch a ch c cho l ng enzyme cao Vi c nghiên c u tác đ ng c a y u t môi tr đ n kh n ng sinh enzyme c a VSV giúp ta tìm môi tr ng ng t i u ch dùng vào vi c nuôi c y thu enzyme 3.3.4 nh h ng c a n ng đ pH Nuôi l c n nhi t ch ng x khu n M3, M7, M10, M13 môi tr ng hi u ch nh pH (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9…) Sau ngày l y ly tâm thu d ch enzyme thô sinh kh i t bào, đem cân kh i l ng khô t bào th ho t tính enzyme b ng cách đo đ ng kính vòng phân gi i K t qu th hi n b ng sau: B ng 3.5: pH Ch ng M3 M7 M10 M13 nh h ng c a pH đ n ho t tính cellulase c a ch ng x khu n nghiên c u 17 19 16 17 21 22 20 19 23 28 21 22 22 29 21 25 27 22 27 28 29 21 29 29 26 14 22 25 20 11 17 19 Ho t tớnh enzyme: D-d n v : mm Trần Thị Ly 35 K32D – Sinh Khãa luËn tèt nghiÖp Tr-êng §HSP Hµ Néi 35 30 25 D-d 20 15 10 5 pH 9M3 M7 M10 M13 Bi u đ 3: nh h ng c a pH đ n ho t tính cellulase c a ch ng x khu n nghiên c u T b ng 3.5 bi u đ 3, nh n th y n ng đ pH có nh h ng r t l n đ n kh n ng sinh tr ng c ng nh kh n ng t ng h p cellulase c a ch ng x khu n nghiên c u Các ch ng x khu n nghiên c u sinh t ng h p nhi u enzyme kho ng 4-5 pH t 6-8, riêng ch ng M7 pH thích h p n m vào i u có th gi i thích nh sau: ch ng M7 phân l p đ đ t ru ng, ph n l n đ t tr ng lúa ct t nh v nh phúc đ u thu c lo i đ t chua (có pH