3. đỐI TƯỢN G NỘI DUN GỜ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3. Phương pháp nghiên cứu
để tiến hành nghiên cứu và thực hiện ựược các nội dung ựã ựề ra của ựề tài, chúng tôi ựã kết hợp những phương pháp nghiên cứu thường quy và hiện ựại trong lĩnh vực thú y.
a) Phương pháp quan sát, thống kê sinh học
để xác ựịnh ựược các triệu chứng lâm sàng chủ yếu của chó mắc Care, chúng tôi tiến hành quan sát, ghi chép, thống kê các biểu hiện của chó từ khi xuất hiện những dấu hiệu bệnh lý ựầu tiên. đồng thời dựa vào các ựặc ựiểm dịch tễ học, những can thiệp trong quá trình bệnh xảy ra cũng như thu thập các thông tin liên quan. Tiến hành phân tắch, thống kê ựể ựưa ra những kết quả chắnh xác. Xác ựịnh chắnh xác những triệu chứng lâm sàng chủ yếu có ý nghĩa vô cùng quan trọng cho các bước thắ nghiệm tiếp theo.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 30
b) Phương pháp mổ khám
Mổ khám ca bệnh nhằm xác ựịnh ựược các biến ựổi ựại thể của các cơ quan, tổ chức của chó mắc Care, cần tiến hành mổ khám những chó có biểu hiện triệu chứng lâm sàng của bệnh. Chó bệnh ựược cố ựịnh cẩn thận, thu dịch swab (các dịch tự nhiên của cơ thể như nhử mắt, nước mũi, dịch ngoáy hầu họng). Lột da và bộc lộ xoang ngực, xoang bụng, tách các cơ quan nội tạng khỏi cơ thể quan sát và chụp ảnh. Tiến hành thu mẫu các cơ quan như: phổi, hạch, tim, gan, lách, thận theo các mục ựắch nghiên cứu khác nhau.
c) Phương pháp tách chiết RNA
Các mẫu bệnh phẩm thu thập ựược của các chó nghi mắc bệnh Care ựược chúng tôi bảo quản trong ựiều kiện -800C. Tiến hành nghiền mẫu bệnh phẩm là hạch phổi, phổi rồi bổ sung thểm 1ml PBS trước khi thực hiện phương pháp tách chiết RNA ựể chản ựoán các chó mắc bệnh.
- Quy trình tách chiết ARN virus dùng KIT (Kắt tách chiết QIAamp viral RNA minikit) của hãng Qiagen các bước thực hiện theo hướng dẫn sau:
Bước 1: Cho 560ộl Buffer AVL vào ống eppendoft
Bước 2: Cho 140ộl mẫu vào ống trên. Votex trong 15 giây, ựể nhiệt ựộ phòng trong 10 phút, ly tâm thời gian ngắn.
Bước 3: Cho 560ộl Ethanol (96% - 100%) vào ống và votex trong 15 giây. Bước 4: Hút 630ộl mẫu trong ống vào cột QIA ựậy nắp và ly tâm 8.000 vòng/phút/2 phút, loại bỏ dung dịch phắa dưới ống, lặp lại bước 4 một lần nữa với phần mẫu còn lại.
Bước 5: Cho 500ộl AW1 vào cột QIA, ly tâm 8.000 vòng/phút/2 phút, loại bỏ dịch phắa dưới cột.
Bước 6: Cho 500ộl AW2 vào cột QIA, ly tâm 13.500 vòng/phút/3 phút, loại bỏ dịch phắa dưới cột, ly tâm lại lần nữa với tốc ựộ tối ựa trong 1 phút.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 31 Bước 7: đặt cột QIA vào ống eppendoft 1.5 ml mới, thêm 60ộl AVE ựể ở nhiệt ựộ phòng trong 1 phút, ly tâm tốc ựộ 8.000 vòng trong 1 phút. Thu dịch qua cột và bảo quản ở -200C hoặc -800C.
d) Phương pháp tiến hành phản ứng RT-PCR
- Thực hiện phản ứng RT-PCR
Mẫu RNA sau khi tách chiết sẽ ựược hỗn hợp với các thành phần ựược trình bày ở bảng sau: Thành phần phản ứng Thể tắch cần lấy (ộl) 2X Reaction Mix 12.5 Mẫu RNA 5 Primer Forwad 0.5 Primer Reverse 0.5
RT/Platium Taq Mix 0.5
Nước cất 6
Tổng thể tắch 25
Các mồi sử dụng trong phản ứng RT-PCR
Tên mồi Kắ hiệu mồi Trình tự mồi (5Ỗ→ 3Ỗ)
Mồi xuôi CDVff1 TCGAAATCCTATGTGAGATCACT
Mồi ngược CDV- HS2 ATGCTGGAGATGGTTTAATTCAATCG
Cặp mồi này có khả năng khuếch ựại ựoạn gen dài 2100bp
Tiến hành phản ứng khuếch ựại sản phẩm trong máy PCR theo chu kỳ nhiệt sau:
Giai ựoạn Bước tổng hợp Nhiệt ựộ (oC) Thời gian Chu kỳ
1 Tổng hợp cADN 50 30 phút 1
Duỗi mạch 95 5 phút
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 32
Gắn mồi 50 30 giây
Tổng hợp sợi mới 72 1 phút
3 Hoàn chỉnh 72 10 phút 1
4 Giữ sản phẩm 4 ∞
- điện di kiểm tra sản phẩm PCR
Chuẩn bị thạch Agarose 1.2%: Cân 1.2g Agarose cho vào 100ml dung dịch TBE 1X, ựun sôi trong lò vi sóng, ựể nguội ựến khoảng 400C Ờ 500C, bổ sung thêm 1ul Red gel, ựổ thạch có số giếng tương ứng số mẫu cần ựiện di.
Chuẩn bị mẫu: Thêm 2 ộl loading dye vào 8 ộl sản phẩm RT-PCR
Chuẩn bị bể ựiện di: Chuyển thạch ựã ựông vào bể ựiện di, thêm TBE 1X ựến ngập thạch.
Nhỏ marker và sản phẩm PCR ựã trộn với loading dye vào các giếng với thể tắch 6ộl maker 100bp và 10 ộl sản phẩm PCR mỗi giếng.
điện di ở hiệu ựiện thế 100V trong 30 phút.
Quan sát kết quả ựiện di sản phẩm PCR trên máy chụp ảnh gel và chụp ảnh.
e) Phương pháp nuôi cấy tế bào
- Khôi phục tế bào
Chuẩn bị môi trường ựầy ựủ (DMEM, 10% FBS làm ấm trong tủ ấm 37oC trong 30 phút trước khi lấy tế bào ra nuôi cấy)
Bước 1: Giải ựông tế bào ở nhiệt ựộ phòng.
Bước 2: Ly tâm loại bỏ dung dịch bảo quản và giữ lại cặn tế bào.
Bước 3: Chuyển tế bào vào bình nuôi cấy chứa 5ml môi trường ựầy ựủ. Bước 4: đưa vào nuôi cấy và theo dõi sự phát triển của tế bào. Giữ tế bào ở 370C, 5% CO2 hàng ngày theo dõi sự phát triển của tế bào.
- Cấy chuyển tế bào
Bước 1: Loại bỏ môi trường ựang nuôi, rửa tế bào bằng PBS (không chứa Ca2+hoặc Mg2+).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 33 Bước 2: Trypsin hóa tách tế bào, sử dụng Trypsin - EDTA. Ủ từ 5 ựến 10 phút. Thêm 7ml môi trường không ựầy ựủ, trộn ựều chuyển sang ống ly tâm.
Bước 3: Loại bỏ trypsin, ly tâm loại bỏ phần dung dịch và giữ lại căn màu trắng.
Bước 4: Cân bằng môi trường và ựếm số tế bào, hòa tan tế bào trong 6ml môi trường ựầy ựủ. đếm tế bào, pha loãng tế bào 100 lần (10ộl tế bào trong 990ộl môi trường không ựầy ựủ) dùng buồng ựếm ựếm số tế bào trên kắnh hiển vi tắnh số tế bào trong 1ml.
Bước 5: Cấy chuyển tế bào, pha loãng tế bào ựến 2*105 tế bào/ml trong môi trường ựầy ựủ, chia huyễn dịch tế bào vào bình nuôi (6ml/bình T25, 15ml/ bìnhT75).
Bước 6: Nuôi tế bào và kiểm tra sự phát triển, giữ tế bào ở 370C, 5%CO2
hàng ngày theo dõi sự phát triển của tế bào.
- Thu tế bào
Các bước thu tế bào giống với các bước cấy chuyển tế bào chỉ khác ở bước 5 và bước 6.
Bước 5: Chia ống tế bào, pha loãng tế bào ở 5*106 tế bào/ml trong môi trường ựầy ựủ có bổ sung 10% DMSO, chia huyễn dịch tế bào vào các ống bảo quản 1ml/ống.
Bước 6: Bảo quản tế bào, giữ ống tế bào trong hộp lạnh ở -20oC trong 2- 3 giờ, chuyển sang -80oC qua ựêm, chuyển tế bào vào giữ trong nitơ lỏng.
g)Phương pháp giải trình tự gien
Kỹ thuật giải trình tự: Giải trình tự DNA (DNA sequence) là quá trình xác lập và thu nhận thành phần nucleotide của một phân ựoạn DNA cần nghiên cứu. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng máy giải trình tự gen tự ựộng Beckman Coulter CEQ 8000 (Mỹ) thắ nghiệm ựược tiến hành tại Phòng thắ nghiệm trọng ựiểm Công nghệ sinh học Thú y - khoa Thú y. Nguyên tắc chung của máy giải
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 34 trình tự gen tự ựộng là dựa theo cơ sở của phương pháp Sanger. Khi sợi DNA ựược tổng hợp sẽ sử dụng các nucleotide có gắn thuốc nhuộm huỳnh quang, các nucleotide khác nhau tiếp nhận thuốc nhuộm huỳnh quang khác nhau khi ựọc bằng tia laser cho hiển thị màu tương ứng trong ựó Adenin cho màu ựỏ, Thymine cho màu xanh, Guanine cho màu xanh lá cây, Cytosine cho màu ựen.
Quá trình thực hiện giải trình tự bao gồm các bước sau:
Tinh sạch sản phẩm của phản ứng RT-PCR bằng kắt QIAquck Purification Kit với các bước thực hiện theo hướng dẫn như sau:
Bước 1: Cho vào ống Eppendorff sản phẩm phản ứng RT-PCR và dung dịch PB theo tỷ lệ 1:5 sau ựó trộn ựều.
Bước 2: Cho hỗn hợp ựã trộn vào cột QIA, ựem ly tâm 13.000 vòng/phút trong vòng 1 phút. Bỏ dung dịch ở ựáy ống.
Bước 3: Cho 750ộl PE vào cột QIA, ựem ly tâm 13.000 vòng/phút trong vòng 1 phút. Bỏ dung dịch ở ựáy ống. Tiếp tục ly tâm 13.000 vòng/phút trong vòng 1 phút.
Bước 4: Chuyển cột sang ống Eppendorff mới. Cho thêm 50 ộl EB vào giữa màng, ựể 1 phút ở nhiệt ựộ phòng. Sau ựó ựem ly tâm 13.000 vòng/phút trong vòng 1 phút (có thể lặp lại 1 lần nữa ựể ựảm bảo lấy hết ADN).
Bước 5: Bỏ cột, lấy dung dịch ở ống eppendorff (DNA tinh khiết).
Phản ứng PCR sequence (Phản ứng PCR giải trình tự): Chuẩn bị phản ứng trong ống PCR 0,2ml theo bảng sau:
Thành phần Thể tắch cho 1 phản ứng (ộl)
DTCS Quick Start Master Mix 8,0
DNA 0,5
Primer 2,0
dH2O 9,5
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 35 để giải trình tự ựoạn gen H với ựộ dài lên tới 2100 nucleotide, trong khi máy giải trình tự tự ựộng CEQ 8000 của phòng thắ nghiệm Trọng ựiểm công nghệ sinh học Thú y Ờ khoa Thú y chỉ cho kết quả chắnh xác và tin cậy khi giải trình tự các ựoạn gen có ựộ dài 700 Ờ 800 nucleotide. Do vậy, trong quá trình thực hiện phản ứng PCR sequence chúng tôi phải sử dụng các ựoạn mồi Internal sequence. Như vậy phản ứng PCR sequence ựược tiến hành với từng ựoạn mồi (mồi xuôi, mồi ngược, mồi Internal sequence) (Lan và cs, 2006):
Tên mồi Kắ hiệu mồi Trình tự mồi (5Ỗ→ 3Ỗ)
Mồi xuôi CDVff1 TCGAAATCCTATGTGAGATCACT
Mồi ngược CDV- HS2 ATGCTGGAGATGGTTTAATTCAATCG
Internal CDV Ờ HS1 AACTTAGGGCTCAGGTAGTCC
Internal CDV- H for D GAACCTGGCTTCCTTGTGTGTAG
Internal CDV Ờ Hr2 GTTCTTCTTGTTTCTCAGAGG
Với chương trình chạy PCR giải trình tự sau:
Bước tổng hợp Nhiệt ựộ (0C) Thời gian Số chu kỳ
Biến tắnh chuỗi DNA 960C 20 giây
30 chu kỳ
Gắn mồi 500C 20 giây
Kéo dài chuỗi DNA 600C 4 phút
Giữ sản phẩm ở 40C Tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tự
Sản phẩm của phản ứng PCR sequence sẽ ựược tinh sạch bằng Ethanol kèm theo hóa chất và hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất (Beckman Coulter- Mỹ) Các bước tinh sạch sản phẩm như sau:
Bước 1: Sản phẩm của phản ứng PCR sequence sẽ ựược hỗn hợp với 2ộl Sodium acetate, 2ộl EDTA Na và 1 ộl glycogen.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 36
Bước 2: Bổ sung 60 ộl cồn 1000 trong ựiều kiện lạnh và tiến hành ly tâm 14000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C, loại bỏ dịch nổi trên ống và giữ lại cặn DNA.
Bước 3: Bổ sung 200ộl cồn 750 lạnh, tiến hành ly tâm ở 14000vòng/phút trong 2 phút ở 40C, loại bỏ dịch nổi và giữ lại cặn.
Bước 4: Lặp lại bước 3 một lần nữa và ựể DNA khô tự nhiên hoặc ựặt trong máy quay khô chân không.
Bước 5: Bổ sung 40ộl SLS vào mỗi mẫu và trộn ựều.
Sản phẩm sau khi tinh sạch ựược chuyển vào ựĩa chạy mẫu ựể tiến hành giải trình tự.
k) Phương pháp xử lý số liệu
Phân tắch xác nhận chuỗi gen thu ựược thông qua chương trình Blast trên Ngân hàng gen (GenBank) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Truy cập ngân hàng gen thu nhận và xác ựịnh sự tương ựồng về nucleotide của các chuỗi gen tương ứng của virus với các phân ựoạn gen thu ựược trong nghiên cứu. Thành phần axit amin của kháng nguyên virus ựược thu nhận bằng cách sử dụng bộ mã của vi sinh vật bậc thấp (Bộ mã vi khuẩn Ờ bacterial code) có trong ngân hàng gen và so sánh thông qua chương trình Genetyx. Xác ựịnh nguồn gốc phả hệ phát sinh chủng loại trên cơ sở trình tự gen của chủng virus thu nhận ựược bằng phần mềm ClustalW.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 37