Xác định nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư thanh long ở Hà Nội và vùng phụ cận

Bài viết xác định các loài Colletotrichum spp. Gây bệnh thán thư trên thanh long được thu thập tại một số địa điểm thuộc miền Bắc của Việt Nam dựa vào đặc điểm hình thái và trình tự gene vùng rDNA-ITS, nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và tính gây bệnh của Colletotrichum spp.

Kết nghiên cứu khoa học BVTV - Sè 4/2018 XÁC ĐỊNH NẤM Colletotrichum spp GÂY BỆNH THÁN THƢ THANH LONG Ở HÀ NỘI VÀ VÙNG PHỤ CẬN Identification of Colletotrichum spp Causing Anthracnose of Hylocereus undatus in Ha Noi and Surrounding Areas 1 Nguyễn Đức Huy *, Vƣơng Anh Phƣơng Trần Thị Thanh Bình Ngày nhân bài: 20.07.2018 Ngày chấp nhận: 17.08.2018 Abstract In this study, five samples like anthracnose symptom were collected from stems and fruits of Hylocereus undatus in Hanoi and surrounding areas Based on morphological and molecular characteristics, the pathogen was identified as Colletotrichum truncatum infected fruits and Colletotrichum spp infected stems of H undatus Further studies were focused on C truncatum and showed that the fungus was grown faster at to °C than at o 15, 20, 35 and 40 C with average colony diameter of 70,7 mm after days cultured on PDA Pathogenicity test revealed that C truncatum could infect several ripe fruits including banana, soybean, fruits and stems of H undatus and chili This research improves the comprehension of Colletotrichum species causing anthracnose of H undatus and supports useful information for effective control of anthracnose Keywords: Anthracnose, Hylocereus undatus, Colletotrichum, morphological and molecular characteristics, Ha Noi ĐẶT VẤN ĐỀ * Thanh long (Hylocereus undatus c tr ng ph biến nhi u nước giới v c c nước Đông Nam Á Th i Lan, Đ i Loan, Malaysia v Vi t Nam Ngo i ra, long c ng c tr ng nhi u Trung Quốc Ở Vi t Nam, long l c gi trị xuất cao v c tr ng ch yếu Bình Thu n, Long An v Ti n Giang Hi n nay, long c tr ng nhi u t nh mi n Bắc H N i Ba Vì, Th ch Thất , Ph Thọ, Quảng Ninh, H a Bình v Ninh Bình B nh h i l m t mối lo ng i ối với sản xuất long c a nhi u nước giới c Vi t Nam M t b nh nấm h i long i n hình v kh ph ng tr l b nh ốm nâu hay nhi u t i li u gọi l b nh loét c nh v stem canker Chuang et al., 2012; Sanahuja et al., 2016) B nh th n thư gây h i c nh v long c ghi nh n, công bố m t số nước Trung Quốc Guo et al , v Malaysia Vijiya et al., 2014) Vết b nh c hình elip, b mặt vết b nh lõm, xuất hi n nhi u ĩa c nh v b o t phân B môn B nh cây, Khoa Nông học, Học vi n Nông nghi p Vi t Nam Đ i học Lâm nghi p Email: ndhuy@vnua.edu.vn 48 sinh Nấm gây b nh c x c ịnh l Colletotrichum truncatum c b o t phân sinh hình cong lưỡi li m, hai u nhọn, c giọt d u b o t Nấm C truncatum tên ng nghĩa C capcisi l m t t c nhân gây b nh th c v t c ph ký ch r ng bao g m h tiêu, c , dưa lê, u xanh, nho v nhi u lo i tr ng kh c Ngo i ra, nấm C truncatum c ng c ph t hi n gây b nh th n thư c chua Diao et al , với vết b nh hình tr n, b mặt lõm v xuất hi n nhi u chấm en nhỏ b mặt v b nh th n thư cải He el al , B nh th n thư h i long c ng c Vi n ăn Mi n Nam x c ịnh l nấm C gloeosporioides T i H N i v m t số t nh mi n Bắc, long c tr ng với di n t ch tương ối lớn năm g y ây Tuy nhiên, chưa c ph t hi n v ghi nh n v b nh th n thư long c công bố c c t p ch quốc gia hay quốc tế T i Vi t Nam, c c nghiên cứu i sâu v o nấm gây b nh th n thư c n t v chưa c ph t hi n v b nh t i mi n Bắc c a Vi t Nam Vì v y, mục tiêu c a nghiên cứu n y nhằm i x c ịnh c c lo i Colletotrichum gây b nh th n thư long c thu th p t i m t số ịa i m thu c mi n Bắc c a Vi t Nam d a v o ặc i m hình th i v trình t gene vùng rDNA-ITS v ii nghiên cứu Kết nghiên cứu khoa học BVTV - Sè 4/2018 m t số ặc i m sinh học v t nh gây b nh c a Colletotrichum sp VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 Mẫu bệnh Mẫu thân v b nh th n thư Thất H N i v long long Th c nh long c tri u chứng c thu th p t i Ba Vì, Th ch Quảng Ninh Hai mẫu th n thư c thu th p t i c a h ng b n i Bình v Gia Lâm H N i 2.2 Phân lập xác định nấm gây bệnh Nấm gây b nh th n thư long c phân l p tr c tiếp t vết b nh kỹ thu t cấy ơn b o t v cấy tr c tiếp vết b nh lên môi trường PDA Sau cấy chuy n nh sinh trưởng c a s i nấm sang môi trường PDA v c x c ịnh sơ b d a ặc i m c a b o t phân sinh, ĩa c nh môi trường PDA Sau , nguyên nhân gây b nh c x c ịnh d a trình t vùng gene rDNA-ITS 2.3 PCR ITS iải trìn tự ene vùn rDNA- Mẫu nấm gây b nh th n thư trên c nh v long sau phân l p thu n c nuôi cấy môi trường nhân t o PDA ng y o 8-30 C mg s i nấm c thu chiết DNA theo phương ph p CTAB Cetyltrimethyl ammonium bromide c a Doyle Doyle To n b vùng vùng ITS c a mẫu nấm c khuếch i cặp m i ITS v ITS White et al., 1990) Phản ứng PCR c th c hi n với x PCR Master mix Solution (i-Taq c a INtRON, o nhi t gắn m i C Sản phẩm PCR c tinh chiết t agarose gel , % dùng k t tinh chiết thương m i c a h ng NORGEN theo hướng dẫn c a nh sản xuất Sản phẩm PCR c giải trình t tr c tiếp m t chi u dùng m i ITS t i h ng Macrogen H n Quốc Trình t ITS c a mẫu th nghi m c so với chuỗi sẵn c GenBank ph n m m tr c tuyến BLAST t i NCBI the National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) x c ịnh tên nấm gây b nh Tiếp theo, phả h v mối quan h c c chuỗi nucleotide c xây d ng phương ph p Neighbor-Joining Saitou v Nei, sẵn c ph n m m MEGA 7.0 (Kumar et al., 2016) 2.4 Đặc điểm hình thái sinh học - Đặc điểm hình thái Ngu n nấm thu n c o cấy môi trường PDA nhi t -27 C, quan s t s ph t tri n c a tản nấm, s hình th nh ĩa c nh v b o t phân sinh sau c c ng y nuôi cấy - Đặc điểm sinh học khảo s t s ảnh hưởng c a nhi t ến s ph t tri n c a nấm môi trường PDA Theo , ngu n nấm thu n c nuôi cấy môi trường PDA với l n nhắc l i, l n nhắc l i l ĩa Petri ường k nh mm Th nghi m c th c hi n , , , , o v C t ịnh ôn BIOBASE Ngo i ra, s nảy m m v hình th nh ĩa p c a nấm gây b nh th n thư c ng c nghiên cứu 2.5 Tính gây bệnh Đ nh gi t nh gây b nh c a nấm th n thư, c c lo i ch n chuối, ớt, long, c chua, u tương v c nh long c s dụng lo i c lặp l i t ba c nh ối với long T o vết thương c ch ục lỗ nhỏ tùy lo i với k ch thức , – 0,3 mm nhỏ dịch b o t , tr u tương c lây s t thương c ch châm kim Dịch b o t với m t b o t /ml c ếm bu ng ếm h ng c u c s dụng lây b nh Th nghi m c o th c hi n -27 C Theo dõi thời kỳ ti m dục, s hình th nh c a b nh sau c c ng y lây nhiễm Tỷ l b nh c t nh theo công thức: Số bị b nh TLB (%) = × Số lây b nh KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Thu thập, phân lập xác định tác nhân gây bệnh Nghiên cứu n y thu th p c ba mẫu th n thư thân, c nh long v hai mẫu th n thư long C c tri u chứng c a b nh th n thư c quan s t thấy thân/c nh v long Tri u chứng thân l c c ốm b u dục c m u nâu v ng, b mặt vết b nh lõm v c nhi u chấm nhỏ m u cam hình a Vết b nh hình tr n, k ch thước , - , cm, b mặt vết b nh lõm v c nhi u chấm en nhỏ hình c 49 Kết nghiên cứu khoa học Hình Triệu chứng bệnh thán thƣ long a) tri u trứng c nh, c tri u chứng quả, b b o t phân sinh nấm Colletotrichum spp quan s t c t ch t tri u chứng c nh long v d b o t phân sinh nấm Colletotrichum spp long D a v o ặc i m hình th i c a b o t phân sinh hình b u dục, c hai giọt d u hình b phân l p t c nh long t i Ba Vì v hình cong lưỡi li m, c m t giọt d u hình d phân l p long thu th p t i c a h ng b n long Gia Lâm, H N i Bước u d a v o ặc i m hình th i c a b o t phân sinh, nấm gây b nh th n thư c nh long c th l nấm Colletotrichum gloesporioides v long l nấm C truncatum gây Tuy nhiên, x c ịnh ch nh x c lo i Colletotrichum, kỹ thu t PCR v giải trình t gene c p dụng ối với hai mẫu nấm n y BVTV - Sè 4/2018 Hình Phản ứng PCR khuếch đại vùng rDNA-ITS hai mẫu nấm thán thƣ thân (phải) (trái) long Kích thƣớc sản phẩm PCR khoảng 600 bp Kết giải trình t m t chi u sản phẩm PCR vùng rDNA-ITS s dụng m i ITS cho thấy mẫu th n thư c nh long TLBV-Thân thu c phức h p lo i g m C siamense, C gloeosporioides v Colletotrichum sp hình Đ phân bi t t ng lo i phức h p n y c n d a vùng gene ApMat Sharma et al., 2013) Ngo i ra, trình t gene mẫu th n thư long TLHN-Quả thu c cụm C truncatum với mức tương ng l , % Theo nghiên cứu c a Shivaprakash et al., (2011) vùng rDNA-ITS phân bi t C truncatum với c c Colletotrichum kh c Như v y, c c nghiên cứu t p trung v o C truncatum gây b nh th n thư long 3.2 Xác định nấm gây bệnh thán thƣ long dựa vào trình tự vùng rDNA-ITS DNA c a hai mẫu nấm Colletotrichum gây b nh th n thư c nh v long c t ch chiết t s i nấm nuôi môi trường PDA sau ng y Sản phẩm PCR khuếch i vùng rDNA-ITS cặp m i ITS v ITS c k ch thước khoảng bp hình Băng sản phẩm PCR rõ nét v khơng xuất hi n băng phụ 50 Hìn Câ p ả ệ đƣợc xâ dựn bằn p ƣơn p áp Neighbor-Joining MEGA 7.0 Kết nghiên cứu khoa học Gi trị c c nốt c a phả h l gi trị thống kê bootstrap d ng % l n lặp Thanh bar th hi n khoảng c ch di truy n 3.3 Đặc điểm hình thái sinh học tính gây bệnh nấm Colletotrichum truncatum BVTV - Sè 4/2018 Nấm C truncatum c nuôi cấy môi trường PDA v theo dõi s ph t tri n, ặc i m tản nấm, b o t phân sinh v hình th nh ĩa c nh bảng , hình c-i) Bảng Đặc điểm hình thái nấm Colletotrichum truncatum Ng y sau cấy 10 12 14 Đặc i m hình th i Tản nấm B o t phân sinh, ĩa c nh Đường k nh tản nấm 3, mm, tản nấm Chưa xuất hi n b o t phân sinh, ĩa c nh x m, xốp Đường k nh tản nấm , mm, tản nấm trắng x m, d y, c c c chấm en nhỏ Chưa xuất hi n b o t phân sinh, ĩa c nh mọc v ng tr n ng tâm hình f Đường k nh tản nấm 8, mm, tản nấm x m, xốp, c c c chấm en nhỏ mọc Chưa xuất hi n b o t phân sinh, ĩa c nh v ng tr n ng tâm Đường k nh tản nấm ,6 mm, tản nấm x m, xốp, nhi u chấm en mọc ki u Chưa xuất hi n b o t phân sinh, ĩa c nh v ng tr n ng tâm Đường k nh tản nấm , mm, tản nấm Xuất hi n b o t phân sinh, m t b o t t, x m, xốp, nhi u chấm en nhỏ mọc ơn b o, không m u, cong lưỡi li m, c m t v ng tr n ng tâm giọt d u Đường k nh tản nấm , mm, tản nấm Mất b o t phân sinh nhi u, không m u, m u x m, xốp, nhi u chấm en mọc ơn b o, cong lưỡi li m, giọt d u v ng tr n ng tâm hình g Xuất hi n ĩa c nh hình c , mọc ơn l t p Đường k nh tản nấm mm, tản nấm trung th nh m, c c c lông gai m u en, thưa, m u x m, xốp, nhi u v ng tr n ng tâm phân ốt v d i, b o t phân sinh nhi u v k ch với c c chấm en nhỏ c hình th nh thước – µm x , -3, µm hình h-i) Nhi t l m t yếu tố môi trường c ảnh hưởng tr c tiếp ến s nảy m m c a b o t phân sinh, xâm nh p, ph t tri n v gây b nh c a c c lo i nấm gây b nh Nghiên cứu n y th nghi m s ph t tri n c a nấm C o truncatum c c nhi t – 40 C, th nghi m c th c hi n mơi trường PDA bảng Hình Triệu chứng đặc điểm hình thái nấm Colletotrichum truncatum gây bệnh long Tri u chứng b nh th n thư thân a , b , ĩa c nh c , ĩa p d , tản nấm môi trường PDA f v b o t phân sinh g-i) 51 Kết nghiên cứu khoa học BVTV - Sè 4/2018 mm Nấm C truncatum c ng ph t tri n c o 35-40 C ch m bảng Nấm ph t o tri n ch m c c nhi t v C, sau 12 ng y nuôi cấy ường k nh ch t ,3 v , mm Như v y, qu trình bảo quản long c n lưu ý giữ l nh tr nh s gây h i c a b nh th n thư long c ng chất lư ng c a long Bảng Đánh giá tính gây bệnh nấm Colletotrichum truncatum Hình Sự nảy mầm bào tử phân sinh nấm Colletotrichum truncatum Số Số c nh/quả c nh/quả bị nhiễm lây b nh 9 100 6 100 Chuối 66,7 C chua 10 10 100 Đ u tương 10 10 100 Ớt 10 10 100 Lo i C nh Th nghi m s nảy m m c a b o t phân sinh nấm C truncatum cho thấy b o t phân sinh nảy m m sau giọt nước cất vô trùng v sau ống m m bắt u ph t tri n d i Tỷ l nảy m m c a b o t phân sinh t % o nhi t ph ng – 27 C Khi cấy ơn b o t môi trường WA, sau ĩa p c hình th nh s i nấm, ĩa p c hình van, m u nâu nâu m hình d Bảng Ảnh hƣởng nhiệt độ đến phát triển Colletotrichum truncatum Nhi t o ( C) 15 20 25 30 35 40 Đường k nh tản nấm sau c c ng y nuôi cấy (mm) 10 12 8,7 17,7 23,3 29,3 35,7 44,3 15,7 33,3 54,6 70,7 80,3 90,0 22,3 35,7 56,3 75,0 90,0 90,0 15,7 36,0 58,3 78,0 90,0 90,0 10,7 15,3 20,7 25,3 36,7 45,3 7,7 13,7 19,7 24,7 32,3 40,7 Nhi t c ảnh hưởng lớn ến s ph t tri n o c a nấm C truncatum Ở nhi t C, nấm ph t tri n ch m Sau ng y nuôi cấy, ường k nh tản nấm l ,3 mm bảng Nấm o ph t tri n nhanh d n nhi t C v ph t o tri n tốt -30 C Sau ng y nuôi cấy môi trường PDA, ường k nh tản nấm l 52 long Quả long Tỷ l (%) Kết lây b nh nhân t o c c ch n chuối, u tương, c nh long, long, c chua v ớt cho thấy thời kỳ ti m dục c a nấm l ng y Vết b nh th hi n rõ long, vết b nh tr n, b mặt lõm v s i nấm trắng ph t tri n b mặt vết b nh hình 6b Vết b nh ớt v c chua c ng i n hình, b mặt lõm v c nhi u chấm en ĩa c nh hình th nh b mặt vết b nh hình 6c Trên chuối v u tương vết b nh nhỏ, khơng i n hình v chưa quan s t thấy ĩa c nh c a nấm gây b nh Đĩa c nh v o b o t phân sinh c a nấm C truncatum c hình th nh nhi u lây thân/c nh long tri u chứng b nh không i n tri u chứng b nh long Như v y, thân long c th c s dụng l m v t li u t o số lư ng lớn b o t phân sinh nấm C truncatum phục vụ cho c c nghiên cứu chuyên sâu t nh gây b nh, nảy m m c a b o t Kết nghiên cứu khoa học BVTV - Sè 4/2018 Hình Triệu chứng lây bệnh nhân tạo sử dung nấm Colletotrichum truncatum a c nh long, b long, c ớt, d chuối, e c chua v f u tương KẾT LUẬN Tri u chứng b nh th n thư long c x c ịnh l nấm Colletotrichum truncatum v c nh long l Colletotrichum spp Nấm C truncatum ph t tri n, nảy m m v gây b nh tốt o nhi t 5-30 C Những nghiên cứu nhằm x c ịnh lo i Colletotrichum gây b nh th n thư thân long phức h p lo i C siamense, C gloeosporioides v Colletotrichum sp Nghiên cứu n y cung cấp thông tin v th nh ph n lo i c a Colletotrichum gây b nh th n thư long v l sở ưa chiến lư c ph ng tr b nh c hi u TÀI LIỆU THAM KHẢO Chuang, M.F., Ni, H.F., Yang, H.R., Shu, S.L., Lai, S.Y and Jiang, Y.L 2012 First Report of Stem Canker Disease of Pitaya (Hylocereus undatus and H polyrhizus) Caused by Neoscytalidium dimidiatum in Taiwan Plant Disease: 96 (6), p.906 Diao, Y.Z., Zhang, C., Lin, D and Liu, X.L (2014) First Report of Colletotrichum truncatum Causing Anthracnose of Tomato in China Plant Disease: 98(5), p.687 Doyle J.J and Doyle J.L.,1990 A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue Phytochem Bull.: 19, pp.11–15 Guo, L.W., Wu, Y.X., Ho, H.H., Su, Y.Y., Mao, Z.C., He, P.F and He, Y.Q , 2014 First Report of Dragon Fruit (Hylocereus undatus) Anthracnose Caused by Colletotrichum truncatum in China Journal of Phytopathology: 162 (4), pp 272-275 He, Y., Chen, Q., Shu, C., Yang, M and Zhou, E., 2016 Colletotrichum truncatum, a new cause of anthracnose on Chinese flowering cabbage (Brassica parachinensis) in China Tropical Plant Pathology: 41(3), pp.183-192 Kumar S., Stecher G., and Tamura K., 2016 MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 7.0 for bigger datasets Molecular Biology and Evolution 33: pp.1870-1874 Sanahuja, G., Lopez, P., and Palmateer, A.J., 2016 First Report of Neoscytalidium dimidiatum Causing Stem and Fruit Canker of Hylocereus undatus in Florida Plant Disease: 100 (7), p.1499 Saitou N and Nei M., 1987 The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees Molecular Biology and Evolution: 4, pp.406-425 Vijaya, S.I., Anuar, I.S.M and Zakaria, L., 2015 Characterization and Pathogenicity of Colletotrichum truncatum Causing Stem Anthracnose of Red‐Fleshed Dragon Fruit (Hylocereus polyrhizus) in Malaysia Journal of Phytopathology: 163 (1), pp.67-71 Phản biện: TS Hà Minh Thanh 53 ... (2011) vùng rDNA-ITS phân bi t C truncatum với c c Colletotrichum kh c Như v y, c c nghiên cứu t p trung v o C truncatum gây b nh th n thư long 3.2 Xác định nấm gây bệnh thán thƣ long dựa vào trình... hình th nh ĩa p c a nấm gây b nh th n thư c ng c nghiên cứu 2.5 Tính gây bệnh Đ nh gi t nh gây b nh c a nấm th n thư, c c lo i ch n chuối, ớt, long, c chua, u tương v c nh long c s dụng lo i c... thập, phân lập xác định tác nhân gây bệnh Nghiên cứu n y thu th p c ba mẫu th n thư thân, c nh long v hai mẫu th n thư long C c tri u chứng c a b nh th n thư c quan s t thấy thân/c nh v long Tri u