2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.6.3. Chẩn ựoán trong phòng thắ nghiệm
Tìm thể Lents
Lấy mẫu bệnh phẩm là dịch niêm mạc mắt hay mũi của chó bị bệnh, làm tiêu bản, ựem nhuộm Hematoxilin Ờ Eosin (HE), tìm tiểu thể Lents bằng kắnh hiển vi. Cần chú ý, ở não, thể Lents rất giống thể Negri ở bệnh dại (Blixenkrone-Moller et al., 1993).
Chẩn ựoán virus học
Tiêm truyền bệnh phẩm cho ựộng vật thắ nghiệm
Mẫu bệnh phẩm là lách, gan, phổi... của chó nghi mắc bệnh ựem nghiền, sau ựó bổ sung PBS ựể chế thành huyễn dịch và tiêm cho ựộng vật thắ nghiệm. Ưu tiên sử dụng chồn hoặc chó non, ngoài ra có thể tiêm cho chuột lang, chuột nhắt trắng, thỏ.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 19 khám quan sát bệnh tắch ựại thể và kết luận.
Phân lập virus trên môi trường tế bào
Mẫu bệnh phẩm ựem nghiền thành huyễn dịch, xử lý kháng sinh, ly tâm lấy nước trong và lọc qua màng lọc vi khuẩn rồi ựem gây nhiễm lên môi trường tế bào một lớp Vero-DST (tế bào thận khỉ xanh châu Phi có gắn receptor ựặc hiệu cho virus Care). Virus Care chỉ có thể nhân lên và gây bệnh tắch tế bào (Cyto pathogenic Effect - CPE) khi gây nhiễm lên tế bào phù hợp. Bệnh tắch tế bào do CDV gây ra có thể quan sát ựược là những thể hợp bào, tế bào bị phá hủy màng và xuất hiện nhiều thể vùi ở trung tâm vùng tế bào xuất hiện CPE.
Sự xuất hiện nhiều hay ắt, nhanh hay chậm của CPE phụ thuộc vào số lượng, ựộc lực của virus và ỘtuổiỢ tế bào. Tế bào mới nuôi cấy thì virus gây nhiễm dễ dàng hơn, CPE xuất hiện nhanh và nhiều hơn ở những tế bào ựã nuôi cấy nhiều ngày (Lan và cs, 2005).
Chẩn ựoán bằng phản ứng miễn dịch ựánh dấu enzym (ELISA)
ELISA(Enzim linked Immuno Sorbent Assay) là một phương pháp xét nghiệm miễn dịch dựa trên cơ chế kết quả ựặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, có sử dụng kháng thể có gắn enzyme và chất phát quang nhằm phát hiện ra sự kết hợp ựó (Nguyễn Bá Hiên và Trần Thị Lan Hương, 2009).
Chẩn ựoán bằng phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch
Nhuộm hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry - IHC) là phương pháp có ựộ chắnh xác cao cho phép phát hiện kháng nguyên tồn tại trong tổ chức. Phương pháp này ựược thực hiện dựa trên nghuyên lý là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể ựặc hiệu và ựược phát hiện bằng chất chỉ thị màu (Nguyễn Hữu Nam, 2011).
Chẩn ựoán bệnh bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang
Phản ứng miễn dịch huỳnh quang IF (Immuno fluorescent test) có ựộ chắnh xác cao, dùng chất ựánh dấu là chất phát huỳnh quang (khi hấp thụ 1 ánh
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 20 sáng có bước sóng nhất ựịnh sẽ phát ra 1 ánh sáng có bước sóng dài hơn). Phương pháp này ựược thực hiện dựa trên nguyên lý: khi dùng kháng thể hoặc kháng kháng thể ựã ựược nhuộm bằng chất phát huỳnh quang, rồi cho kết hợp với kháng nguyên Ờ kháng thể khi soi dưới kắnh hiển vi huỳnh quang sẽ phát sáng (Nguyễn Bá Hiên và Trần Thị Lan Hương, 2010).
Phản ứng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp
Trong phản ứng này thường dùng kháng thể ựặc hiệu nhuộm chất phát huỳnh quang ựể phát hiện kháng nguyên chưa biết.
Phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp
Dùng kháng kháng thể ựược nhuộm chất phát huỳnh quang ựể phát hiện kháng nguyên chưa biết.
Chẩn ựoán phát hiện RNA của virus Care bằng RT- PCR
Phương pháp RT-PCR (Reverse Transcription Polymesase Chain Reaction) là sự kết hợp giữa phương pháp phiên mã ngược và phương pháp PCR. Phương pháp này có thể phát hiện các RNA tồn tại với lượng rất thấp mà khó có thể phát hiện bằng phương pháp khác.
Do Taq polymerase sử dụng trong PCR không hoạt ựộng trên RNA nên trước hết cần chuyển RNA thành cDNA, nhờ enzyme phiên mã ngược Reverse Transcriptase (RT). Sau ựó, cDNA này sẽ ựược khuếch ựại nhờ Taq polymerase. Dấu hiệu xác ựịnh bệnh là sản phẩm nhân bản một ựoạn gen ựặc hiệu của virus. Sự hiện diện của sản phẩm này ựược nhận biết qua ựiện di trên gel agarose (Lan và cs, 2008).
Chẩn ựoán phát hiện bệnh Care bằng kit chẩn ựoán nhanh
Hiện nay, nhiều phòng khám thú y sử dụng phương pháp xét nghiệm nhanh bằng thiết bị thiết kế sẵn, ựơn giản, tiện dụng và có ựộ chắnh xác cao.
Về bản chất, ựây là phương pháp xét nghiệm ELISA ựể phát hiện kháng nguyên của virus Care trong máu, nước mắt và nước mũi của chó. Hai kháng thể
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 21 ựơn dòng trong thiết bị sẽ kết hợp ựặc hiệu với các nhóm quyết ựịnh kháng nguyên khác nhau của virus Care. Sau khi cho bệnh phẩm vào vị trắ ựệm Cellulose của thiết bị, virus Care sẽ kết hợp với kháng thể ựơn dòng thứ nhất. Rồi phức hợp này kết hợp với kháng thể ựơn dòng khác trong màng nitơ - cellulose của thiết bị ựể tạo thành hợp chất kép hoàn chỉnh. Kết quả xét nghiệm ựược biểu hiện qua các vạch do thiết bị sử dụng theo phương pháp Ộsắc ký miễn dịchỢ.
Ưu ựiểm của thiết bị này là có ựộ nhạy cao, có thể chẩn ựoán bệnh sớm trong thời gian ựầu của bệnh, khi mà các triệu chứng lâm sàng chưa thể hiện rõ. Mặt khác phương pháp này dễ dàng thực hiện với nhiều loại mẫu bệnh phẩm như huyết tương, huyết thanh, nước mắt và nước mũi. đọc kết quả phản ứng sau 5 - 10 phút.