Nghiên cứu một số đặc tính sinh học phân tử của virus care (canine distemper) phân lập từ chó nuôi tại hà nội và vùng phụ cận

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM  ðÀO THỊ HUỆ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA VIRUS CARE (CANINE DISTEMPER) PHÂN LẬP TỪ CHÓ NUÔI TẠI HÀ NỘI VÀ VÙNG PHỤ CẬN LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI – 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM  ðÀO THỊ HUỆ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA VIRUS CARE (CANINE DISTEMPER) PHÂN LẬP TỪ CHÓ NUÔI TẠI HÀ NỘI VÀ VÙNG PHỤ CẬN CHUYÊN NGÀNH: THÚ Y Mà SỐ:60.64.01.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : PGS.TS. NGUYỄN THỊ LAN BỘ MÔN BỆNH LÝ HÀ NỘI – 2014 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa từng được sử dụng để bảo vệ một học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc hoàn thành luận văn này đã được cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được ghi rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Tác giả luận văn ðào Thị Huệ Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii LỜI CẢM ƠN Trong thời gian học tập và rèn luyện tại Học viện Nông Nghiệp Việt Nam, tôi ñã trưởng thành và nâng cao về nhân cách, trình ñộ chuyên môn. Tôi ñã nhận ñược sự giúp ñỡ, chỉ bảo tận tình của các Thầy, Cô giáo ñặc biệt là các Thầy, Cô Khoa Thú y ñã truyền dạy kiến thức chuyên môn cũng như tư cách ñạo ñức của người Bác sỹ thú y, của một tri thức trẻ trong thời ñại mới. Nhân dịp hoàn thành luận văn cao học cho phép tôi ñược bày tỏ hơn nữa lòng biết ơn chân thành tới các Thầy, Cô giáo. Xin ñược gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thị Lan - Bộ môn Bệnh Lý, Khoa Thú y - Học viện Nông Nghiệp Việt Nam, người hướng dẫn khoa học - người ñã tận tình giúp ñỡ tôi trong suốt thời gian làm luận văn. ðồng thời tôi cũng bày tỏ sự biết ơn ñến các anh chị Phòng thí nghiệm trọng ñiểm Công nghệ sinh học Thú y; các Thầy, Cô trong Bộ môn Bệnh Lý, Khoa Thú y – Học viện Nông Nghiệp Việt Nam ñã tạo mọi ñiều kiện ñể tôi hoàn thành luận văn này. Xin ñược bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia ñình, bạn bè - những người ñã luôn ñộng viên, giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn này. Xin trân trọng cảm ơn ! Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Học viên Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii 1. MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục tiêu của đề tài 3 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1. Lịch sử và tình hình nghiên cứu 4 2.1.1. Tình hình nghiên cứu bệnh Care trên thế giới 4 2.1.2. Tình hình nghiên cứu bệnh Care trong nước 5 2.2. Căn bệnh học 6 2.2.1. Phân loại virus gây bệnh Care 6 2.2.2. Hình thái của virus Care 7 2.2.3. Cấu trúc của virus Care 7 2.2.4. Sức đề kháng của virus Care 8 2.2.5. Cơ chế sinh bệnh 9 2.3. Dịch tễ học 11 2.3.1. Loài vật mắc bệnh 11 2.3.2. Lứa tuổi mắc bệnh 11 2.3.3. Mùa vụ thường xảy ra bệnh 11 2.4. Truyền nhiễm học 12 2.4.1. Chất chứa virus 12 2.4.2. Đường xâm nhập và phương thức lây lan 12 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iv 2.4.3. Tỷ lệ ốm, tỷ lệ chết 12 2.5. Triệu chứng bệnh tích 13 2.5.1. Triệu chứng lâm sàng 13 2.5.2. Bệnh tích 15 2.6. Chẩn đoán bệnh 17 2.6.1. Dựa vào đặc điểm dịch tễ học của bệnh 17 2.6.2. Dựa vào triệu chứng lâm sàng 17 2.6.3. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm 18 2.7. Phòng và điều trị bệnh 21 2.7.1. Phòng bệnh 21 2.7.2. Điều trị 23 2.8. Kỹ thuật giải trình tự gen 24 2.8.1. Giải trình tự gen theo phương pháp Maxam và Gilbert 24 2.8.2. Giải trình tự gen theo phương pháp Dideoxy 26 2.8.3. Giải trình tự gen bằng máy tự động 27 3. ĐỐI TƯỢNG - NỘI DUNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 3.1. Đối tượng nghiên cứu 29 3.2. Nội dung nghiên cứu 29 3.3. Phương pháp nghiên cứu 29 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 4.1. Kết quả lựa chọn mẫu nghiên cứu 37 4.2. Kết quả giải trình tự đoạn gen H (Heamaglutinine) của các chủng virus Care 45 4.2.1. Kết quả phản ứng RT-PCR 45 4.2.2. Kết quả giải trình tự đoạn gen H của các chủng virus Care nghiên cứu 46 4.3. Kết quả so sánh trình tự nucleotide của đoạn gen H của các chủng virus Care nghiên cứu và chủng virus vacxin 48 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v 4.4. Kết quả so sánh trình tự axit amin của đoạn gen H của các chủng virus nghiên cứu với chủng virus vacxin 55 4.5. Sự tương đồng về nucleotide và axit amin của đoạn gen H giữa các chủng virus Care nghiên cứu. 58 4.6. Kết quả xây dựng cây sinh học phân tử 59 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 61 5.1. Kết luận 61 5.2. Đề nghị 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 I. TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 62 II. TÀI LIỆU TIẾNG ANH 62 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1. Mẫu chó nghi mắc Care thu thập được 37 Bảng 4.2. Kết quả chẩn đoán bằng phương pháp RT-PCR các chó nghi mắc bệnh Care 42 Bảng 4.3. Kết quả phân lập virus Care trên môi trường tế bào Vero-DST 43 Bảng 4.4. Hồ sơ chủng virus Care được lựa chọn nghiên cứu 45 Bảng 4.5. Sự tương đồng về nucleotide và axit amin của đoạn gen H giữa các chủng virus Care nghiên cứu (%) 58 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Mô hình cấu trúc của virus Care 7 Hình 4.1. Chó nghi mắc bệnh Care có biểu hiện mệt mỏi, ủ rủ 38 Hình 4.2. Chó nghi mắc bệnh Care có nhiều rử mắt 38 Hình 4.3.Chó tiêu chảy phân màu cafe 38 Hình 4.4. Xuất hiện nốt sài ở vùng da mỏng 38 Hình 4.5. Xoang ngực tích nước 41 Hình 4.6. Dạ dày, ruột chứa đầy hơi 41 Hình 4.7. Phổi bị hoại tử, gan hóa 41 Hình 4.8. Lách hoại tử đen 41 Hình 4.9. Gan, mật sưng 41 Hình 4.10. Dạ dày chứa dịch màu vàng 41 Hình 4.11. CPE do CDV gây ra sau 24 giờ gây nhiễm 44 Hình 4.12. CPE do CDV gây ra sau 36giờ gây nhiễm 44 Hình 4.13. CPE do CDVgây ra sau 48 giờ gây nhiễm 44 Hình 4.14. Tế bào Vero –DST bình thường 44 Hình 4.15: Kết quả phản ứng RT- PCR 45 Hình 4.16. Giản đồ giải trình tự tự động thành phần nucleotide của đoạn gen Haemagglutinin của virus Care 47 Hình 4.17. So sánh trình tự nucleotide của đoạn gen H của các chủng virus Care nghiên cứu 52 Hình 4.18. So sánh trình tự axitamin của đoạn gen H của các chủng virus Care nghiên cứu 56 Hình 4.19. Cây sinh học phân tử cho thấy mối quan hệ di truyền giữa các chủng virus Care nghiên cứu 59 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page viii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BLAST : Basic Local Alignment Search Tool Bp : Base pair CPE : Cytopathogenic Effect Da : Dalton ddNTP : Dideoxynucleotides DNA : Deoxyribonucleic acid DMEM : Dulbecco's Modified Eagle's Medium EDTA : Ethylenediamine Tetra Acetat Acid MV : Meales Virus PBS : Dung dịch muối đệm Phot phat PPRV : Peste des Petits Ruminants Virus FBS : Foetal Bovine Serum PCR : Polymerase Chain Reaction RNA : Ribonucleic acid RT-PCR : Reverse Transcription Polymesase Chain Reaction SLS : Sample loading solution TBE : Tris Borate EDTA [...]... Th c s Khoa h c Nông nghi p Page 2 c u ñ tài: Nghiên c u m t s ñ c tính sinh h c phân t c a virus Care (Canine distemper) phân l p t chó nuôi t i Hà N i và vùng ph c n” 1.2 M c tiêu c a ñ tài Làm rõ m t s ñ c tính sinh h c phân t ch y u, s tương ñ ng v trình t nucleotide, axit amin và m i quan h di truy n c a virus Care phân l p t chó nuôi t i Hà N i và vùng ph c n H c vi n Nông nghi p Vi t Nam – Lu... a virus h c nhi u vacxin phòng b nh Care có hi u qu ra ñ i Các công trình nghiên c u v s liên quan kháng nguyên gi a virus Care và virus s i ngư i, gi a virus Care và virus d ch t trâu bò, c a J.M Dams Pgoret ñã m r ng ra ñư c nhi u tri n v ng cho vi c phòng b nh Care b ng cách H c vi n Nông nghi p Vi t Nam – Lu n văn Th c s Khoa h c Nông nghi p Page 4 dùng virus d ch t trâu bò và virus s i theo nghiên. .. ng Morbillivirus và có m i liên quan g n gũi v tính kháng nguyên và ñ c tính sinh h c v i virus gây b nh s i ngư i và virus d ch t trâu bò CDV có kích thư c tương ñ i l n, ñư ng kính t 150 - 250 nm, v i c u trúc xo n, nhân là m t RNA s i ñơn, có v Lipoprotein Virus Care ch có m t serotype duy nh t nhưng có nhi u ch ng ñư c phân l p t chó nuôi nhi u khu v c ñ a lý khác nhau trên th gi i và có nh ng... Celiker và Gillespie dùng virus Care ñã thích nghi trên môi trư ng phôi tr ng ñ nghiên c u s nh hư ng c a nhi t ñ ñ n tính c m nhi m c a virus và tác gi ñã nh n th y: Virus Care c c kỳ m n c m v i s c nóng Virus b phá h y 50 - 600C trong 30 phút Trong mô cô l p nó t n t i ñư c ít nh t m t gi 370C và 200C (nhi t ñ phòng) Th i ti t m áp virus không th t n t i lâu trong 3 gi chu ng nuôi chó sau khi chó b... ra chó t 2 ñ n 12 tháng tu i, nhi u nh t là chó t 3 ñ n 6 tháng tu i Nhi u nghiên c u cho th y, chó 6 tháng tu i d m c b nh Care hơn chó 3 tháng tu i có th là do chó 3 tháng tu i v n còn mi n d ch th ñ ng nh n ñư c t chó m qua s a ñ u (H ðình Chúc và cs, 1993; Simpson và cs, 1994) Ngư i ta cũng ñã ghi nh n virus Care gây b nh v i bi u hi n viêm não trên chó l n tu i theo nghiên c u c a Merchant và. .. Phòng và ñi u tr b nh 2.7.1 Phòng b nh Phòng b nh b ng v sinh Nuôi dư ng, chăm sóc t t, cho chó ăn ñ y ñ dinh dư ng và v sinh s ch s nơi c a chó là nh ng bi n pháp t t ñ tăng s c ñ kháng t nhiên c a cơ th chó ñ i v i b nh Nh ng chó m ph i nuôi cách ly, chu ng chó m ph i tiêu ñ c b ng thu c sát trùng, x lý ch t bài ti t và th c ăn nư c u ng th a c a chó b nh Chó m i mua v ph i ki m tra k h sơ, nuôi cách... a vi khu n ký sinh s n có ñư ng tiêu hóa, hô h p thư ng làm cho b nh tr m tr ng thêm B nh thư ng th hi n hai d ng: viêm ph i và viêm ru t Khi m c b nh Care con v t có bi u hi n s t r t cao trên 400C T t c các gi ng và l a tu i ñ u m n c m v i b nh Care tuy nhiên gi ng chó ngo i và chó non thì m n c m hơn…( Tô Du và Xuân Giao, 2006) Nguy n Th Lan và cs ñã nghiên c u thành công ñ c tính sinh trư ng c... 2.4.1 Ch t ch a virus Trong cơ th chó m c b nh Care, virus thư ng có trong máu, ph t ng, các ch t bài ti t, ñ c bi t nư c ti u thư ng xuyên có virus Các cơ quan t p trung nhi u virus chó m c Care như: não, lách, ph i, h ch lympho, tu xương theo nghiên c u c a Lan và cs (2005) 2.4.2 ðư ng xâm nh p và phương th c lây lan Chó m c b nh bài xu t virus qua các ch t bài ti t c a cơ th như phân, nư c ti u,...1 M 1.1 ð U ð tv nñ B nh Care hay còn g i là b nh sài s t chó là m t b nh truy n nhi m c p tính nguy hi m c a loài chó, do virus Care (Canine Distemper Virus CDV) gây ra Virus Care chó ñư c phát hi n t th k XVIII, ñư c tìm th y Peru thu c Châu Á, b nh phân b kh p th gi i Năm 1905, căn b nh ñư c bác sĩ thú y ngư i Pháp tên là Henri Carré phân l p ñư c t nư c mũi c a chó b nh l c qua gi y l c vi... n kinh trung ương và gây nên các bi n ch ng khác ñư ng hô h p, tiêu hoá 2.3 D ch t h c 2.3.1 Loài v t m c b nh Trong t nhiên t t c các gi ng chó ñ u c m th v i virus Care, nhưng chó ngo i m n c m hơn chó n i (Tr n Thanh Phong, 1996) Virus Care cũng gây b nh ñ ng v t hoang dã ăn th t (Appel và cs, 1995; Frolich và cs, 2000; Martella và cs, 2002) Năm 1987, ngư i ta phát hi n virus Care (Phocasibirica) . ðÀO THỊ HUỆ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA VIRUS CARE (CANINE DISTEMPER) PHÂN LẬP TỪ CHÓ NUÔI TẠI HÀ NỘI VÀ VÙNG PHỤ CẬN CHUYÊN NGÀNH: THÚ Y Mà SỐ:60.64.01.01 . distemper) phân lập từ chó nuôi tại Hà Nội và vùng phụ cận 1.2. Mục tiêu của ñề tài Làm rõ một số đặc tính sinh học phân tử chủ yếu, sự tương đồng về trình tự nucleotide, axit amin và mối quan. tiến hành nghiên Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 3 cứu đề tài: Nghiên cứu một số ñặc tính sinh học phân tử của virus Care (Canine distemper) phân