2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.8.1. Giải trình tự gen theo phương pháp Maxam và Gilbert
Ớ Nguyên lý:
Năm 1977 Alan Maxam và Walter Gilbert phát minh phương pháp giải trình tự gen theo phương pháp hóa học. Tạo mạch khuôn DNA theo cơ sở ựánh
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 25 dấu ựồng vị phóng xạ P32 ựầu 5Ỗ và biến tắnh phân tử DNA thành các mạch ựơn không tự xoắn lại với nhau. Các mạch ựơn ựã ựánh dấu phóng xạ ựược cho vào các ống nghiệm khác nhau, thực hiện kỹ thuật xử lý hóa học ựặc hiệu ựể phân cắt các mạch ựơn thành các ựoạn ngắn hơn kém nhau 1 nucleotide. Cuối cùng ựiện di sản phẩm phân giải DNA thu ựược trong gel polyacrylamide. Di ựộng của các ựoạn DNA trong ựiện trường phụ thuộc vào ựộ dài của chúng nhờ ựó xác ựịnh ựược trình tự nucleotide. Phương pháp này hầu như không ựược sử dụng ngày nay do ựộ chuẩn xác kém, cần phải thực hiện nhiều lần và loại bỏ các sai sót ựể chọn một kết quả gần ựúng nhất nhưng nó là tiền ựề cho các phương pháp giải trình tự khác.
Ớ Các bước thực hiện
Bước 1: đánh dấu ựồng vị phóng xạ P32 ựầu 5Ỗ của mạch khuôn, biến tắnh và ựiện di tách lấy 1 mạch DNA làm mạch khuôn ựể xử lý hóa học
Bước 2: Thực hiện các phản ứng hóa học ựặc hiệu
Có thể sử dụng 4-5 ống nghiệm ựể thực hiện các phản ứng hóa học ựặc hiệu khác nhau
Ống Xử lý ựặc hiệu Vị trắ cắt
1 Dimethyl sunfat cắt tại G
2 Axit pH= 2 cắt tại A và G
3 Hydrazin cắt tại C và T
4 Hydrazin + NaCl cắt tại C
Trong mỗi ống nghiệm có hàm lượng nhất ựịnh các mạch ựơn DNA khuôn ựã ựánh dấu phóng xạ và ựược xử lý hóa học ựặc hiệu khác nhau tạo ra các ựoạn DNA bị cắt dài ngắn khác nhau
Bước 3: Lấy sản phẩm xử lý trong mỗi ống nghiệm ựem chạy ựiện di, hiện hình phóng xạ và xác ựịnh kết quả.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 26 Bước 4: Tập hợp kết quả thu ựược ở tất cả các ống nghiệm, thu ựược các ựoạn polynucleotide dài ngắn hơn kém nhau 1 nucleotide từ ựó xác ựịnh ựược trình tự của ựoạn DNA khuôn.