2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.7.Phòng và ựiều trị bệnh
2.7.1. Phòng bệnh
Phòng bệnh bằng vệ sinh
Nuôi dưỡng, chăm sóc tốt, cho chó ăn ựầy ựủ dinh dưỡng và vệ sinh sạch sẽ nơi ở của chó là những biện pháp tốt ựể tăng sức ựề kháng tự nhiên của cơ thể chó ựối với bệnh.
Những chó ốm phải nuôi cách ly, chuồng chó ốm phải tiêu ựộc bằng thuốc sát trùng, xử lý chất bài tiết và thức ăn nước uống thừa của chó bệnh.
Chó mới mua về phải kiểm tra kỹ hồ sơ, nuôi cách ly, theo dõi ắt nhất 10 ngày, nếu không thấy có biểu hiện của bệnh mới cho nhập ựàn.
Phòng bệnh bằng tiêm phòng vacxin
Tiêm vacxin là biện pháp phòng bệnh phổ biến hiện nay ựối với các bệnh do virus gây ra nói chung, trong ựó có bệnh Care. Vacxin phòng bệnh Care ựược tiêm lần ựầu cho chó lúc 2 tháng tuổi, trong những trường hợp chó có nguy cơ lây nhiễm cao thì có thể tiêm phòng sớm hơn. Tiêm nhắc lại sau mũi ựầu tiên 2
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 22 ựến 4 tuần. Sau ựó, tiêm nhắc lại mỗi năm một lần ựể ựảm bảo khả năng bảo hộ. Theo Greene và Appel (1987), Kháng thể thụ ựộng truyền qua nhau thai và sữa ựầu có tác dụng bảo vệ cho chó con sau sinh và cai sữa. Lượng kháng thể giảm một nửa sau 8.4 ngày. Có 3% kháng thể truyền qua nhau thai và 97% truyền qua sữa ựầu, kết quả cho thấy rằng hiệu giá ban ựầu ở chó con mới sinh bằng 77% lượng kháng thể ở con mẹ. Nếu không có sự hấp thu sữa ựầu chó con có thể ựược bảo vệ ắt nhất 1 - 4 tuần. Kháng thể bị ựộng hấp thu từ sữa mẹ thường biến mất sau 12 - 14 tuần tuổi.
Chó khỏi bệnh sau khi mắc bệnh tự nhiên hoặc ựược tiêm vacxin, miễn dịch có thể kéo dài hàng năm. Sự bảo vệ ựó có thể ựược bảo ựảm nếu chó không bị phơi nhiễm với virus ựộc lực cao, số lượng lớn, stress. Sau khi tiêm một mũi ựơn vacxin Care cho chó chưa ựược tiêm bất kỳ một mũi vacxin phòng bệnh Care nào thì hiếm khi tạo ra ựược miễn dịch kéo dài quá 1 năm. Vì lý do này, mặc dù có kháng thể thụ ựộng từ sữa ựầu của chó mẹ thì chó con phải ựược tiêm ắt nhất 2 mũi vacxin phòng bệnh Care cách nhau 2 - 4 tuần khi chó con ựược 2 tháng tuổi. Chó trưởng thành vẫn có thể bị nhiễm Care, vì vậy phải tiêm vacxin phòng bệnh Care ựịnh kỳ mỗi năm 1 lần.
Lượng kháng thể sẽ giảm dần sau khi lượng kháng thể ựạt ngưỡng tối ựa nhưng ngưỡng bảo hộ của vacxin phòng bệnh Care có thể kéo dài ắt nhất 1 năm. Vacxin vô hoạt không tạo ra ựược miễn dịch ựầy ựủ ựể chống lại bệnh sau khi công cường ựộc nhưng nó vẫn có tác dụng bảo hộ tốt hơn so với chó không ựược tiêm vacxin. Nhưng hiện nay vacxin vô hoạt vẫn ựược bán và sử dụng trên thị trường. Vacxin vô hoạt thường bị mất một vài gluco-protein bề mặt do vậy không tạo ra ựáp ứng miễn dịch khi công cường ựộc.
Mặc dù ựã có những thành công khi tiêm vacxin phòng bệnh Care nhưng nhiều nghiên cứu cho thấy chó khỏi bệnh Care sau khi nhiễm bệnh tự nhiên hoặc
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 23 cho tiếp xúc lâu dài với virus Care không còn ựộc lực thì chó vẫn có ựáp ứng miễn dịch.
Sự nhiễm Parvovirus vẫn ựược cho là nguyên nhân làm giảm khả năng sản sinh kháng thể của chó khi tiêm vacxin phòng bệnh Care. đồng thời việc chủng vacxin chống bệnh do Parvovirrus cũng ựược cho là gây ức chế ựáp ứng miễn dịch khi tiêm ựồng thời với vacxin phòng bệnh Care. Những minh chứng về ựiều này còn chưa ựầy ựủ nên ựược nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâ (Greene and Appel, 1987).
Hiện nay, trên thị trường thuốc thú y Việt Nam, vacxin phòng bệnh Care cho chó khá phong phú về chủng loại do doanh nghiệp trong nước sản xuất và nhập khẩu từ nước ngoài. Thống kê từ danh mục vacxin và chế phẩm sinh học ựược phép nhập khẩu năm 2008 cho thấy có tới 17 loại vacxin phòng Care và 1 loại kháng huyết thanh (Homoserum - Merial, Pháp) ựể phòng và trị bệnh này. Trong ựó có sự tham gia của những tên tuổi lớn như Intervet- Hà Lan, Merial- Pháp, Biocan - Cộng hòa Séc, PFRIZER - Mỹ, Fort Dodge Animal Health - Mỹ. Xắ nghiệp Thuốc thú y trung ương (Vetvaco) ựã chế ựược vacxin phòng bệnh Care từ chủng virus nhược ựộc ựông khô, sản xuất qua môi trường tế bào xơ phôi gà một lớp, mỗi liều chứa tối thiểu 103 TCID50 virus.
2.7.2. điều trị
Dùng kháng huyết thanh: liều 15 Ờ 30 ml/con, tiêm sớm. Khi con vật ựã có triệu chứng viêm phổi hay triệu chứng thần kinh thì kháng huyết thanh không có tác dụng.
Ở các cơ sở ựiều trị theo các bước sau ựây:
Cắt nôn bằng cách tiêm atropin hay primeran 2 ml, tiêm dưới da.
Bổ sung nước và chất ựiện giải bằng cách cho uống Ozeron 5%, tiêm nước muối sinh lý 0,9% hay nước ựường Glucoza 5% vào tĩnh mạch khoeo của chó.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 24 Cầm ỉa chảy bằng cách cho uống thuốc ựặc trị tiêu chảy chó mèo Imodium uống 1 viên (chó to hay bé ựều uống 1 viên) sau 12h mà chó vẫn tiêu chảy thì uống tiếp viên thứ 2; Bisepton: uống nửa viên ựối với chó nhỏ, chó to uống 1 viên, uống cho tới khi khỏi tiêu chảy; Hampiseptol: tiêm bắp 1ml/ 10 kgP.
Chống kế phát vi khuẩn bằng cách tiêm các loại kháng sinh: Gentamycin: tiêm bắp liều 8 Ờ 10 mg/kgP, 2 lần/ ngày; Streptomycin: tiêm bắp liều 10 Ờ 20 mg/kgP, 2 lần/ ngày.
An thần cho chó: dùng các loại thuốc có tắnh chất an thần như: Seduxen: chó nhỏ uống 1 viên/ ngày, chó to 2 viên/ngày trong 3 ngày; Meprobamat: chó nhỏ uống 1 viên/ ngày, chó to 2 viên/ngày trong 3 ngày.
Trợ sức, trợ lực cho chó: sử dụng các thuốc trợ tim mạch, trợ sức, trợ lực, cầm máu cho chó như: Cafein, Spartein, Vitamin B1, Vitamin B12, Vitamin K, Vitamin C.
2.8. Kỹ thuật giải trình tự gen
Giải trình tự gen (DNA sequencing) là phương pháp xác ựịnh vị trắ sắp xếp các nucleotide trong phân tử DNA. Giải trình tự bộ gen người, ựộng vật và vi sinh vật giúp chẩn ựoán bệnh tật và nhiều ứng dụng trong thực tiễn sản xuất, phục vụ lợi ắch con người. Có 3 nhóm phương pháp giải trình gen chủ yếu: Phương pháp Maxam và Gilbert, phương pháp Dideoxy (còn gọi là phương pháp Sanger) và phương pháp giải trình tự gen bằng máy tự ựộng.
2.8.1. Giải trình tự gen theo phương pháp Maxam và Gilbert
Ớ Nguyên lý:
Năm 1977 Alan Maxam và Walter Gilbert phát minh phương pháp giải trình tự gen theo phương pháp hóa học. Tạo mạch khuôn DNA theo cơ sở ựánh
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 25 dấu ựồng vị phóng xạ P32 ựầu 5Ỗ và biến tắnh phân tử DNA thành các mạch ựơn không tự xoắn lại với nhau. Các mạch ựơn ựã ựánh dấu phóng xạ ựược cho vào các ống nghiệm khác nhau, thực hiện kỹ thuật xử lý hóa học ựặc hiệu ựể phân cắt các mạch ựơn thành các ựoạn ngắn hơn kém nhau 1 nucleotide. Cuối cùng ựiện di sản phẩm phân giải DNA thu ựược trong gel polyacrylamide. Di ựộng của các ựoạn DNA trong ựiện trường phụ thuộc vào ựộ dài của chúng nhờ ựó xác ựịnh ựược trình tự nucleotide. Phương pháp này hầu như không ựược sử dụng ngày nay do ựộ chuẩn xác kém, cần phải thực hiện nhiều lần và loại bỏ các sai sót ựể chọn một kết quả gần ựúng nhất nhưng nó là tiền ựề cho các phương pháp giải trình tự khác.
Ớ Các bước thực hiện
Bước 1: đánh dấu ựồng vị phóng xạ P32 ựầu 5Ỗ của mạch khuôn, biến tắnh và ựiện di tách lấy 1 mạch DNA làm mạch khuôn ựể xử lý hóa học (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bước 2: Thực hiện các phản ứng hóa học ựặc hiệu
Có thể sử dụng 4-5 ống nghiệm ựể thực hiện các phản ứng hóa học ựặc hiệu khác nhau
Ống Xử lý ựặc hiệu Vị trắ cắt
1 Dimethyl sunfat cắt tại G
2 Axit pH= 2 cắt tại A và G
3 Hydrazin cắt tại C và T
4 Hydrazin + NaCl cắt tại C
Trong mỗi ống nghiệm có hàm lượng nhất ựịnh các mạch ựơn DNA khuôn ựã ựánh dấu phóng xạ và ựược xử lý hóa học ựặc hiệu khác nhau tạo ra các ựoạn DNA bị cắt dài ngắn khác nhau
Bước 3: Lấy sản phẩm xử lý trong mỗi ống nghiệm ựem chạy ựiện di, hiện hình phóng xạ và xác ựịnh kết quả.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 26 Bước 4: Tập hợp kết quả thu ựược ở tất cả các ống nghiệm, thu ựược các ựoạn polynucleotide dài ngắn hơn kém nhau 1 nucleotide từ ựó xác ựịnh ựược trình tự của ựoạn DNA khuôn.
2.8.2. Giải trình tự gen theo phương pháp Dideoxy
Ớ Nguyên lý
Xác ựịnh trình tự gen theo phương pháp dideoxy do Frederick Sanger (F.Sanger), Smith và Coulson phát hiện năm 1977 (còn gọi là phương pháp giải trình tự gen bằng enzym hay phương pháp Sanger) dựa trên cơ chế tổng hợp DNA trong cơ thể sinh vật F.Sanger ựã giải trình tự hoàn chỉnh bộ gen của thực khuẩn thể X174 kắ sinh vi khuẩn E.Coli (1977) là bộ gen ựầu tiên ựược xác ựịnh trình tự. Trong phương pháp này tác giả sử dụng các nhân tố kết thúc ựặc hiệu quá trình kéo dài DNA khi tổng hợp. nhân tố này là 2,3 dideoxynucleosid triphosphat (ddNTP). Các phân tử này (ddNTP) có thể kết hợp vào chuỗi DNA ựang tổng hợp một cách bình thường qua nhóm 5 triphosphat nhưng lại không tiếp tục kết hợp ựược với phân tử deoxynucleosid triphosphat (dNTP) tiếp theo. Như vậy khi trộn một lượng nhỏ ddNTP với 4 loại dNTP rồi tiến hành tổng hợp DNA nhờ enzym polymerase. Kết quả sẽ cho một loạt các ựoạn DNA ựược kết thúc một cách ựặc hiệu bởi gốc dideoxynucleotide và sẽ thu ựược các ựoạn DNA có kắch thước hơn kém nhau 1 nucleotide. Chạy ựiện di các ựoạn có thể xác ựịnh ựược trình tự ựoạn DNA nghiên cứu.
Ớ Các bước thực hiện
Bước 1: Biến tắnh DNA khuôn, ựiện di trên gel polyacrylamid (có bổ sung ure) thu các mạch ựơn DNA
Bước 2: Chuẩn bị phản ứng tổng hợp DNA
Lấy 4 ống eppendorff, cho các thành phần cần thiết vào mỗi ống (DNA khuôn, mồi có ựánh dấu phóng xạ, enzym DNA polymerase và các dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) và dung dịch ựệm thắch hợp). bổ sung vào mỗi ống
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 27 tương ứng một lượng nhỏ (1%) các loại ddNTP nhất ựịnh (ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP).
Bước 3: Thực hiện phản ứng tổng hợp DNA với các thiết bị tuần hoàn nhiệt.
Bước 4: điện di kết quả, so sánh các kết quả các chuỗi mạch ựơn DNA ựược tổng hợp ựể xác ựịnh trình tự của mạch khuôn.
Phương pháp giải trình tự gen do F.Sanger và cộng sự phát minh có ựộ chắnh xác tương ựối cao, là cơ sở hoạt ựộng của các máy giải trình tự gen tự ựộng.
2.8.3. Giải trình tự gen bằng máy tự ựộng
Ớ Nguyên lý
Máy giải trình tự gen bán tự ựộng hoặc tự ựộng hoàn toàn ựược thiết kế trên nguyên tắc sử dụng ddNTP do F.Sanger và cộng sự phát minh.
Trong quá trình tổng hợp DNA có sử dụng các mồi và dNTP ựánh dấu huỳnh quang thay cho ựánh dấu phóng xạ, mỗi loại dNTP ựược ựánh dấu huỳnh quang khác nhau nên sẽ biểu thị các màu sắc khác nhau.
Máy thực hiện tổng hợp các mạch ựơn DNA mới trên cả 2 mạch khuôn DNA, ựồng thời sử dụng các phần mềm tắnh toán trên máy tắnh ựể xử lý kết quả giúp kiểm soát ựược các sai sót ựảm bảo ựộ chắnh xác cao.
Ớ Các bước thực hiện
Bước 1: Chuẩn bị DNA khuôn.
Bước 2: Chuẩn bị các ựiều kiện cần thiết cho phản ứng tổng hợp DNA và thực hiện nhân DNA bằng thiết bị PCR.
Bước 3: Nạp sản phẩm PCR vào máy giải trình tự gen và chạy máy. Trong quá trình hoạt ựộng của máy, các nucleotide ựược kiểm soát nhờ detecter báo về bộ phận xử lý của máy, phần mềm xử lý kết quả và vẽ ựồ thị của các loại nucleotide ựi qua detecter. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 28
Bước 4: Phân tắch kết quả từ các dữ liệu do máy tắnh cung cấp, so sánh kết quả xác ựịnh trình tự ở cả 2 mạch ựơn mới, ựồng thời căn cứ vào ựồ thị ựể sửa các sai sót. Và chọn kết quả chắnh xác nhất.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 29
3. đỐI TƯỢNG - NỘI DUNG Ờ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. đối tượng nghiên cứu
đối tượng nghiên cứu của ựề tài là các chó mắc bệnh Care, 03 chủng virus Care ựược phân lập từ chó nuôi tại Hà Nội và vùng phụ cận.
3.2. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu lựa chọn mẫu virus Care cho nghiên cứu.
- Thực hiện giải trình tự ựoạn gen H của 3 chủng virus Care nghiên cứu. - So sánh trình tự nucleotide của ựoạn gen H của 3 chủng virus Care nghiên cứu và chủng virus vacxin.
- So sánh trình tự axit amin của ựoạn gen H của 3 chủng virus Care nghiên cứu và chủng virus vacxin.
- Xây dựng cây sinh học phân tử thể hiện mối quan hệ di truyền của 3 chủng virus Care ựang lưu hành tại Hà Nội và vùng phụ cận.
3.3. Phương pháp nghiên cứu
để tiến hành nghiên cứu và thực hiện ựược các nội dung ựã ựề ra của ựề tài, chúng tôi ựã kết hợp những phương pháp nghiên cứu thường quy và hiện ựại trong lĩnh vực thú y.
a) Phương pháp quan sát, thống kê sinh học
để xác ựịnh ựược các triệu chứng lâm sàng chủ yếu của chó mắc Care, chúng tôi tiến hành quan sát, ghi chép, thống kê các biểu hiện của chó từ khi xuất hiện những dấu hiệu bệnh lý ựầu tiên. đồng thời dựa vào các ựặc ựiểm dịch tễ học, những can thiệp trong quá trình bệnh xảy ra cũng như thu thập các thông tin liên quan. Tiến hành phân tắch, thống kê ựể ựưa ra những kết quả chắnh xác. Xác ựịnh chắnh xác những triệu chứng lâm sàng chủ yếu có ý nghĩa vô cùng quan trọng cho các bước thắ nghiệm tiếp theo.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 30
b) Phương pháp mổ khám
Mổ khám ca bệnh nhằm xác ựịnh ựược các biến ựổi ựại thể của các cơ quan, tổ chức của chó mắc Care, cần tiến hành mổ khám những chó có biểu hiện triệu chứng lâm sàng của bệnh. Chó bệnh ựược cố ựịnh cẩn thận, thu dịch swab (các dịch tự nhiên của cơ thể như nhử mắt, nước mũi, dịch ngoáy hầu họng). Lột da và bộc lộ xoang ngực, xoang bụng, tách các cơ quan nội tạng khỏi cơ thể quan sát và chụp ảnh. Tiến hành thu mẫu các cơ quan như: phổi, hạch, tim, gan, lách, thận theo các mục ựắch nghiên cứu khác nhau.
c) Phương pháp tách chiết RNA
Các mẫu bệnh phẩm thu thập ựược của các chó nghi mắc bệnh Care ựược chúng tôi bảo quản trong ựiều kiện -800C. Tiến hành nghiền mẫu bệnh phẩm là hạch phổi, phổi rồi bổ sung thểm 1ml PBS trước khi thực hiện phương pháp tách chiết RNA ựể chản ựoán các chó mắc bệnh.
- Quy trình tách chiết ARN virus dùng KIT (Kắt tách chiết QIAamp viral RNA minikit) của hãng Qiagen các bước thực hiện theo hướng dẫn sau:
Bước 1: Cho 560ộl Buffer AVL vào ống eppendoft
Bước 2: Cho 140ộl mẫu vào ống trên. Votex trong 15 giây, ựể nhiệt ựộ phòng trong 10 phút, ly tâm thời gian ngắn.
Bước 3: Cho 560ộl Ethanol (96% - 100%) vào ống và votex trong 15 giây. Bước 4: Hút 630ộl mẫu trong ống vào cột QIA ựậy nắp và ly tâm 8.000 vòng/phút/2 phút, loại bỏ dung dịch phắa dưới ống, lặp lại bước 4 một lần nữa với phần mẫu còn lại.
Bước 5: Cho 500ộl AW1 vào cột QIA, ly tâm 8.000 vòng/phút/2 phút, loại