Nghiên cứu này đã tìm hiểu sự có mặt của PPV1 ở nhóm lợn giai đoạn nuôi thịt tại Hà Nội và vùng phụ cận bằng phản ứng huyết thanh học, PCR và phân tích trình tự gen. Kết quả cho thấy 88,2% (60/68) mẫu huyết thanh có kháng thể kháng PPV1, với 18/60 mẫu có kháng thể ở mức cao (HI >1/512).
Vietnam J Agri Sci 2020, Vol 18, No 7: 495-503 Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 2020, 18(7): 495-503 www.vnua.edu.vn SỰ HIỆN DIỆN CỦA PORCINE PARVOVIRUS (PPV1) Ở LỢN NUÔI TẠI HÀ NỘI VÀ VÙNG PHỤ CẬN Nguyễn Văn Giáp, Mai Thị Ngân, Lê Văn Trường, Vũ Thị Ngọc, Võ Văn Hiểu, Tạ Thị Kim Chung, Vũ Đức Hạnh, Huỳnh Thị Mỹ Lệ* Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam * Tác giả liên hệ: huynhtmle@vnua.edu.vn Ngày chấp nhận đăng: 24.06.2020 Ngày nhận bài: 19.05.2020 TÓM TẮT Porcine Parvovirus (PPV1) nguyên nhân gây rối loạn sinh sản lợn nái yếu tố kích hoạt chế sinh bệnh Porcine circovirus type Ở Việt Nam, diện vai trò gây rối loạn sinh sản PPV1 chứng minh, cơng bố PPV1 Nghiên cứu tìm hiểu có mặt PPV1 nhóm lợn giai đoạn nuôi thịt Hà Nội vùng phụ cận phản ứng huyết học, PCR phân tích trình tự gen Kết cho thấy 88,2% (60/68) mẫu huyết có kháng thể kháng PPV1, với 18/60 mẫu có kháng thể mức cao (HI >1/512) Hiện tượng virus huyết phổ biến phát 10/18 mẫu, với đặc điểm không phụ thuộc vào hàm lượng kháng thể kháng PPV1 Kết giải mã phần gen NS1 cho biết 10 chủng PPV1 Việt Nam thuộc nhóm di truyền Cùng với nghiên cứu khác, kết cho thấy lưu hành PPV1 lợn ni Việt Nam Từ khóa: Porcine Parvovirus 1, phát virus, đặc điểm sinh học phân tử Investigating the Presence of Porcine Parvovirus (PPV1) in Pigs in Hanoi and Neighboring Provinces ABSTRACT Porcine Parvovirus (PPV1) is one of the main pathogens inducing reproductive failure in sows PPV1 is also known as a triggering factor of porcine circovirus type In Vietnam, the presence of PPV1 and its association with reproductive disorders of sows had been confirmed However, few publications are available on this topic This study investigated the occurrence of PPV1 in growing pigs risen in Hanoi and neighboring provinces by serology test, PCR and genetic analysis It was revealed that 88.2% (60/68) sera contained detectable antibodies against PPV1 Of these, 18/60 sera had high antibody titres (HI >1/512) The viremia was detected at a high frequency (10 out of 18 tested sera) and was uncorrelated with the level of antibody titers against PPV1 The genetic analysis based on the partial NS1- protein-coding gene showed that 10 PPV1 field strains were within genogroup In combination with the other studies, the current result supported that PPV1 is circulating in pigs in Vietnam Keywords: Porcine Parvovirus 1, virus detection, molecular characterization ĐẶT VẤN ĐỀ Røi loän sinh sân Ċ lợn nhiều nguyên nhån gåy ra, đò nhòm virus gåy bệnh thāĈng gặp g÷m: Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), Classical swine fever virus (CSFV), Porcine parvovirus (PPV1), Porcine circovirus type (PCV2), Porcine pseudorabies virus (PRV), (Pozzi & Alborali, 2012) PPV1 mût nhąng mæm bệnh gây røi loọn sinh sõn ó c bit n t rỗt sm (Mayr & cs., 1968) Ngày nay, PPV1 đāợc biết đến nhā mût yếu tø kích hột sinh bnh hừc cỵa hỷi chng cũi cừc ln sau cai sąa PCV2 gây (Ellis & cs., 2000) Về phân lội, PPV1 thủc hõ Parvoviridae, mût ADN virus sợi đćn dài khoâng 5kb (Ranz & cs., 1989) Đến nay, ngāĈi ta phát 495 Sự diện Porcine Parvovirus (PPV1) lợn nuôi Hà Nội vùng phụ cận thêm mût sø loäi parvovirus mĉi Ċ lợn, ký hiệu tĂ PPV2 đến PPV7 Khác vĉi PPV1 (thủc giøng Protoparvovirus), lội parvovirus phát vđng 10 nëm trĊ läi đåy thủc giøng Tetraparvovirus (PPV2- PPV3), Copiparvovirus (PPV4- PPV6) Chapparvovirus (PPV7) (Cadar & cs., 2012; Xing & cs., 2018) V cỗu trỳc, bû gen PPV1 cị khung đõc mĊ (ORF) mó húa cho protein phi cỗu trỳc NS1 v protein cỗu trỳc (VP1 v VP2) (Ranz & cs., 1989; Bergeron & cs., 1993) Gen mó hũa NS1 thng bõo thỵ hn cũ tức ỷ ỷt bin thỗp hn khoõng 10 lổn so vi gen mó húa protein cỗu trỳc (Ren & cs., 2013) Trong nghiên cău đặc điểm sinh hõc phân tĄ xây dĆng phát sinh chỵng loọi, cỏc tỏc giõ trờn th gii cú thể dùng toàn bû genome (Oh & cs., 2017), vùng gen mã hóa protein (Ren & cs., 2013) gen mã hóa VP2 và/hoặc NS1 (Hao & cs., 2011) Theo đò, PPV1 đāợc phân chia thành (Ren & cs., 2013) nhóm di truyền (Hao & cs., 2011) Vit Nam, vai trũ gõy bnh cỵa PPV1 ó đāợc biết đến sĉm, tĂ nhąng nëm 1990 (H÷ Đình Chýc & cs., 1995) Trong mût thĈi gian dài, cỏc vỗn liờn quan ti PPV1 ớt c quan tâm nghiên cău Gæn đåy, kết quâ khâo sát sĆ lu hnh cỵa cỏc genotype parvovirus khu vc Trung tip tc khợng nh s hin din cỵa genotype (PPV1) Ċ lợn vĉi tỷ lệ phát virus 52,7% (Nguyen Tran Trung & cs., 2019) Nhìm làm rụ hn v s lu hnh cỵa PPV1 ln nuôi täi Việt Nam, nghiên cău đāợc thĆc hin nhỡm xỏc nh s cú mt cỵa PPV1 đàn lợn nuôi täi Hà Nûi vùng phĀ cên nuôi vĉi quy mô >100 ≤100 lợn thðt Trong nởm 2017, ó cũ 68 mộu huyt c lỗy Ċ 21 trang träi thuûc đða phāćng Hà Nûi, Hāng n, Hâi Dāćng, Bíc Ninh, Hịa Bình Vùnh Phýc - Chỵng PPV1 thuổn khit, vụ hoọt c cung cỗp bi Bỷ mụn Vi sinh vờt - Truyn nhiễm, Khoa Thú y, Hõc viện Nông nghiệp Việt Nam - H÷ng cỉu chủt lang 10% 1% pha dung dðch PBS1x - Đïa nhĆa 96 giếng đáy chą V - M÷i phát PPV1 giâi mã gen đāợc chõn theo nghiên cău trāĉc đåy (Xu & cs., 2012) Trình tĆ 5’-3’ nhā sau: PPVF-AGTTAGAAT AGGATGCGAGGAA PPVR-AGAGTCTGT T GGTGTATTTATTGG - Húa chỗt dựng tỏch chit ADN tựng sø g÷m: dung dðch ly giâi méu có chăa 27% sucrose, 15mM trisodium citrate, 0,15M sodium chloride, 1mM ethylene diaminetetraacetic acid, 1% sodium dodecyl sulphate, 200 µg/ml proteinase K; phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1); isopropyl; c÷n 70% đệm TE (pH = 8) - Kít PCR (Maxime PCR PreMix i-Taq, 25025, iNtRON, Hn Quức) - Húa chỗt dựng phõn tớch sõn phốm PCR g÷m: agarose (Agarose EP Master, Biosesang, Hàn Qùc); RedSafe Nucleic Acid Staining Solution (21141, iNtRON, Hàn Quøc) 100bp DNA ladder (DM001-R500, GeneDireX Inc., Anh) 2.3 Phương pháp nghiên cứu PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Phát kháng thể kháng PPV1 2.1 Nội dung nghiên cứu SĆ có mt cỵa khỏng th khỏng PPV1 huyt ln đāợc phát bìng phân ăng ngën trĊ ngāng kết h÷ng cỉu (HI), thĆc theo mơ tâ trāĉc đåy (Joo & cs., 1976), sĄ dĀng h÷ng cỉu chủt lang 1% vĉi mût sø hiệu chỵnh CĀ thể, để lội bó yếu tø gåy ngāng kết h÷ng cỉu, tiến hnh ỵ huyt xột nghim vi hững cổu chuỷt lang 10% theo tỷ lệ 1:1, để qua đêm Ċ 4C Méu đāợc coi chuyển dāćng tính huyết hõc (dāćng tính) Ċ đû pha - Xác đðnh s cú mt cỵa khỏng th khỏng PPV1 v PPV1 méu huyết lợn thðt - Tìm hiểu đặc điểm sinh hõc phân tĄ gen mã hóa protein NS1 cỵa cỏc chỵng PPV1 2.2 Vt liu - Huyt cỵa ln tht giai oọn 40 n 80 ngy tuựi Mộu c lỗy cỏc hỷ chởn 496 Nguyn Văn Giáp, Mai Thị Ngân, Lê Văn Trường, Vũ Thị Ngọc, Võ Văn Hiểu, Tạ Thị Kim Chung, Vũ Đức Hạnh, Huỳnh Thị Mỹ Lệ lỗng >1/8 ngën trĊ hồn tồn tāợng ngāng kết h÷ng cỉu (Oravainen & cs., 2005) Cÿng theo nghiên cău trāĉc đåy, hiệu giá HI 1/512 đāợc chõn làm møc để xác đðnh méu có hiệu giá kháng thể Ċ măc cao (HI >1/512) mc thỗp (1/16 HI 1/512) (Oravainen & cs., 2005) 2.3.2 Tách chiết ADN (i) Ly giâi méu: 250µl huyễn dðch méu bệnh phèm đāợc trûn 500µl dung dch sucrose/proteinase K; ỵ 56C/90 phỳt (ii) Tỏch pha ADN bìng phenol-chloroform-isoamyl (25:24:1) bìng cách bù sung 200µl dung dðch PCI vào øng méu sau ly giâi, vortex hún hợp ly tâm 12.000 vòng/phút/15 phút, Ċ nhiệt ỷ 4C (iii) Tỵa ADN: dựng ứng Eppendorf mi, trỷn 450μl isopropyl 450μl dðch nùi phía trên, trûn đều; sau ũ tỵa ADN -20C/15 phỳt; thu tỵa bỡng ly tâm, 12.000 vòng/phút/15 phút, Ċ nhiệt đû 4C (iv) Ra tỵa ADN bỡng 1ml cữn 70%; thu tỵa bỡng ly tâm, 12.000 vòng/phút/15 phút, Ċ nhiệt đû 4C; sau đị lội bó hết c÷n hong khơ Ċ nhiệt ỷ phũng 15 phỳt (v) Hũa tan tỵa ADN 30µl đệm TE (pH = 8,0) 2.3.3 Phương pháp PCR phát PPV1 Phân ăng PCR đāợc phøi trûn theo hng dộn cỵa nh sõn xuỗt, mữi c hiu đāợc dùng Ċ n÷ng đû cùi 0,5pM cho múi m÷i xim÷i ngāợc Chu trình nhiệt g÷m: tiền biến tính 94C/5 phút; lặp läi 35 lỉn chu trình nhiệt sau: biến tính 94C/30 giây, gín m÷i 57,1C/20 giây, kéo dài 72C/30 giây Phân tích sân phèm PCR bìng phāćng pháp điện di thäch agarose 2%, có bù sung RedSafeNucleic Acid Staining Solution 1x 2.3.4 Phân tích trình tự nucleotide PPV1 Phân tích biến đûng măc tāćng đ÷ng dừc theo chiu di gen mó húa protein NS1 cỵa PPV1 đāợc thĆc bìng phân phỉn mềm SimPlot (Lole & cs., 1999) vĉi tham sø mặc đðnh Møi quan h di truyn cỵa PPV1 c xõy dng da mût phỉn trình tĆ gen mã hóa protein NS1 (tĂ nucleotide 1470-1733) Phæn mềm IQTREE phiên bân 1.6.2 (Nguyen & cs., 2015) đāợc düng để xây dĆng phát sinh chỵng loọi vi cỏc tham sứ ổu vo nh sau: (i) phng phỏp xõy dng cõy phỏt sinh chỵng lội maximum likelihood; (ii) mơ hình mơ phóng sĆ thay đùi nucleotide giąa trình tĆ gen đāợc lĆa chõn tĆ đûng bìng câu lệnh “-m TEST”; (iii) măc tin cờy cỏc nhỏnh cỵa cõy phỏt sinh chỵng lội đāợc āĉc tính theo phāćng pháp transfer bootstrap expectation (Lemoine & cs., 2018), vĉi phép thĄ bootstrap lặp 1.000 lỉn Các trình tĆ tham chiếu đāợc chõn theo cơng bø trāĉc đåy (Hao & cs., 2011; Chung & cs., 2020) Chāćng trình iTOL (Letunic & Bork, 2019) đāợc düng chỳ thớch cõy phỏt sinh chỵng loọi KT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phát kháng thể kháng PPV1 Trong 68 méu huyết lợn thðt xét nghiệm, có 60/68 méu (88,2%) dāćng tính vĉi kháng thể kháng PPV1 (hiệu giá HI ≥ 1/16) Kết quâ biểu diễn hỡnh cho thỗy biờn ỷ dao ỷng hiu giá kháng thể rûng, tĂ 1/16-1/4096 CĀ thể, 60 méu dāćng tính đāợc xếp vào nhóm có măc hiệu giá cao (18/60 méu, 30%) nhóm có măc hiệu giá thỗp (42/60 mộu, 70%) Mỷt kt quõ nghiờn cu cụng bø nëm 2012 cho biết kháng thể thĀ đûng kháng PPV1 truyn qua sa ổu chợ tữn tọi vũng tháng tāợng chuyển dāćng tính huyết hõc Ċ lợn giai độn ni thðt kết q ỏp ng dch chỵ ỷng chứng lọi s phi nhiễm PPV1 tĆ nhiên (Stojanac & cs., 2012) DĆa vào kết q dāćng tính huyết hõc (Hình 1), suy luên tāợng phći nhiễm PPV1 phự bin khu vc lỗy mộu PPV1 l virus có mặt phù biến Ċ lợn, nhiên tỷ lệ dāćng tính khác giąa nāĉc (Saekhow & Ikeda, 2015; Chung & cs., 2020) Ở Việt Nam, kết q khâo sát Ċ mût sø tỵnh miền Trung bìng phāćng pháp PCR phát 52,7% huyết lợn thðt có PPV1 (Nguyen Tran Trung & cs., 2019) Do vờy, t l dng tớnh huyt hừc cao cỵa nhóm lợn thðt nghiên cău giâi thích 3.2 PCR phát PPV1 mẫu huyết Mỷt sứ nghiờn cu cho thỗy s cú mt cỵa PPV1 mỏu khụng ph thuỷc vo hm 497 Sự diện Porcine Parvovirus (PPV1) lợn nuôi Hà Nội vùng phụ cận lāợng kháng thể đặc hiệu kháng PPV1 (Streck & cs., 2011; Dias & cs., 2013) Trong khuụn khự cỵa nghiờn cu, chỳng tơi chõn Ċ múi tỵnh méu huyết có hiệu giá HI khác để phát hiện tāợng virus huyết bìng phāćng pháp PCR Kết quâ PCR xác đðnh PPV1 méu huyết đāợc minh hõa Ċ hình tùng hợp Ċ bâng 16 14 12 Số mẫu 10 4096 2048 1024 512 256 128 64 32 16 Mức thấp Mức cao Hiệu giá HI (1/x) Hình Hiệu giá kháng thể kháng PPV1 mẫu huyết lợn thịt M (-) (+) ** > > > * > Ghi chú: M thang ADN chuẩn với khoảng cách vạch 100bp Các mẫu huyết xét nghiệm bố trí giếng số đến số Các vạch sản phẩm PCR không đặc hiệu đánh dấu “*”, “**”.Vạch sản phẩm đặc hiệu (265 bp) đánh dấu ký hiệu “>” Hình Minh họa kết quâ phân ứng PCR phát PPV1 498 Nguyễn Văn Giáp, Mai Thị Ngân, Lê Văn Trường, Vũ Thị Ngọc, Võ Văn Hiểu, Tạ Thị Kim Chung, Vũ Đức Hạnh, Huỳnh Thị Mỹ Lệ chën ni khác khưng phĀ thủc vào hàm lāợng kháng thể dðch thể đặc hiệu (Streck & cs., 2011) Nhờn xột ny cho thỗy s cổn thit kt hp phāćng pháp huyết hõc phāćng pháp PCR nghiên cău sĆ lāu hành virus Mặc dù vêy, hän ch cỵa nghiờn cu hin thi l cha xột nghim đāợc tồn bû sø méu huyết lợn thðt bìng phõn ng PCR, nờn khụng th kt luờn ổy ỵ tāợng nhiễm virus huyết Kết quâ Ċ hình cho biết, Ċ méu Ċ giếng sø 5, v xuỗt hin vọch c hiu vi kớch thc 265bp Mộu ging sứ xuỗt hin mỷt sø väch PCR cị kích thāĉc khưng đặc hiệu đāợc đánh giá âm tính Tùng hợp kết quâ PCR phát PPV1 đāợc trình bày Ċ bâng Có 10/18 méu huyết xét nghiệm dāćng tính 8/18 méu âm tính vĉi PPV1 Các méu dāćng tính thu thêp Ċ trang träi täi tỵnh Vïnh Phýc, Bíc Ninh, Hāng Yên Hâi Dāćng (Bâng 1) Nhā vêy, câ phân ăng huyết hõc PCR phát sĆ lāu hành PPV1 Ċ lợn giai độn ni thðt (nhóm lợn khơng bao giĈ đāợc vacxin phịng bệnh PPV1) Kết q phån tích phāćng sai (ANOVA) cho thỗy hiu giỏ HI gia nhúm cú virus huyết (PCR dāćng tính) nhóm khơng có virus huyết (PCR âm tính) khơng có sĆ khác biệt (giá trð F lý thuyết = 1,59< FthĆc nghiệm Ċ măc P = 0,22>0,05) Kết quâ phù hợp vĉi kết luên: PPV1 lāu hành Ċ lợn đāợc nuöi dāĉi nhiều phāćng thăc 3.3 Phân tích trình tự gen mã hóa protein NS1 c im cỵa cỏc chỵng PPV1 phỏt hin nhóm méu xét nghiệm đāợc nghiên cău såu hćn dĆa vào phân tích trình tĆ gen Trên cć sĊ phân tích măc tāćng đ÷ng nucleotide dõc chiều dài gen mó húa protein NS1 cỵa cỏc chỵng PPV1 trờn th gii, ó xỏc nh ổu cỵa gen NS1 (t nucleotide 1400 tr i) cũ mc tng ững thỗp hn so vĉi vùng cịn läi (Hình 3) Bâng Kết quâ PCR phát PPV1 huyết Ký hiệu thực địa Địa điểm lấy mẫu Mã sốtrang trại Hiệu giá HI(1/x) Kết PCR VP2-12 Vĩnh Phúc A /512 + VP2-13 Vĩnh Phúc A /64 + VP2-15 Vĩnh Phúc A /8 + BN2-17 Bắc Ninh B /64 + BN2-18 Bắc Ninh B /4 + BN11-45 Bắc Ninh C /128 + HY12-41 Hưng Yên D /16 + HY12-42 Hưng Yên D /32 - HY12-45 Hưng Yên D /256 + HB14-0403 Hịa Bình E /128 - HB15-0401 Hịa Bình F /16 - HB15-0405 Hịa Bình F /8 - HN15-42 Hà Nội G /16 - HN18-0401 Hà Nội H /32 - HN18-0406 Hà Nội H /512 - HD18-45 Hải Dương I /32 - HD2-15 Hải Dương J /16 + HD2-195 Hải Dương J /8 + Ghi chú: 10 mẫu dương tính PPV1 giải trình tự gen NS1 có thứ tự sau: 1-7, 9, 17 18 499 0.94 0.92 0.9 0.88 0.86 Sự hiện0.84diện Porcine Parvovirus (PPV1) lợn nuôi Hà Nội vùng phụ cận 0.82 Similarity Mức tương đồng Similarity 0.8 0.78 1.0 0.76 0.98 0.74 0.96 0.72 0.94 0.7 0.92 0.68 0.9 0.66 0.88 0.64 0.86 0.62 0.84 0.6 0.82 0.58 0.8 0.56 0.78 0.54 0.76 0.52 0.74 0.5 0.72 SimPlot - Query: AY684872_vaccine-virus-IDT_Germany_1964 FileName: D:\Cao-hoc-K24\paper-\phan-tich-sau-phan-bien\seq-PPV1-genome-NS1-nu-for-PPV-for-DAMBE.fas Mức tương đồng cao > 96% (vùng 1) Mức tương đồng thấp so với vùng Vị trí sản phẩm PCR nhân lên mồi PPVF/PPVR 100 200 300 0.7 0.64 500 600 700 800 900 1,000 Position 1,100 Vị trí nucleotide trung tâm 0.68 0.66 400 1,200 1,300 1,400 1,500 1,600 1,700 1,800 1,900 Window : 200 bp, Step: 20 bp, GapStrip: On, Kimura (2-parameter), T/t: 2.0 Hình Kết q phân tích tương đồng trình tự nucleotide gen NS1 0.62 0.6 A 1470 1480 1490 1500 1510 1520 1530 1540 1550 1560 1570 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 0.58 D00623_NADL-2_USA_1976 0.56 U44978_Kresse_USA_1985 AY684866_Challenge_Germany_198 0.54 AY684871_27a_Germany 0.52 VP2-12_VinhPhuc_A VP2-13_VinhPhuc_A 0.5 VP2-15_VinhPhuc_A 100 200 300 BN2-17_BacNinh_B BN2-18_BacNinh_B BN11-45_BacNinh_C HY12-41_HungYen_D HY12-45_HungYen_D HD2-15_HaiDuong_J HD2-195_HaiDuong_J GTTAGAATAGGATGCGAGGAAAGACCAGAACATACACAACCAATAAGAGACAGAATGTTAAACATAAACCTAACCAGAAAACTGCCAGGTGATTTTGGACTTTTAGAAGA C 400 500 600 700 800 900 1,000 1,100 1,200 1,300 1,400 1,500 1,600 1,700 1,800 1,900 Position Window : 200 bp, Step: 20 bp, GapStrip: On, Kimura (2-parameter), T/t: 2.0 1580 1590 1600 1610 1620 1630 1640 1650 1660 1670 1680 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | D00623_NADL-2_USA_1976 U44978_Kresse_USA_1985 AY684866_Challenge_Germany_198 AY684871_27a_Germany VP2-12_VinhPhuc_A VP2-13_VinhPhuc_A VP2-15_VinhPhuc_A BN2-17_BacNinh_B BN2-18_BacNinh_B BN11-45_BacNinh_C HY12-41_HungYen_D HY12-45_HungYen_D HD2-15_HaiDuong_J HD2-195_HaiDuong_J AACTGAATGGCCACTAATATGTGCTTGGTTGGTAAAGAAAGGTTACCAAGCAACAATGGCTAGCTATATGCATCATTGGGGAAATGTACCTGATTGGTCAGAAAAATGGG C G 1690 1700 1710 1720 1730 | | | | | | | | | D00623_NADL-2_USA_1976 U44978_Kresse_USA_1985 AY684866_Challenge_Germany_198 AY684871_27a_Germany VP2-12_VinhPhuc_A VP2-13_VinhPhuc_A VP2-15_VinhPhuc_A BN2-17_BacNinh_B BN2-18_BacNinh_B BN11-45_BacNinh_C HY12-41_HungYen_D HY12-45_HungYen_D HD2-15_HaiDuong_J HD2-195_HaiDuong_J AGGAGCCAAAAATGCAAACCCCAATAAATACACCAACAGACTCT .A T T T T T T T T T B BN2-17 BN2-18 Trang trại B, tỉnh Bắc Ninh Ghi chú: (A) Kết so sánh trình tự nucleotide PPV1 Việt Nam (đánh dấu) với chủng đại diện Dấu “.” biểu thị vị trí có nucleotide giống với chủng tham chiếu NADL-2; (B) Giản đồ giải trình tự vị trí đa hình nucleotide 1694 G- T chủng PPV1 thu trang trại B Hình Trình tự nucleotide phân đoạn gen mã hóa protein NS1 Trong đị đoän gen đāợc nhân lên phân ăng PCR phát hin virus nỡm vựng cú mc tng ững thỗp kể Do vêy, sân phèm PCR phát PPV1 c dựng giõi mó phồn oọn gen NS1 cỵa 10 méu dāćng tính 500 PPV1 (Bâng 1) Hình trình by kt quõ giõi mó gen cỵa 10 chỵng PPV1 Kt quõ hỡnh cho thỗy 10 chỵng PPV1 thĆc đða Ċ Việt Nam có trình tĆ phån độn gen NS1 ớt thay ựi, vi mc tng ững rỗt cao tĂ AY583318_China_C JN968975_JT_China M38367_NADL-2_UK NC_001718_NADL-2 KF913349_NADL-2-M KF913347_NADL-2-M KF913350_NADL-2-M KF913351_NADL-2-M KF913348_NADL-2-M KF913346_NADL-2-M KF913345_NADL-2-M KF742500_J-PPV_Ch KF429252_HN-G_Ch DQ675456_SR-1_Ch KF429253_HN-H_Ch JX992846_HN-2011_ MF447833_HNLY201 KF429254_HN-I_Chin U44978_Kresse_US KX242359_GD2013_ AY684866_Challeng KF429255_HN-K_Ch KY994646_T142_Ko AY583318_China_C EU790641_BQ_China JN968975_JT_China AY390557_VRI-1_K M38367_NADL-2_UK JN400516_7a_Germ NC_001718_NADL-2 JN400517_8a_Germ KF913349_NADL-2-M AY684869_Tornau/1 KF913347_NADL-2-M JN400518_14a_Germ KF913350_NADL-2-M JN400519_693a_Ge KF913351_NADL-2-M KJ201927_HNAY_Ch KF913348_NADL-2-M KJ201928_HNZK-1_ KF913346_NADL-2-M FJ822038_Nanjing20 KF913345_NADL-2-M KX233726_TJ_China KF742500_J-PPV_Ch MH566237_N108_Ko KF429252_HN-G_Ch MH817778_N91_Kor DQ675456_SR-1_Ch MH817779_N2_Kore KF429253_HN-H_Ch EU790642_ZJ_China JX992846_HN-2011_ AY789533_HN-Z1_C MF447833_HNLY201 AY789534_HN-Z3_C U44978_Kresse_US AY789532_NJ-2_Ch AY684866_Challeng KY994646_T142_Ko EU790641_BQ_China AY390557_VRI-1_K JN400516_7a_Germ JN400517_8a_Germ AY684869_Tornau/1 JN400518_14a_Germ JN400519_693a_Ge KJ201927_HNAY_Ch KJ201928_HNZK-1_ FJ822038_Nanjing20 KX233726_TJ_China MH566237_N108_Ko MH817778_N91_Kor MH817779_N2_Kore EU790642_ZJ_China AY789533_HN-Z1_C AY789534_HN-Z3_C AY789532_NJ-2_Ch Nguyễn Văn Giáp, Mai Thị Ngân, Lê Văn Trường, Vũ Thị Ngọc, Võ Văn Hiểu, Tạ Thị Kim Chung, Vũ Đức Hạnh, Huỳnh Thị Mỹ Lệ 99,7% đến 100% Ở phån đoän gen NS1 dài 263 nucleotide (nghiên cău này), chỵ có vð trí đa hình nucleotide 1694 G-T (Hỡnh 4B) So vi chỵng tham chiu (Kresse, 27a, Challenge v NADL-2), 10 chỵng cỵa Vit Nam có măc tāćng đ÷ng trình tĆ nucleotide tøi thiểu 98,8% Đặc tính tāćng đ÷ng cao trình tĆ nucleotide l gen mó húa NS1 cú tớnh bõo thỵ cao hn, tức ỷ bin ựi thỗp hn so vi gen mã hóa capsid protein (Ren & cs., 2013; Meszaros & cs., 2017) Theo danh mĀc thuøc thý y c cỗp phộp lu hnh tọi Vit Nam (Cc Thỳ y, 2019), chỵ có vacxin vơ hột phịng bệnh PPV1 gåy lāu hành thð trāĈng Việt Nam Do vêy, kết quâ PCR giâi trình tĆ gen khợng nh s lu hnh cỵa virus chỵng thc a Ċ lợn täi mût sø tỵnh miền Bíc Cùng vĉi kết q cơng bø gỉn đåy sĆ lāu hành genotype parvovirus Ċ lợn nuôi täi miền Trung (Nguyen Tran Trung & cs., 2019) cho thỗy PPV1 cú mt Ċ nhiều tỵnh/thành phø câ nāĉc Nghiên cău tiếp tĀc xác đðnh møi quan hệ di truyền giąa cỏc chỵng PPV1 thc a bỡng phng phỏp phồn tớch cồy phỏt sinh chỵng loọi (Hỡnh 5) Tờn chng Nhúm di truyền Amino acid NS1 0,83 564 577 3- 553 0,83 Ghi chú: giá trị bootstrap biểu diễn theo thang đo 0-1 tương ứng với mức 0-100% Ký hiệu 10 chủng PPV1 Việt Nam theo quy tắc: tên chủng, địa điểm lấy mấu (tỵnh) trang trại lấy mẫu (chữ A-J) Trình tự amino acid đính kèm tương ứng cho chủng PPV1 nhằm làm rõ khác biệt đột biến D/E amino acid 564 protein NS1 Hình Cây phát sinh chủng loại PPV1 dựa vào phân đoạn gen mã hóa protein NS1 501 Sự diện Porcine Parvovirus (PPV1) lợn nuôi Hà Nội vùng phụ cận Kt quõ xõy dng cõy phỏt sinh chỵng loọi bao g÷m trình tĆ tham chiếu biết nhóm di truyn (Hỡnh 5) cho thỗy cú nhúm di truyn (nhúm 1-4) cỵa PPV1 giứng nh cửng bứ trc ồy (Hao & cs., 2011) DĆa vào đặc điểm phân nhòm, ó xỏc nh 10/10 chỵng PPV1 c giõi trỡnh t nghiên cău thủc nhóm Nhóm ny gữm cỏc chỵng phỏt hin c nhiu nc thuûc châu Mỹ (NADL-2, Kresse), châu Âu (Challenge) châu (SR-1, N2) Cú 9/10 chỵng cỵa Vit Nam (tr chỵng BN2-17) nỡm cựng nhỏnh vi chỵng N2 cỵa Hn Qùc (địng khung, hình 5) Nhịm mã hịa aspartic (D) Ċ amino acid 564 khác biệt so vĉi 47 chỵng PPV1 mó hũa glutamic (E) (ỏnh dỗu mu xám, hình 5) Cho đến nay, đût biến ânh hng ti c tớnh sinh hừc cỵa parvovirus chỵ yu têp trung Ċ capsid protein (Meszaros & cs., 2017; Oh & cs., 2017) Do đị, cỉn nghiên cău thêm đặc im di truyn gen mó húa capsid protein cỵa cỏc chỵng PPV1 phỏt hin c Vit Nam KT LUẬN Có mût tỷ lệ cao (88,2%) méu huyết lợn thðt dāćng tính vĉi kháng thể kháng PPV1 Hiện tāợng virus huyết phát Ċ 10/18 méu vĉi đặc điểm khơng phĀ thủc vào hàm lāợng kháng thể kháng PPV1 Kết quâ giâi mã mût phæn gen NS1 cho bit 10 chỵng PPV1 cỵa Vit Nam thuỷc nhúm di truyn 1, gữm cỏc chỵng phỏt hin c nhiều nāĉc thuûc châu Mỹ, châu Âu châu Á TÀI LIỆU THAM KHẢO Bergeron J., Menezes J & Tijssen P (1993) Genomic organization and mapping of transcription and translation products of the NADL-2 strain of porcine parvovirus Virology 197(1): 86-98 Cadar D., Dan A., Tombacz K., Lorincz M., Kiss T., Becskei Z., Spinu M., Tuboly T & Csagola A (2012) Phylogeny and evolutionary genetics of porcine parvovirus in wild boars Infection, Genetics and Evolution 12(6): 1163-1171 Chung H.C., Nguyen V.G., Huynh T.M., Park Y.H., Park K.T & Park B.K (2020) PCR-based detection and genetic characterization of porcine 502 parvoviruses in South Korea in 2018 BMC Veterinary Research 16(1): 113 Cục Thú y (2019) Danh mục thuốc thú y cấp phép lưu hành Việt Nam (phụ lục 1A, 1B) Truy cập từ http://cucthuy.gov.vn/Pages/danh-mucthuoc-thu-y-da-duoc-cap-giay-chung-nhan-luuhanh-tai-viet-nam-.aspx, ngày 31/12/2019 Dias A.S., Gerber P.F., Araujo A.S., Auler P.A., Gallinari G.C & Lobato Z.I.P (2013) Lack of antibody protection against Porcine circovirus and Porcine parvovirus in naturally infected dams and their offspring Research in Veterinary Science 94(2): 341-345 Ellis J.A., Bratanich A., Clark E.G., Allan G., Meehan B., Haines D.M., Harding J., West K.H., Krakowka S., Konoby C., Hassard L., Martin K & Mcneilly F (2000) Coinfection by porcine circoviruses and porcine parvovirus in pigs with naturally acquired postweaning multisystemic wasting syndrome Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 12(1): 21-27 Hao X., Lu Z., Sun P., Fu Y., Cao Y., Li P., Bai X., Bao H., Xie B., Chen Y., Li D & Liu Z (2011) Phylogenetic analysis of porcine parvoviruses from swine samples in China Virology Journal 8: 320 Hồ Đình Chúc, Nguyễn Thị Phương Đơng & Trần Duy Khanh (1995) Tình hình hội chứng loạn sinh sản lợn nái Thái Bình Tạp chí Thú y 1: 1-4 Joo H.S., Donaldson-Wood C.R & Johnson R.H (1976) A standardised haemagglutination inhibition test for porcine parvovirus antibody Australian Veterinary Journal 52(9): 422-424 Lemoine F., Domelevo Entfellner J B., Wilkinson E., Correia D., Davila Felipe M., De Oliveira T & Gascuel O (2018) Renewing Felsenstein's phylogenetic bootstrap in the era of big data Nature 556(7702): 452-456 Letunic I & Bork P (2019) Interactive Tree of Life (iTOL) v4: recent updates and new developments Nucleic Acids Research 47(W1): W256-W259 Lole K.S., Bollinger R.C., Paranjape R.S., Gadkari D., Kulkarni, S.S., Novak N.G., Ingersoll R., Sheppard H.W & Ray S.C (1999) Full-length human immunodeficiency virus type genomes from subtype C-infected seroconverters in India, with evidence of intersubtype recombination Journal of Virology 73(1): 152-160 Mayr A., Bachmann P.A., Siegl G., Mahnel H & Sheffy B.E (1968) Characterization of a small porcine DNA virus Arch Gesamte Virusforsch 25(1): 38-51 Meszaros I., Olasz F., Csagola A., Tijssen P & Zadori Z (2017) Biology of Porcine Parvovirus (Ungulate parvovirus 1) Viruses 9(12): 393 Nguyễn Văn Giáp, Mai Thị Ngân, Lê Văn Trường, Vũ Thị Ngọc, Võ Văn Hiểu, Tạ Thị Kim Chung, Vũ Đức Hạnh, Huỳnh Thị Mỹ Lệ Nguyen L.T., Schmidt H.A., Von Haeseler A & Minh B.Q (2015) IQ-TREE: a fast and effective stochastic algorithm for estimating maximumlikelihood phylogenies Molecular Biology and Evolution 32(1): 268-274 Nguyen Tran Trung, Tran Quoc Dung, Dinh Thi Ngoc Thuy, Vu Thi Tien, Do Vo Anh Khoa & Nguyen Thi Dieu Thuy (2019) Detection of porcine parvovirus (PPV) in pigs in central provinces of Viet Nam Journal of Animal Husbandry Sciences and Technics 249: 110-115 Oh W.T., Kim R.Y., Nguyen V.G., Chung H.C & Park B.K (2017) Perspectives on the evolution of porcine parvovirus Viruses 9(8): 196 Oravainen J., Heinonen M., Tast A., Virolainen J & Peltoniemi O (2005) High porcine parvovirus antibodies in sow herds: prevalence and associated factors Reproduction in Domestic Animals 40(1): 57-61 Pozzi P.S & Alborali G.L (2012) Reproductive diseases in sows (Sus scrofa domestica): a review Israel Journal of Veterinary Medicine 67(1): 24-33 Ranz A.I., Manclus J.J., Diaz-Aroca E & Casal J.I (1989) Porcine parvovirus: DNA sequence and genome organization Journal of General Virology 70(Pt 10): 2541-2553 Ren X., Tao Y., Cui J., Suo S., Cong Y & Tijssen P (2013) Phylogeny and evolution of porcine parvovirus Virus Research 178(2): 392-397 Saekhow P & Ikeda H (2015) Prevalence and genomic characterization of porcine parvoviruses detected in Chiangmai area of Thailand in 2011 Microbiology and Immunology 59(2): 82-88 Stojanac N., Gagrčin M., Stevančević O., Stančić I & Potkonjak A (2012) Passive and active immunity against parvovirus infection in piglets African Journal of Biotechnology 11(30): 7771-7774 Streck A., Gava D., Souza C., Gonỗalves K., Bortolozzo F., Wentz I & Canal C (2011) Presence of porcine parvovirus in sera from pigs is independent of antibody titers Berl Munch Tierarztl Wochenschr 124: 242-246 Xing X., Zhou H., Tong L., Chen Y., Sun Y., Wang H & Zhang G (2018) First identification of porcine parvovirus in China Archives of Virology 163(1): 209-213 Xu X.G., Chen G.D., Huang Y., Ding L., Li Z.C., Chang C.D., Wang C.Y., Tong D.W & Liu H.J (2012) Development of multiplex PCR for simultaneous detection of six swine DNA and RNA viruses Journal of Virological Methods 183(1): 69-74 503 ... /32 - HY12-45 Hưng Yên D /256 + HB14-0403 Hịa Bình E /12 8 - HB15-04 01 Hịa Bình F /16 - HB15-0405 Hịa Bình F /8 - HN15-42 Hà Nội G /16 - HN18-04 01 Hà Nội H /32 - HN18-0406 Hà Nội H / 512 - HD18-45... cú mt cỵa PPV1 mỏu khụng ph thuỷc vo hàm 497 Sự diện Porcine Parvovirus (PPV1) lợn nuôi Hà Nội vùng phụ cận lāợng kháng thể đặc hiệu kháng PPV1 (Streck & cs., 2 011 ; Dias & cs., 2 013 ) Trong khuụn.. .Sự diện Porcine Parvovirus (PPV1) lợn nuôi Hà Nội vùng phụ cận thêm mût sø loäi parvovirus mĉi Ċ lợn, ký hiệu tĂ PPV2 đến PPV7 Khác vĉi PPV1 (thủc giøng Protoparvovirus), lội parvovirus