2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.8.2. Giải trình tự gen theo phương pháp Dideoxy
Ớ Nguyên lý
Xác ựịnh trình tự gen theo phương pháp dideoxy do Frederick Sanger (F.Sanger), Smith và Coulson phát hiện năm 1977 (còn gọi là phương pháp giải trình tự gen bằng enzym hay phương pháp Sanger) dựa trên cơ chế tổng hợp DNA trong cơ thể sinh vật F.Sanger ựã giải trình tự hoàn chỉnh bộ gen của thực khuẩn thể X174 kắ sinh vi khuẩn E.Coli (1977) là bộ gen ựầu tiên ựược xác ựịnh trình tự. Trong phương pháp này tác giả sử dụng các nhân tố kết thúc ựặc hiệu quá trình kéo dài DNA khi tổng hợp. nhân tố này là 2,3 dideoxynucleosid triphosphat (ddNTP). Các phân tử này (ddNTP) có thể kết hợp vào chuỗi DNA ựang tổng hợp một cách bình thường qua nhóm 5 triphosphat nhưng lại không tiếp tục kết hợp ựược với phân tử deoxynucleosid triphosphat (dNTP) tiếp theo. Như vậy khi trộn một lượng nhỏ ddNTP với 4 loại dNTP rồi tiến hành tổng hợp DNA nhờ enzym polymerase. Kết quả sẽ cho một loạt các ựoạn DNA ựược kết thúc một cách ựặc hiệu bởi gốc dideoxynucleotide và sẽ thu ựược các ựoạn DNA có kắch thước hơn kém nhau 1 nucleotide. Chạy ựiện di các ựoạn có thể xác ựịnh ựược trình tự ựoạn DNA nghiên cứu.
Ớ Các bước thực hiện
Bước 1: Biến tắnh DNA khuôn, ựiện di trên gel polyacrylamid (có bổ sung ure) thu các mạch ựơn DNA
Bước 2: Chuẩn bị phản ứng tổng hợp DNA
Lấy 4 ống eppendorff, cho các thành phần cần thiết vào mỗi ống (DNA khuôn, mồi có ựánh dấu phóng xạ, enzym DNA polymerase và các dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) và dung dịch ựệm thắch hợp). bổ sung vào mỗi ống
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 27 tương ứng một lượng nhỏ (1%) các loại ddNTP nhất ựịnh (ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP).
Bước 3: Thực hiện phản ứng tổng hợp DNA với các thiết bị tuần hoàn nhiệt.
Bước 4: điện di kết quả, so sánh các kết quả các chuỗi mạch ựơn DNA ựược tổng hợp ựể xác ựịnh trình tự của mạch khuôn.
Phương pháp giải trình tự gen do F.Sanger và cộng sự phát minh có ựộ chắnh xác tương ựối cao, là cơ sở hoạt ựộng của các máy giải trình tự gen tự ựộng.