2.2.1. Ph ng pháp l y m u [3]
Trên m i lo i đ t dùng d ng c l y đ t các đ sâu 0cm, 5cm, 10cm,
15cm, 20cm, 25cm, 30cm. m i đ sâu thì l y kho ng 10g cho vào túi nilon, trên túi có ghi đ sâu l y m u, n i l y m u, lo i đ t, sau đó bu c túi l i đ
tránh bay h i n c và tránh các VSV l xâm nh p vào. M u đ t sau khi đ c thu th p c n ph i ti n hành phân l p ngay. N u ch a phân l p đ c thì ph i b o qu n m u trong t l nh nhi t đ 4-50C.
2.2.2. Ph ng pháp phơn l p x khu n t m u đ t [3]
L y 1g đ t cho vào ng nghi m ch a s n 10ml n c c t vô trùng l c đ u r i dùng pipet hút 1ml dung d ch đ t này cho sang ng nghi m có ch a s n 9ml n c c t vô trùng l c đ u thu đ c d ch đ t v i đ pha loãng 10-1 c ti p t c nh v y v i ng nghi m ti p theo ta có dung d ch đ t v i đ pha
loãng 10-2, 10-3,.... 10-10. Tùy theo m t đ phân b c a x khu n trong m u đ t mà ta ch n d ch đ t có đ pha loãng thích h p. đây tôi ch n d ch đ t có đ
pha loãng 10-5, 10-7. Dùng pipet vô trùng hút 0,5 ml dung d ch đ t có đ pha
loãng 10-5, 10-7 nh lên b m t th ch trong h p petri, l y bàn trang th y tinh trang đ u kh p b m t th ch. V i m i m u đ t các đ sâu trên c y lên 3
môi tr ng: Gause I, Czapeck-tinh b t khoáng, Czapeck. Sau đó nuôi trong t m nhi t đ 30oC, theo dõi các khu n l c x khu n m c trên b m t th ch. C y truy n nh ng khu n l c x khu n m c riêng bi t không b nhi m sang các ng th ch nghiêng có ch a môi tr ng Gause I. Các gi ng này đ c đ a vào t m và gi nhi t đ 30o
C sau 3 - 4 ngày mang ra ki m tra l i n u th y ng nghi m nào không m c ho c b nhi m thì lo i b c y truy n l i đ cu i cùng ta đ c các ng nghi m có các ch ng x khu n thu n ch ng.
Khãa luËn tèt nghiÖp Tr-êng §HSP Hµ Néi 2
TrÇn ThÞ Ly K32D 21 – Sinh
2.2.3. Ph ng pháp b o qu n ch ng gi ng [2]
Ti n hành c y truy n đ nh kì m t tháng m t l n trên môi tr ng Gause I, đ m u c y nuôi trong t m 28 - 300C t 7 - 10 ngày, sau dó gi trong t l nh nhi t đ 2- 40C. Tr c khi s d ng ph i c y truy n sang ng th ch m i.
2.2.4. Ph ng pháp quan sát hình thái x khu n
Ph ng pháp x rãnh kh i th ch: X khu n đ c r i đ u trên b m t h p petri ch a môi tr ng Gause I. Dùng dao vô trùng x hai đ ng song song gi a h p l ng, b kh i th ch gi a hai đ ng x ra ngoài. Sau đó đ t lamen vô trùng chéo theo rãnh th ch v a x . h p l ng nuôi c y trong t m 3- 5 ngày, l y lamen ra quan sát ph n x khu n m c lan gi a hai đ ng x trên kính hi n vi quang h c[1].
2.2.5. Ph ng pháp xác đinh kh n ng sinh cellulase c a x khu n
Ph ng pháp nh d ch
Nuôi l c x khu n trong môi tr ng Gause I, l c 160 vòng/phút trong 3 ngày. Sau đó li tâm 4000 vòng/phút lo i sinh kh i.
Nh 0,1 ml dich enzyme vào l th ch trong h p petri có môi tr ng ch a c ch t và th ch. h p l ng vào trong t l nh 4h, sau đó nuôi trong t
m 2 ngày. Th ho t tính b ng thu c th r i đovòng phân gi i.
Xác đ nh ho t tính cellulase b ng môi tr ng ch a 1% CMC và b t gi y, th b ng thu c th Lugol I.
Ph ng pháp c y ch m đi m
Chu n b môi tr ng th ch đ a ch a 1% CMC ho c b t gi y. Dùng que c y ch m nh vào khu n l c sau đó ch m nh m t đi m xu ng b th ch đ a. Nuôi khu n l c trong t m sau 4 ngày mang ra th ho t tính v i thu c th
Khãa luËn tèt nghiÖp Tr-êng §HSP Hµ Néi 2
TrÇn ThÞ Ly K32D 22 – Sinh
CH NG 3
K T QU NGHIÊN C U VÀ TH O LU N
3.1 Phơn l p tuy n ch n x khu n sinh cellulase t đ t
Tôi ti n hành phân l p x khu n t các lo i đ t khác nhau, m i lo i đ t tôi l y các đ sâu khác nhau (5cm, 10cm, 15cm, 20cm, 25cm, 30cm…) đem phân l p trên ba môi tr ng: Gause I, Czapeck tinh b t khoáng và Czapeck. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sau khi đã có các ch ng x khu n tôi ti n hành xác đ nh kh n ng sinh
cellulase c a các ch ng x khu n này. K t qu đ c th hi n b ng 3.1 d i đây:
B ng 3.1: Các ch ng x khu n sinh cellulase phơn l p đ c t đ t t nh V nh Phúc.
STT Tên ch ng M u đ t sâu (cm) Ho t tính cellulase (D-d/ mm)
1 M1 Mùn 15 11 2 M2 mùn 5 19 3 M3 Mùn 10 25 4 M4 Mùn 15 20 5 M5 Mùn 15 10 6 M6 Mùn 30 17 7 M7 Ru ng 15 22 8 M8 Mùn 30 17 9 M9 Mùn 20 18 10 M10 Mùn 0 27 11 M11 Mùn 15 14 12 M12 Ru ng 20 13 13 M13 Mùn 20 26 14 M14 Ru ng 10 14 15 M15 Ru ng 10 17
Khãa luËn tèt nghiÖp Tr-êng §HSP Hµ Néi 2
TrÇn ThÞ Ly K32D 23 – Sinh
Các ch ng x khu n trên ph n l n tôi phân l p đ c t đ t mùn đ
sâu 10-20cm. các t ng đ t nông hay sâu h n tôi c ng phân l p đ c m t s ch ng x khu n tuy nhiên s l ng r t ít. Có t i 11 ch ng phân l p đ c t m u đ t mùn trong khi y m u đ t ru ng ch phân l p đ c 4 ch ng. Trong 15
ch ng x khu n phân l p đ c đ u sinh cellulase, h u h t các ch ng x khu n có ho t tính cellulase khá m nh. Trong đó ch ng M10 có ho t tính cellulase
m nh nh t, ch ng M1 có ho t tính cellulase y u nh t.
Theo Nguy n Xuân Thành, đ t là môi tr ng s ng t t nh t đ i v i
VSV [6]. Trong các lo i đ t, đ t mùn là lo i đ t thích h p nh t đ i v i VSV, lo i đ t này ch a đ y đ các y u t thu n l i cho quá trình sinh tr ng c a VSV (Nhi t đ , đ m, pH, hàm l ng dinh d ng…).
t mùn có hàm l ng mùn cao, giàu dinh d ng và khoáng ch t. Mùn đ c hình thành ph n l n do quá trình phân h y tích t xác đ ng - th c v t mà ch y u là xác th c v t (thân, lá, r …). Chính vì v y trong đ t mùn hàm l ng cellulose r t d i dào. ây là m t trong nh ng ngu n cung c p cacbon ch y u c a khu h VSV đ t. t n t i đ c các VSV s d ng ngu n cacbon này ph i có kh n ng đ ng hóa cellulose, hay nói cách khác chúng
ph i có kh n ng sinh t ng h p cellulase. i u này gi i thích t i sao các ch ng x khu n phân l p đ c t đ t l i có ho t tính cellulase cao.
t ru ng có hàm l ng mùn không cao, nghèo dinh d ng. Ph n l n đ t canh tác t nh V nh Phúc thu c lo i đ t chua. M u đ t ru ng tôi dùng đ phân l p x khu n đ c l y vùng ru ng th p, s l ng x khu n phân l p đ c t lo i đ t này r t ít. Ho t tính cellulase c anh ng ch ng phân l p đ c t lo i đ t này y u h n nhi u so v i đ t mùn.
Khãa luËn tèt nghiÖp Tr-êng §HSP Hµ Néi 2 TrÇn ThÞ Ly K32D 24 – Sinh a b c d Hình 3.1: M t s hình nh v x khu n
a, b ậM t s ch ng x khu n sinh cellulase phơn l p đ c
Khãa luËn tèt nghiÖp Tr-êng §HSP Hµ Néi 2
TrÇn ThÞ Ly K32D 25 – Sinh
C n c vào k t qu thu đ c tôi đ a ra m t s k t lu n sau:
- S phân b x khu n các lo i đ t khác nhau là khác nhau.
- Cùng m t lo i đ t các đ sâu khác nhau s phân b c a x khu n
khác nhau.
- Các ch ng x khu n phân l p đ c có ho t tính cellulase khá m nh. Trong đó 4 ch ng M3, M7, M10, M13 có ho t tính cellulase m nh nh t. Tôi ch n 4 ch ng này đ ti p t c ti n hành các nghiên c u ti p
theo.
3.2. c đi m hình thái c a các ch ng x khu n nghiên c u
Tôi ti n hành nghiên c u đ c đi m hình thái c a ch ng M3, M7, M10,
M13 th y r ng trên môi tr ng Gause I:
- Ch ng M3: HSKS màu nâu, HSCC màu vàng x n, s c t tan màu vàng, th i gian xu t hi n khu n l c 24 - 48h, cu ng sinh bào t d ng th ng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Ch ng M7: HSKS màu h ng, HSCC màu đ da cam,s c t tan màu đ g ch, th i gian xu t hi n khu n l c 24-48h, cu ng sinh bào t d ng móc, xo n không hoàn toàn.
- Ch ng M10: HSKS màu xám, HSCC màu vàng x n, sinh s c t tan
vàng nh t. th i gian xu t hi n khu n l c 24 - 48h, cu ng sinh bào t d ng xo n th ng.
- Ch ng M13: HSKS màu xám, HSCC màu vàng x n, sinh s c t tan màu
tr ng đ c, th i gian xu t hi n khu n l c t 24- 48h, cu ng sinh bào t d ng l n sóng.
Khãa luËn tèt nghiÖp Tr-êng §HSP Hµ Néi 2 TrÇn ThÞ Ly K32D 26 – Sinh M7 a M3 M13 b c
Hình 3.2: hình nhkhu n l c vƠ cu ng sinh bƠo t c a ch ng x khu n nghiên c u
a- Khu n l c x khu n
Khãa luËn tèt nghiÖp Tr-êng §HSP Hµ Néi 2
TrÇn ThÞ Ly K32D 27 – Sinh
3.3. Nghiên c u nh h ng c a m t s y u t môi tr ng vƠ đi u ki n nuôi c y đ n kh n ng sinh cellulase c a các ch ng x khu n
3.3.1 nh h ng c a th i gian nuôi c y
B ng cách c y ch m đi m các ch ng x khu n M3, M7, M10, M13
trên h p petri có ch a môi tr ng 1% CMC, nuôi trong t m t 1 đ n 5
ngày, m i ngày mang m u ra th v i Lugol I. K t qu trình bày b ng sau:
B ng 3.2: nh h ng c a th i gian đ n kh n ng sinh cellulase c a các ch ng x khu n nghiên c u. Ch ng Ngày M3 M7 M10 M13 MƠu s c vòng phơn gi i 1 3 4 9 7 Tím đ m 2 10 10 14 13 Tím đ m 3 22 18 24 21 Tím nh t 4 27 21 29 27 Trong su t 5 29 25 32 28 Trong su t Ho t tính enzyme : D-d n v : mm
Khãa luËn tèt nghiÖp Tr-êng §HSP Hµ Néi 2
TrÇn ThÞ Ly K32D 28 – Sinh
Bi u đ 1: nh h ng c a th i gian nuôi c y đ n kh n ng sinh cellulase c a các ch ng x khu n nghiên c u
0 5 10 15 20 25 30 35 1 2 3 4 5 Ngày H ot tí nh c el lu las e ( D -d ) M3 M7 M10 M13 T b ng 3.2 và bi u đ 1 tôi nh n th y th i gian có nh h ng r t l n đ n kh n ng sinh cellulase c a các ch ng x khu n, l ng cellulasethu đ c nhi u nh t là vào th i đi m 48- 72h nuôi c y.
Khãa luËn tèt nghiÖp Tr-êng §HSP Hµ Néi 2
TrÇn ThÞ Ly K32D 29 – Sinh
M10-1 M10-2
M10-3 M10-4
M10-5
Hình 3.3: nh h ng c a th i gian nuôi c y đ n ho t tính cellulase c a ch ng M10.
Khãa luËn tèt nghiÖp Tr-êng §HSP Hµ Néi 2
TrÇn ThÞ Ly K32D 30 – Sinh
Màu s c c a vòng phân gi i bi n đ i t tím đ m sang tím nh t r i
cu i cùng chuy n sang trong su t. i u này có th gi i thích nh sau: ngày (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
th nh t sau khi c y ch ng x khu n lên môi tr ng th ch đ a ch a ngu n
cacbon là CMC. Các ch ng x khu n này bám dính trên b m t th ch (giai
đo n ti m phát) chúng b t đ u sinh t ng h p cellulase . Các enzyme này
khu ch tán trong môi tr ng, phân gi i cellulose thành các oligosaccharide
thu n ng l ng cung c p cho quá trình sinh tr ng. Khi nhu m màu Lugol I
các oligosacharit này b t màu nên vòng phân gi i có màu tím đ m. Sang ngày
th 2-3 các ch ng x khu n phân chia nhanh chóng nh m t ng sinh t bào (giai đo n logarid). Quá trình này đòi h i c n cung c p m t l ng l n ch t dinh d ng, trong khi đó ch t dinh d ng ta đ a vào là c đ nh. Khi môi tr ng nghèo dinh d ng, ngu n n ng l ng thu t vi c oxi hóa cellulose thành oligosaccharide không đ cung c p cho quá trình phát tri n, chúng b t đ u sinh t ng h p enzyme phân gi i oligosaccharide thành glucose. D n d n l ng cellulose trong môi tr ng b phân h y hoàn toàn, ngu n dinh d ng c n ki t, qu n th x khu n b c vào giai đo n suy vong suy vong, vòng phân gi i trong su t, ít t ng v khích th c. Tuy nhiên các enzyme v n có m t trong môi tr ng nuôi c y.
Vi c nghiên c u tác đ ng c a th i gian đ n kh n ng sinh cellulase
c a các ch ng x khu n đem l i nh ng hi u bi t v quá trình phát tri n c a x khu n nói chung và kh n ng sinh enzyme c a các ch ng x khu n t ng th i kì sinh tr ng nói riêng. Ng i ta có th nghiên c u đ ng thái sinh tr ng, đ ng thái sinh enzyme đ bi t đ c th i đi m nào thu đ c nhi u
enzyme nh t t đó thi t l p m t dây truy n s n xu t hoàn ch nh sao cho phù h p nh t đem l i l i nhu n kinh t cao.
Khãa luËn tèt nghiÖp Tr-êng §HSP Hµ Néi 2
TrÇn ThÞ Ly K32D 31 – Sinh
3.3.2. nh h ng c a ngu n cacbon
Cacbon là m t trong nh ng ngu n dinh d ng không th thi u đ i v i đ i s ng c a b t kì loài sinh v t nào, ngu n cacbon này t n t i nhi u d ng khác nhau t các h p ch t vô c đ n gi n (CO2) đ ncác h p ch t vô c ph c t p ( ng, các polisaccharide…). Cellulose là ngu n cacbon ch y u trong t nhiên, l ng cellulose này ph n l n t rác th i (thân, lá, r th c v t, rác th i công nghi p…). đ ng hóa đ c l ng cellulose kh ng l này đòi h i các ch ng x khu n nói riêng và các VSV nói chung ph i có kh n ng t ng h p cellulase.
S phát tri n c a công ngh sinh h c. Ng i ta b t đ u ngh đ n vi c t n d ng ngu n cellulose trong ph th i (bã ngô, bã đ u, bã mía, v l c, v tr u…) đ s n xu t các lo i th c n cho gia súc. ây là m t ngu n ph th i nông nghi p khá d i dào h u nh ch a đ c t n d ng. tìm ra ch ng x khu n có ho t tính cellulase m nh khi sinh tr ng trên các môi tr ng có ngu n cacbon này, tôi ti n hành nuôi c y 4 ch ng x khu n M3, M7, M10, M13 trong các môi tr ng ch a ngu n cacbon t nhiên là lõi ngô, v l c , v tr u t đó tìm ra ch ngcó ho t tính cellulase cao ng d ng vào đ i s ng s n xu t.
Tôi ti n hành c y các ch ng x khu n M3, M7, M10, M13 l n l t trong các môi tr ng l ng ch a lõi ngô, v l c, v tr u. Nuôi l c n nhi t (30o
C, 160v/p) trong 4 ngày r i li tâm thu l ng enzyme thô, đem