Tôi ti n hành nghiên c u đ c đi m hình thái c a ch ng M3, M7, M10,
M13 th y r ng trên môi tr ng Gause I:
- Ch ng M3: HSKS màu nâu, HSCC màu vàng x n, s c t tan màu vàng, th i gian xu t hi n khu n l c 24 - 48h, cu ng sinh bào t d ng th ng
- Ch ng M7: HSKS màu h ng, HSCC màu đ da cam,s c t tan màu đ g ch, th i gian xu t hi n khu n l c 24-48h, cu ng sinh bào t d ng móc, xo n không hoàn toàn.
- Ch ng M10: HSKS màu xám, HSCC màu vàng x n, sinh s c t tan
vàng nh t. th i gian xu t hi n khu n l c 24 - 48h, cu ng sinh bào t d ng xo n th ng.
- Ch ng M13: HSKS màu xám, HSCC màu vàng x n, sinh s c t tan màu
tr ng đ c, th i gian xu t hi n khu n l c t 24- 48h, cu ng sinh bào t d ng l n sóng.
Khãa luËn tèt nghiÖp Tr-êng §HSP Hµ Néi 2 TrÇn ThÞ Ly K32D 26 – Sinh M7 a M3 M13 b c
Hình 3.2: hình nhkhu n l c vƠ cu ng sinh bƠo t c a ch ng x khu n nghiên c u
a- Khu n l c x khu n
Khãa luËn tèt nghiÖp Tr-êng §HSP Hµ Néi 2
TrÇn ThÞ Ly K32D 27 – Sinh
3.3. Nghiên c u nh h ng c a m t s y u t môi tr ng vƠ đi u ki n nuôi c y đ n kh n ng sinh cellulase c a các ch ng x khu n
3.3.1 nh h ng c a th i gian nuôi c y
B ng cách c y ch m đi m các ch ng x khu n M3, M7, M10, M13
trên h p petri có ch a môi tr ng 1% CMC, nuôi trong t m t 1 đ n 5
ngày, m i ngày mang m u ra th v i Lugol I. K t qu trình bày b ng sau:
B ng 3.2: nh h ng c a th i gian đ n kh n ng sinh cellulase c a các ch ng x khu n nghiên c u. Ch ng Ngày M3 M7 M10 M13 MƠu s c vòng phơn gi i 1 3 4 9 7 Tím đ m 2 10 10 14 13 Tím đ m 3 22 18 24 21 Tím nh t 4 27 21 29 27 Trong su t 5 29 25 32 28 Trong su t Ho t tính enzyme : D-d n v : mm
Khãa luËn tèt nghiÖp Tr-êng §HSP Hµ Néi 2
TrÇn ThÞ Ly K32D 28 – Sinh
Bi u đ 1: nh h ng c a th i gian nuôi c y đ n kh n ng sinh cellulase c a các ch ng x khu n nghiên c u
0 5 10 15 20 25 30 35 1 2 3 4 5 Ngày H ot tí nh c el lu las e ( D -d ) M3 M7 M10 M13 T b ng 3.2 và bi u đ 1 tôi nh n th y th i gian có nh h ng r t l n đ n kh n ng sinh cellulase c a các ch ng x khu n, l ng cellulasethu đ c nhi u nh t là vào th i đi m 48- 72h nuôi c y.
Khãa luËn tèt nghiÖp Tr-êng §HSP Hµ Néi 2
TrÇn ThÞ Ly K32D 29 – Sinh
M10-1 M10-2
M10-3 M10-4
M10-5
Hình 3.3: nh h ng c a th i gian nuôi c y đ n ho t tính cellulase c a ch ng M10.
Khãa luËn tèt nghiÖp Tr-êng §HSP Hµ Néi 2
TrÇn ThÞ Ly K32D 30 – Sinh (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Màu s c c a vòng phân gi i bi n đ i t tím đ m sang tím nh t r i
cu i cùng chuy n sang trong su t. i u này có th gi i thích nh sau: ngày
th nh t sau khi c y ch ng x khu n lên môi tr ng th ch đ a ch a ngu n
cacbon là CMC. Các ch ng x khu n này bám dính trên b m t th ch (giai
đo n ti m phát) chúng b t đ u sinh t ng h p cellulase . Các enzyme này
khu ch tán trong môi tr ng, phân gi i cellulose thành các oligosaccharide
thu n ng l ng cung c p cho quá trình sinh tr ng. Khi nhu m màu Lugol I
các oligosacharit này b t màu nên vòng phân gi i có màu tím đ m. Sang ngày
th 2-3 các ch ng x khu n phân chia nhanh chóng nh m t ng sinh t bào (giai đo n logarid). Quá trình này đòi h i c n cung c p m t l ng l n ch t dinh d ng, trong khi đó ch t dinh d ng ta đ a vào là c đ nh. Khi môi tr ng nghèo dinh d ng, ngu n n ng l ng thu t vi c oxi hóa cellulose thành oligosaccharide không đ cung c p cho quá trình phát tri n, chúng b t đ u sinh t ng h p enzyme phân gi i oligosaccharide thành glucose. D n d n l ng cellulose trong môi tr ng b phân h y hoàn toàn, ngu n dinh d ng c n ki t, qu n th x khu n b c vào giai đo n suy vong suy vong, vòng phân gi i trong su t, ít t ng v khích th c. Tuy nhiên các enzyme v n có m t trong môi tr ng nuôi c y.
Vi c nghiên c u tác đ ng c a th i gian đ n kh n ng sinh cellulase
c a các ch ng x khu n đem l i nh ng hi u bi t v quá trình phát tri n c a x khu n nói chung và kh n ng sinh enzyme c a các ch ng x khu n t ng th i kì sinh tr ng nói riêng. Ng i ta có th nghiên c u đ ng thái sinh tr ng, đ ng thái sinh enzyme đ bi t đ c th i đi m nào thu đ c nhi u
enzyme nh t t đó thi t l p m t dây truy n s n xu t hoàn ch nh sao cho phù h p nh t đem l i l i nhu n kinh t cao.
Khãa luËn tèt nghiÖp Tr-êng §HSP Hµ Néi 2
TrÇn ThÞ Ly K32D 31 – Sinh
3.3.2. nh h ng c a ngu n cacbon
Cacbon là m t trong nh ng ngu n dinh d ng không th thi u đ i v i đ i s ng c a b t kì loài sinh v t nào, ngu n cacbon này t n t i nhi u d ng khác nhau t các h p ch t vô c đ n gi n (CO2) đ ncác h p ch t vô c ph c t p ( ng, các polisaccharide…). Cellulose là ngu n cacbon ch y u trong t nhiên, l ng cellulose này ph n l n t rác th i (thân, lá, r th c v t, rác th i công nghi p…). đ ng hóa đ c l ng cellulose kh ng l này đòi h i các ch ng x khu n nói riêng và các VSV nói chung ph i có kh n ng t ng h p cellulase.
S phát tri n c a công ngh sinh h c. Ng i ta b t đ u ngh đ n vi c t n d ng ngu n cellulose trong ph th i (bã ngô, bã đ u, bã mía, v l c, v tr u…) đ s n xu t các lo i th c n cho gia súc. ây là m t ngu n ph th i nông nghi p khá d i dào h u nh ch a đ c t n d ng. tìm ra ch ng x khu n có ho t tính cellulase m nh khi sinh tr ng trên các môi tr ng có ngu n cacbon này, tôi ti n hành nuôi c y 4 ch ng x khu n M3, M7, M10, M13 trong các môi tr ng ch a ngu n cacbon t nhiên là lõi ngô, v l c , v tr u t đó tìm ra ch ngcó ho t tính cellulase cao ng d ng vào đ i s ng s n xu t.
Tôi ti n hành c y các ch ng x khu n M3, M7, M10, M13 l n l t trong các môi tr ng l ng ch a lõi ngô, v l c, v tr u. Nuôi l c n nhi t (30o
C, 160v/p) trong 4 ngày r i li tâm thu l ng enzyme thô, đem th ho t tính cellulase b ng ph ng pháp nh d ch. K t qu đ c trình
Khãa luËn tèt nghiÖp Tr-êng §HSP Hµ Néi 2
TrÇn ThÞ Ly K32D 32 – Sinh
B ng 3.3: nh h ng c a ngu n cacbon t nhiênđ n ho t tính cellulase
c a các ch ng x khu n nghiên c u. Ch ng C ch t M3 M7 M10 M13 Ngô 21 26 29 27 L c 31 23 28 28 Tr u 23 29 32 33 Ho t tính enzyme: D-d n v : mm
T b ng trên ta nh n th y trong 4 ch ng x khu n ch ng M10 thích
h p nh t v i môi tr ng ch a lõi ngô, ch ng M3 phát tri n m nh nh t trong môi tr ng ch a v l c. Ch ng M13 trong môi tr ng v tr u.
Trong 4 ch ng x khu n nghiên c u ch ng M10 và M13có kh n ng
sinh tr ng và phát tri n đ ng đ u trong các môi tr ng ch a ngu n cacbon t nhiên.
Ba ngu n cacbon: lõi ngô, v l c, v tr u có c u t o ch y u là
cellulase và hemicellulase gi ng v i ngu n cacbon trong t nhiên. i u này có th gi i thích t i sao khi nuôi c y các ch ng x trong môi tr ng ch a các ngu n nàyđ u cho ho t tính cellulase cao.
Khãa luËn tèt nghiÖp Tr-êng §HSP Hµ Néi 2 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
TrÇn ThÞ Ly K32D 33 – Sinh
Hình 3.4. Ho t tính cellulase c a các ch ng x khu n sinh tr ng trong môi tr ng cacbon t nhiên
3.3.3. nh h ng c a ngu n nit
C y các ch ng x khu n M3, M7, M10, M13 l n l t trong các môi
tr ng ch a ngu n Nit khác nhau, nuôi l c n nhi t (160v/p) trong 4 ngày. Sau đó li tâm thu sinh kh i t bào và d ch enzyme thô, cân kh i l ng khô t bào và th ho t tính enzymeb ng ph ng pháp nh d ch. K t qu trình bày b ng sau.
B ng 3.4: nh h ng c a ngu n nit đ n kh n ng sinh tr ng và ho t
tính cellulase c a cácch ng x khu n nghiên c u.
Ch ng NH4Cl (NH4)2SO4 KNO3 KNO2 D-d (mm) Mtb (g) D-d (mm) Mtb (g) D-d (mm) Mtb (g) D-d (mm) Mtb (g) M3 24 0,375 22 0,450 28 0,381 19 0,367 M7 26 0,391 20 0,386 21 0,405 32 0,317 M10 18 0,351 32 0,417 30 0,486 27 0,315 M13 17 0,489 24 0,417 32 0,512 28 0,283 Mtb : Kh i l ng khô t bào D-d: Ho t tính cellulase
Khãa luËn tèt nghiÖp Tr-êng §HSP Hµ Néi 2
TrÇn ThÞ Ly K32D 34 – Sinh
Bi u đ 2: nh h ng c a ngu n nit đ n ho t tính cellulase c a các ch ng x khu n nghiên c u
0 5 10 15 20 25 30 35 M3 M7 M10 M13 (Ch ng x khu n) ( D -d ) NH4Cl (NH4)2SO4 KNO3 KNO2
T b ng 3.4 và bi u đ 2, tôi nh n th y các ch ng x khu n sinh tr ng t t nh t ngu n nitrat, đ i v i ngu n nitrit x khu n sinh tr ng y u nh t.
Ho t tính cellulase c a ch ng M3 và M13 m nh nh t môi tr ng nitrat. Ng c l i ch ng M10 l i có ho t tính cellulase m nh nh t khi sinh tr ng trong môi tr ng có ch a ngu n amôn. Riêng ch ng M7 l i có ho t tính cellulase m nh đ i v i môi tr ng nitrit.
Khãa luËn tèt nghiÖp Tr-êng §HSP Hµ Néi 2
TrÇn ThÞ Ly K32D 35 – Sinh
Theo Nguy n Thành t, VSV đ ng hóa NO3
- t t h n các ngu n khác. i u này có th gi i thích t i sao các ch ng x khu n sinh tr ng t t
trong môi tr ng ch a ngu n nitrat [8].
M i quan h gi a sinh tr ng và kh n ng sinh enzyme là r t m t thi t. Ph n l n v i các loài sinh v t trong m t môi tr ng n u sinh tr ng t t thì kh n ng sinh enzyme cao. Tuy nhiên m t s loài môi tr ng nuôi c y
thu enzyme khác bi t so v i môi tr ng thu sinh kh i. i u này có ngh a là:
m t đi u ki n môi tr ng nh t đ nh nào đó VSV sinh tr ng t t ch a ch c đã cho l ng enzyme cao. Vi c nghiên c u tác đ ng c a các y u t môi tr ng đ n kh n ng sinh enzyme c a VSV giúp ta tìm ra môi tr ng t i u ch dùng vào vi c nuôi c y thu enzyme.
3.3.4. nh h ng c a n ng đ pH
Nuôi l c n nhi t các ch ng x khu n M3, M7, M10, M13 trong môi
tr ng đã hi u ch nh pH (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9…). Sau 4 ngày l y ra ly tâm thu
d ch enzyme thô và sinh kh i t bào, đem cân kh i l ng khô t bào và th ho t tính enzyme b ng cách đo đ ng kính vòng phân gi i. K t qu th hi n b ng sau: B ng 3.5: nh h ng c a pH đ n ho t tính cellulase c a các ch ng x khu n nghiên c u. pH Ch ng 2 3 4 5 6 7 8 9 M3 17 21 23 22 27 29 26 20 M7 19 22 28 29 22 21 14 11 M10 16 20 21 21 27 29 22 17 M13 17 19 22 25 28 29 25 19 Ho t tính enzyme: D-d n v : mm
Khãa luËn tèt nghiÖp Tr-êng §HSP Hµ Néi 2 TrÇn ThÞ Ly K32D 36 – Sinh Bi u đ 3: nh h ng c a pH đ n ho t tính cellulase c a các ch ng x khu n nghiên c u 0 5 10 15 20 25 30 35 2 3 4 5 6 7 8 9 pH D -d M3 M7 M10 M13 T b ng 3.5 và bi u đ 3, chúng tôi nh n th y n ng đ pH có nh h ng r t l n đ n kh n ng sinh tr ng c ng nh kh n ng t ng h p cellulase c a các ch ng x khu n nghiên c u. Các ch ng x khu n nghiên c u sinh t ng h p nhi u enzyme pH t 6-8, riêng ch ng M7 pH thích h p n m vào kho ng 4-5. i u này có th gi i thích nh sau: ch ng M7 phân l p đ c t đ t ru ng, ph n l n đ t tr ng lúa t nh v nh phúc đ u thu c lo i đ t chua (có
pH <7) trong quá trình phát tri n ch ng này đã thích nghi v i đi u ki n pH th p.
Khãa luËn tèt nghiÖp Tr-êng §HSP Hµ Néi 2 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
TrÇn ThÞ Ly K32D 37 – Sinh
CH NG 4
K T LU N VÀ KI N NGH 4.1. K t lu n
Trong quá trình nghiên c u chúng tôi đi đ n m t s k t lu n sau: - T các m u đ t tôi ti n hành phân l p và tuy n ch n đ c 15 ch ng x khu n sinh cellulase. Trong đó 4ch ng M3, M7, M10, M13 có kh n ng sinh
cellulase m nh nh t.
- Kh n ng sinh cellulase c a các ch ng x khu n tùy thu c theo th i gian,
ngày tu i. th i gian 48- 72h ho t tính cellulase m nh nh t.
- N ng đ pH thích h p cho x khu n phát tri n là pH trung tính. Riêng ch ng M7 thích h p v i pH= 5.
- Các ch ng x khu n nghiên c u đ u phát tri n t t trong các môi tr ng ch a ngu n cacbon t nhiên trong đó ch ng M10 và M13 có kh n ng sinh tr ng và phát tri n t t trên c 3 môi tr ng ch a 3 ngu n cacbon kh o sát.
- Trong các ngu n nit vô c chúng tôi dùng đ nghiên c u, x khu n sinh tr ng t t nh tvà ho t tính cellulase cao trong môi tr ng ch a ngu n nitrat.
4.2. Ki n ngh
Qua quá trình nghiên c u chúng tôi đ a ra m t s ki n ngh sau:
Ti p t c nghiên c u nh m đ nh lo i các ch ng x khu n có ho t tính
cellulase cao đã phân l p đ c.
Nghiên c ukh n ng phân gi i cellulase c a các ch ng x khu n đã phân l p, nghiên c u các y u t nh h ng đ n kh n ng sinh enzyme, t i u hóa môi tr ng nuôi c y.
Nghiên c u các ph ng pháp tách chi t, tinh s ch cellulase.
ng d ng cellulase vào công ngh th c ph m, ch bi n th c n gia
Khãa luËn tèt nghiÖp Tr-êng §HSP Hµ Néi 2
TrÇn ThÞ Ly K32D 38 – Sinh
TÀI LI U THAM KH O
TÀI LI U TI NG VI T
1. Ki u H u nh(1999), “Vi sinh v t h c công nghi p”, Nxb KH-KT Hà
N i, tr167-172.
2. Nguy n ThƠnh t (1982), “Ảóp ph n nghiên c u s phân b các nhóm x khu n và loài x khu n (Streptomyces) t o kh n ng sinh kháng sinh trong các m u đ t vùng ảà N i”, thông báo khoa h c