Tiêu chuẩn ngành 10 TCN 814-2006

Tiêu chuẩn ngành 10 TCN 814-2006 về quy trình chẩn đoán bệnh cúm gia cầm áp dụng để chẩn đoán bệnh Cúm gia cầm tại các phòng xét nghiệm chẩn đoán bệnh động vật. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN _  10TCN                    TIÊU CHUẨN NGÀNH 10TCN 814­2006 QUY TRÌNH CHẨN ĐỐN BỆNH CÚM GIA CẦM                                                                                                                                                      10TCN 814­2006 Hà Nội  ­ 2006 TIÊU CHUẨN NGÀNH                                                                                                         10 TCN 814­2006 QUY TRÌNH CHẨN ĐỐN BỆNH CÚM GIA CẦM                                               Protocol for avian influenza diagnosis (Ban hành kèm theo Quyết định số              QĐ/BNN­KHCN    ngày        tháng  12  năm 2006 của Bộ trưởng Bộ Nơng nghiệp và Phát triển nơng thơn) I Pham vi ap dung ̣ ́ ̣ Quy trinh nay đ ̀ ̀ ược ap dung đê chân đoan bênh Cum gia câm tai cac phong xet nghiêm ́ ̣ ̉ ̉ ́ ̣ ́ ̀ ̣ ́ ̀ ́ ̣   chân đoan bênh đông vât ̉ ́ ̣ ̣ ̣ II. Khai niêm ́ ̣ Bênh cum gia câm do virus cum type A, thuôc ho Orthomyxoviridae gây ra cho cac loai ̣ ́ ̀ ́ ̣ ̣ ́ ̀  gia câm va chim hoang da. Bênh co nhiêu dang khac nhau: co dang ty lê chêt rât cao, co dang ̀ ̀ ̃ ̣ ́ ̀ ̣ ́ ́ ̣ ̉ ̣ ́ ́ ́ ̣   không co triêu ch ́ ̣ ưng.  ́ Virus Cum type A co thê gây nhiêm cho gia câm, l ́ ́ ̉ ̃ ̀ ợn, ngựa va cac loai khac kê ca con ̀ ́ ̀ ́ ̉ ̉   ngươi. Virus cum type A co 16 subtype khang nguyên H (Haemaglutinin) va 9 subtype khang ̀ ́ ́ ́ ̀ ́   nguyên N (Neuraminidase). Sự  kêt h ́ ợp cua 2 loai khang nguyên bê măt nay tao nên nhiêu ̉ ̣ ́ ̀ ̣ ̀ ̣ ̀  chung virus cum khac nhau ̉ ́ ́ III. Lây mâu va bao quan  ́ ̃ ̀ ̉ ̉ Bênh phâm phat hiên virus la dich ngoay ô nh ̣ ̉ ́ ̣ ̀ ̣ ́ ̉ ớp, hong, khi quan (swab), cac phu tang ̣ ́ ̉ ́ ̉ ̣   (Nao, phôi, khi quan, lach,ruôt ) ̃ ̉ ́ ̉ ́ ̣ Bênh phâm phat hiên khang thê la huyêt thanh gia câm nghi nhiêm cum hoăc huyêt ̣ ̉ ́ ̣ ́ ̉ ̀ ́ ̀ ̃ ́ ̣ ́  thanh gia câm sau khi tiêm văc xin ̀ ́ Chi tiêt vê cach lây mâu va bao quan bênh phâm xem phân phu luc ́ ̀ ́ ́ ̃ ̀ ̉ ̉ ̣ ̉ ̀ ̣ ̣ IV. May moc – Dung cu – Hoa chât – Nguyên liêu ́ ́ ̣ ̣ ́ ́ ̣ 1. May moc ́ ́ * May moc chung ́ ́ o ­ Tu lanh âm ­15 đên ­20 ̉ ̣ ́ C ­ Tu lanh th ̉ ̣ ương +2 đên +8 ̀ ́ oC o ­ Tu âm 37 ̉ ́ C ­ Nôi đun cach thuy (water bath) ̀ ́ ̉ ­ Buông cây vô trung (BSC­Bio­safety cabinet) ̀ ́ ̀ ­ May hut chân không ́ ́ ­ May ly tâm lanh (ông 15 ml) ́ ̣ ́ ­ May trôn ông nghiêm (vortex mixer) ́ ̣ ́ ̣ ­ May ly tâm ông nho (microcentrifuge) ́ ́ ̉                                                                                                                                                      10TCN 814­2006 * May moc th ́ ́ ực hiên phan  ̣ ̉ ứng huyêt thanh hoc ́ ̣ ­ May lăc đia (orbital shaker) ́ ́ ̃ ­ May đoc ELISA ́ ̣ * May moc th ́ ́ ực hiên PCR ̣ ­ May nhân gien (Thermal cycler) ́ ­ May ly tâm spinner ́ ­ Hê thông điên di ̣ ́ ̣ ­ Hê thông chup anh điên di ̣ ́ ̣ ̉ ̣ ­ Buông thao tac PCR (PCR work station hoăc PCR chamber) ̀ ́ ̣ 2. Dung cu ̣ ̣: ­ Binh tam giac  ̀ ́ ­ Ống đong thuy tinh  ̉ ­ Côc co m ́ ́ ỏ ­ Ống nghiêm ̣ ­ Lo chăt huyêt thanh ̣ ́ ́ ­ Ống eppendorf 1,5 ml (Rnase/Dnase free) ­ Mang trôn chât phan  ́ ̣ ́ ̉ ưng (reagent trough) ́ ­ Pipet thuy tinh: 1, 5 va 10 ml ̉ ̀ ­ Micropipet đơn: 0,5­10, 5­40, 40­200, 200­1000 ml ­ Micropipet nhiêu đâu (8­12): 5­50, 50­300  ̀ ̀ ml ­ Đâu tip cac c ̀ ́ ́ ỡ 10, 20, 100, 200 va 1000 ̀ ml sử dung cho micropipet (co loc va không ̣ ́ ̣ ̀   loc) ̣ ­ Côi chay s ́ ̀ ứ ­ Dao, keo, panh kep ́ ̣ ­ Găng tay cao su không bôt hoăc găng nitrile ̣ ̣ ­ Đia 96 giêng đay ch ̃ ́ ́ ư V ̃ ­ Đen soi tr ̀ ưng ́ ­ Kim 22 G, 11/2 inch ­ Syringe 1 ml ­ Dui đuc tr ̀ ̣ ưng ́ ­ Keo dań 3. Hoa chât ́ ́ * Hoa chât thông th ́ ́ ường (hóa chất phân tích tinh khiết dành cho phòng thí nghiệm) ­ Nươc cât hoăc n ́ ́ ̣ ươc kh ́ ử ion ­ Na2HPO4 ­ NaH2PO4.H2O ­ Na Cl ­ HCl ­ NaOH * Hoa chât cho PCR ́ ́ ­ Côn Ethanol 70%, côn Ethanol tuyêt đôi ̀ ̀ ̣ ́ ­ Trizol® LS reagent hoăc Trizol® reagent ̣ ­ Chloroform ­ Isopropanol 4. Nguyên liêu  ̣                                                                                                                                                      10TCN 814­2006 4.1. Nguyên liêu cho phân lâp va phan  ̣ ̣ ̀ ̉ ưng HA, HI ́ ­ Trưng ga co phôi 9­ 10 ngay tuôi, khoe manh ́ ̀ ́ ̀ ̉ ̉ ̣ ­   Khang ́   huyêt́     chuân̉   H1­H16   (ví   dụ   khang ́   huyêt́     H5N1   A/Chicken/scot/59) ­ Khang nguyên chuân H1­H16 (vi du khang nguyên H5N1 Weybridge – UK) ́ ̉ ́ ̣ ́ ­ Men xử ly huyêt thanh RDE (Receptor Destroying Enzyme) ́ ́ ­ Hông câu ga 0,5% ̀ ̀ ̀ ­ Khang sinh ́ 4.2. Nguyên liêu cho RT­PCR ̣ ­ Kit chiêt tach RNA cua virus  ́ ́ ́ ̉ ­ Kit RT­PCR OneStep  ́ ­ Thach điên di ̣ ̣ ­ Marker (100 bp DNA ladder) ­ RNA đôi ch ́ ưng d ́ ương tinh ́ ­ PBS 0,01M pH 7,2 ­ Nươc cât đa x ́ ́ ̃ ử ly DEPC ́ Kiêm tra lâm sa ̉ ̀ng Đăc điêm dich tê ̣ ̉ ̣ ̃  hoc̣ V. Cac ph ́ ương phap chân đoan ́ ̉ ́ SƠ ĐỒ CHẨN ĐOÁN BỆNH CÚM GIA CẦM Lấy mẫu bênh phâm ̣ ̉ (huyế t thanh, swab, phu tang ) ̉ ̣ Phát hiên kha ̣ ́ng  thê ̉ (HI) Phát hiên virus ̣ Phân lâp virus ̣ RT­PCR (RRT­PCR) (­) (+) (­) Phân lâp lâ ̣ ̀n  Giám đinh  ̣ (HI) Phân lâp virus ̣ Kết luân bênh ̣ ̣ (+)                                                                                                                                                      10TCN 814­2006 1. Kiêm tra môt sô đăc điêm dich tê hoc, triêu ch ̉ ̣ ́ ̣ ̉ ̣ ̃ ̣ ̣ ưng – bênh tich ́ ̣ ́ 1.1. Môt sô đăc điêm dich tê hoc ̣ ́ ̣ ̉ ̣ ̃ Bênh Cum gia câm co tinh lây truyên rât nhanh va manh.  ̣ ́ ̀ ́ ́ ̀ ́ ̀ ̣ Chim hoang da đ ̃ ược coi la nguôn truyên lây mâm bênh. Chim măc bênh truyên virus ̀ ̀ ̀ ̀ ̣ ́ ̣ ̀   qua nươc dai, dich n ́ ̃ ̣ ươc mui va phân.  ́ ̃ ̀ Chim va gia câm mân cam co thê bi nhiêm bênh khi tiêp xuc tr ̀ ̀ ̃ ̉ ́ ̉ ̣ ̃ ̣ ́ ́ ực tiêp v ́ ới chim măć   bênh hoăc gian tiêp qua cac bê măt nhiêm bân ̣ ̣ ́ ́ ́ ̀ ̣ ̃ ̉ Ngoai ra môt sô loai khac cung co thê bi măc bênh: ng ̀ ̣ ́ ̀ ́ ̃ ́ ̉ ̣ ́ ̣ ười, lợn, ngựa 1.2 Triêu ch ̣ ưng ́ ­ Gia câm bi xu lông, u ru, bo ăn, giam đe ̀ ̣ ̀ ̉ ̃ ̉ ̉ ̉ ­ Đâu, măt s ̀ ̣ ưng, phu quanh măt. Mao, tich s ̀ ́ ̀ ́ ưng, xuât huyêt ́ ́ ­ Măt bi viêm kêt mac va co thê xuât huyêt ́ ̣ ́ ̣ ̀ ́ ̉ ́ ́ ­ Chân giưa vung ban va khuyu bi xuât huyêt ̃ ̀ ̀ ̀ ̉ ̣ ́ ́ ­ Co triêu ch ́ ̣ ưng hô hâp  ́ ́ ­ Con vât măc bênh th ̣ ́ ̣ ương chêt trong vong 24­48 gi ̀ ́ ̀ ờ sau khi xuât hiên cac triêu ́ ̣ ́ ̣   chưng đâu tiên ́ ̀ 1.3. Bênh tich ̣ ́ ­ Xuât huyêt tran lan  ́ ́ ̀ ở cac c ́ ơ quan nôi tang ̣ ̣ ­ Gia câm phu thung d ̀ ̀ ̃ ươi da vung đâu, cô va ng ́ ̀ ̀ ̉ ̀ ực ­ Miêng ch ̣ ưa nhiêu dich ́ ̀ ̣ ­ Khi quan xuât huyêt ch ́ ̉ ́ ́ ứa nhiêu dich nhay ̀ ̣ ̀ ­ Đương tiêu hoa xuât huyêt  ̀ ́ ́ ́ ­ Ga đe buông tr ̀ ̉ ̀ ứng xuât huyêt ́ ́ 2. Chân đoan phong thi nghiêm ̉ ́ ̀ ́ ̣ 2.1. Phat hiên khang nguyên ́ ̣ ́ 2.1.1. Phương phap phân lâp virus cum trên tr ́ ̣ ́ ứng ga co phơi ̀ ́ Phải thực hiện trong phòng thí nghiệm đảm bảo an tồn sinh học a. Chuân bi bênh phâm tr ̉ ̣ ̣ ̉ ươc khi phân lâp: ́ ̣ ­ Dich ngoay ô nh ̣ ́ ̉ ơp, hong, khi quan: ́ ̣ ́ ̉ + Lăc manh ông ch ́ ̣ ́ ưa tăm bông dich ngoay băng may lăc vortex mixer ́ ̣ ́ ̀ ́ ́                                                                                                                                                      10TCN 814­2006 + Bo tăm bông cua ông dich ngoay  ̉ ̉ ́ ̣ ́ + Bô sung 1/10 l ̉ ượng khang sinh đâm đăc 10X (xem phu luc), lăc đêu ́ ̣ ̣ ̣ ̣ ́ ̀ + Đê mâu lăng căn khoang 30 phut  ̉ ̃ ́ ̣ ̉ ́ ở nhiêt đô phong ̣ ̣ ̀ Mâu đa săn sang đê tiêm truyên ̃ ̃ ̃ ̀ ̉ ̀ ­ Tô ch ̉ ưc phu tang: ́ ̉ ̣ + Nghiên bênh phâm băng côi chay s ̀ ̣ ̉ ̀ ́ ̀ ứ vô trung thanh huyên dich 10% v ̀ ̀ ̃ ̣ ới dung dich ̣   vân chuyên hoăc băng PBS 0,01M pH7,2 ̣ ̉ ̣ ̀ + Bô sung 1/10 l ̉ ượng khang sinh đâm đăc, chuyên sang ông ly tâm. Ly tâm v ́ ̣ ̣ ̉ ́ ơi tôc đô ́ ́ ̣  400g (2.000 vong/phut) trong 10 phut ̀ ́ ́ + Thu dich nôi ̣ ̉ b. Tiên hanh phân lâp: ́ ̀ ̣ ­ Chon tr ̣ ưng co phôi 9­10 ngay tuôi khoe manh, 3 tr ́ ́ ̀ ̉ ̉ ̣ ưng/bênh phâm ́ ̣ ̉ ­ Lau trưng băng côn 70% va đuc lô nho phia trên buông h ́ ̀ ̀ ̀ ̣ ̃ ̉ ́ ̀ ­ Dung syringe 1 ml lăp kim va hut dich bênh phâm (đa x ̀ ́ ̀ ́ ̣ ̣ ̉ ̃ ử  ly ́ở  trên) tiêm vao xoang ̀   niêu mô v ̣ ơi l ́ ượng 0,2 ml/trưng ́ ­ Găn vêt tiêm băng keo dan ́ ́ ̀ ́ ­ Ấp trưng tiêp 2­3 ngay  ́ ́ ̀ ở nhiêt đô 37 ̣ ̣ 0C ­ Theo doi sau khi tiêm, soi tr ̃ ưng ngay 2 lân. Nh ́ ̀ ̀ ững trứng chêt đ ́ ược cât vao tu lanh ́ ̀ ̉ ̣   C đê kiêm tra ̉ ̉ c. Thu hoach n ̣ ươc tr ́ ưng sau khi phân lâp: ́ ̣ ­ Trưng chêt hoăc sông đ ́ ́ ̣ ́ ược cât vao tu lanh 4 ́ ̀ ̉ ̣ C qua đêm hoăc it nhât 4 gi ̣ ́ ́ ờ trươc khi ́   thu hoach ̣ ­ Lau trưng băng côn 70% ́ ̀ ̀ ­ Dùng syringe hút trực tiếp nước trứng bằng cách đâm kim qua vỏ ­ Thu dich niêu mô vao ông nghiêm. Thu hoach riêng tr ̣ ̣ ̀ ́ ̣ ̣ ứng sông va chêt ́ ̀ ́ 2.1.2. Giam đinh virus phân lâp ́ ̣ ̣ a. Kiêm tra n ̉ ươc tr ́ ưng băng phan  ́ ̀ ̉ ứng HA ­ Nho 25 µl PBS 0,01M vao đia 96 giêng ch ̉ ̀ ̃ ́ ữ V từ giêng th ́ ứ 1 đên giêng 12 cua mơi ́ ́ ̉ ̃  hang ̀ ­ Cho 25 µl dich niêu mơ vao giêng th ̣ ̣ ̀ ́ ư 1 ́ ­ Pha loang khang ngun băng cach chun 25 µl dich niêu mơ t ̃ ́ ̀ ́ ̉ ̣ ̣ ừ giêng th ́ ứ 1 sang   giêng th ́ ư 2 va tuân t ́ ̀ ̀ ự đên giêng 11 thi bo đi 25 µl ́ ́ ̀ ̉ ­ Nho thêm 25 µl PBS vao cac giêng ̉ ̀ ́ ́ ­ Nho 25 µl hơng câu ga 1% (v/v) vao tât ca cac giêng trên ̉ ̀ ̀ ̀ ̀ ́ ̉ ́ ́ ­ Lăc đia băng may hoăc băng tay ́ ̃ ̀ ́ ̣ ̀ ­ Ủ đia phan  ̃ ̉ ưng  ́ ở nhiêt đô phong 20 ̣ ̣ ̀ C, thơi gian khoang 40 phut hoăc 60 phut  nhiêt ̀ ̉ ́ ̣ ́ ̣  đô 4 ̣ C.  .    * Đoc kêt qua: ̣ ́ ̉ Hiêu gia HA cua virus đ ̣ ́ ̉ ược tinh  ́ ở đô pha loang cao nhât con co hiên t ̣ ̃ ́ ̀ ́ ̣ ượng ngưng kêt́  hông câu.  ̀ ̀ Vi du: Nêu  ́ ̣ ́ ở đô pha loang 1/128 con co ng ̣ ̃ ̀ ́ ưng kêt thi hiêu gia HA la 1/128.  ́ ̀ ̣ ́ ̀ ­ Nêu HA(+) d ́ ương tinh, ch ́ ưng to co virus. Tiêp tuc giam đinh băng phan  ́ ̉ ́ ́ ̣ ́ ̣ ̀ ̉ ưng HI v ́ ơí  khang huyêt thanh chuân cua môt sô subtype H virus Cum A va khang huyêt thanh chuân ́ ́ ̉ ̉ ̣ ́ ́ ̀ ́ ́ ̉   Newcastle đê xac đinh loai virus phân lâp ̉ ́ ̣ ̣ ̣ ­ Nêu HA(­) âm tinh, phôi chêt, co bênh tich phôi, lây n ́ ́ ́ ́ ̣ ́ ́ ước trứng tiêm truyên lân 2 ̀ ̀                                                                                                                                                      10TCN 814­2006 ­ Nêu HA(­) âm tinh, phôi phat triên binh th ́ ́ ́ ̉ ̀ ường, co thê tiêm lai hoăc không ́ ̉ ̣ ̣ Bao quan virus phân lâp đ ̉ ̉ ̣ ược ở – 70 C b. Giam đinh virus phân lâp băng phan  ́ ̣ ̣ ̀ ̉ ứng ngăn trở ngưng kêt hơng câu ­ HI ́ ̀ ̀   ­ Pha khang ngun 4HA/25 ́  µl: Lây đơ pha loang ci cung co phan  ́ ̣ ̃ ́ ̀ ́ ̉ ưng ng ́ ưng kêt́  hông câu chia cho 4.  ̀ ̀ Vi du:  Hiêu gia HA cua dich niêu mô la 1/128 ́ ̣ ̣ ́ ̉ ̣ ̣ ̀   Đơn vi 4 HA =  128: 4 = 32.  ̣ Như  vây se trôn 1 phân dich n ̣ ̃ ̣ ̀ ̣ ươc tr ́ ưng v ́ ơi 31 phân PBS đê đat đ ́ ̀ ̉ ̣ ược dung dich ̣   khang nguyên 4HA ́ ­ Chuân đô khang nguyên 4HA ̉ ̣ ́ : Sau khi pha, khang nguyên 4HA phai  đ ́ ̉ ược chuân đô ̉ ̣  lai. Tiên han nh ̣ ́ ̀ ư phan  ̉ ưng HA ́ ­ Tiên hanh phan  ́ ̀ ̉ ưng HI ́ : Trên 1 đia co thê tiên hanh phan  ̃ ́ ̉ ́ ̀ ̉ ưng HI v ́ ơi nhiêu khang ́ ̀ ́   huyêt thanh cua cac subtype khac nhau ́ ̉ ́ ́ + Nho 25 µl PBS vao cac giêng cua đia 96 giêng  ̉ ̀ ́ ́ ̉ ̃ ́ + Nho tiêp 25 µl khang huyêt thanh vao giêng đâu tiên ̉ ́ ́ ́ ̀ ́ ̀ + Pha loang khang hut thanh theo c ̃ ́ ́ ơ sơ 2, băng cach chun 25 µl khang hut thanh ́ ̀ ́ ̉ ́ ́   tư giêng 1 sang giêng 2 va tuân t ̀ ́ ́ ̀ ̀ ự đên giêng 11 va bo đi 25 µl ci cung ́ ́ ̀ ̉ ́ ̀ + Nho 25 µl khang nguyên 4HA đa chuân bi vao cac giêng t ̉ ́ ̃ ̉ ̣ ̀ ́ ́ ừ giêng 1 ­ 11.  ́ Thêm 25 µl PBS vao hang đơi ch ̀ ̀ ́ ứng hơng câu (giêng 12) ̀ ̀ ́ + Lăc đia va u  ́ ̃ ̀ ̉ ở nhiêt đơ phong 30 phut ̣ ̣ ̀ ́ + Nho 25 µl dung dich hơng câu vao tât ca cac giêng cua đia, lăcđêu ̉ ̣ ̀ ̀ ̀ ́ ̉ ́ ́ ̉ ̃ ́ ̀ + Đê đia  ̉ ̃ ở  nhiêt đô phong 30­40 phut. Đoc kêt qua khi h ̣ ̣ ̀ ́ ̣ ́ ̉ ồng cầu đối chứng lắng  xuống đáy * Đoc kêt qua: ̣ ́ ̉ ­ Phan  ̉ ưng (+) d ́ ương tinh: Hông câu lăng xuông đay. Nh ́ ̀ ̀ ́ ́ ́  vây, virus phân lâp va ̣ ̣ ̀  khang huyêt thanh chuân t ́ ́ ̉ ương ưng v ́ ơi nhau.  ́ ­ Xac đinh subtype: Môt virus phân lâp đ ́ ̣ ̣ ̣ ược xac đinh subtype khi no phan  ́ ̣ ́ ̉ ưng v ́ ơí  môt khang huyêt thanh chuân hiêu gia cao h ̣ ́ ́ ̉ ̣ ́ ơn so vơi cac khang huyêt thanh chuân khac. Hiêu ́ ́ ́ ́ ̉ ́ ̣   gia cang cao ch ́ ̀ ưng to s ́ ̉ ự tương đông cua virus phân lâp v ̀ ̉ ̣ ới khang huyêt thanh chuân cang ́ ́ ̉ ̀   lơn ́ 2.1.3. Phương phap RT­PCR ́ a. Chiêt tach ARN ́ ́ Co thê chiêt tach RNA băng bô kit hoăc ph ́ ̉ ́ ́ ̀ ̣ ́ ̣ ương phap chiêt tach Trizol.  ́ ́ ́ Cac mâu swab nên chiêt tach băng kit, khi s ́ ̃ ́ ́ ̀ ́ ử dung th ̣ ực hiện theo hương dân cua nha ́ ̃ ̉ ̀  san xuât.   ̉ ́ Chiêt tach băng Trizol ́ ́ ̀ : Cho 0,75 ml Trizol® LS reagent (hoăc 1 ml  Trizol® reagent) + 0,25 ml dich bênh ̣ ̣ ̣   phâm(0,1 ml dich bênh phâm nêu dung  Trizol® reagent) vao ơng 1,5 ml. Lăc đêu ̉ ̣ ̣ ̉ ́ ̀ ̀ ́ ́ ̀  va đê  ̀ ̉ ở nhiêt đô phong 5 phut.  ̣ ̣ ̀ ́ Thêm 0.2 ml chloroform vao môi ông. Lăc manh trong 15 giây va đê  ̀ ̃ ́ ́ ̣ ̀ ̉ ở  nhiêt đô ̣ ̣  phong 5 phut.  ̀ ́ Ly tâm ông  ́ ở tôc đô 12.000g trong 15 phut  ́ ̣ ́ ở 4°C.  Chuyên phân n ̉ ̀ ươc (khoang 500 µl) sang ơng microtube m ́ ̉ ́ ới.  Thêm 0.5 ml Isopropanol va lăc đêu. Đê 5­10 phut  ̀ ́ ̀ ̉ ́ ở nhiêt đô phong.  ̣ ̣ ̀ Ly tâm ông  ́ ở tôc đô 10.000 g trong 5 phut  ́ ̣ ́ ở 4°C. Bo dung dich trong ông đi ̉ ̣ ́                                                                                                                                                      10TCN 814­2006 Rửa RNA đong  ́ ở đay ông băng côn 80%, lăc manh va ly tâm v ́ ́ ̀ ̀ ́ ̣ ̀ ới tôc đô 10.000 g ́ ̣   trong 5 phut  ́ ở 4°C.  Bo dung dich trong ông va lam khô RNA 10 phut  ̉ ̣ ́ ̀ ̀ ́ ở nhiêt đơ phong va hoa tan lai ̣ ̣ ̀ ̀ ̀ ̣  vơi 30 µl n ́ ươc cât không co Rnase hoăc n ́ ́ ́ ̣ ước cât đa x ́ ̃ ử ly DEPC ́ b. Tiên hanh phan  ́ ̀ ̉ ứng RT­PCR ­ Pha hỗn hợp phản ứng (Master mix): Công thưc pha co thê thay đôi cho phu h ́ ́ ̉ ̉ ̀ ợp vơí  tưng loai primer va t ̀ ̣ ̀ ưng loai kit RT­PCR khac nhau.  ̀ ̣ ́ ́ ­ Chu trinh nhân gien: Chu trình nhân gien g ̀ ồm 2 giai đoạn: Phiên mã ngược (RT) và   nhân gien (PCR). Quy trình cụ thể sẽ tùy thuộc vào loại kít và primer được sử dụng c. Chay điên di: ̣ ̣ ­   Chuân̉   bị   thach ̣   agarose   1,5%   pha     dung   dich ̣   TAE   hoăc̣   TBE   có  Ethidium  Bromide (10 mg/ml) ­ Đô thach vao khuôn điên di (co l ̉ ̣ ̀ ̣ ́ ược) ­ Thach khô, rut l ̣ ́ ược ra va cho mâu vao cac giêng (5 µl san phâm PCR + 2µl dung dich ̀ ̃ ̀ ́ ́ ̉ ̉ ̣   loading buffer) ­ Sử dung Marker trong l ̣ ̣ ượng phân tử (thang 100 bp) ­ Chu y khi chay PCR phai co mâu đôi ch ́ ́ ̣ ̉ ́ ̃ ́ ứng dương va đôi ch ̀ ́ ứng âm đi kem (mâu đôi ̀ ̃ ́  chưng âm tinh co thê la n ́ ́ ́ ̉ ̀ ước cât sach) ́ ̣ d. Đoc kêt qua: ̣ ́ ̉ ­ Mâu d ̃ ương tinh: Xuât hiên vach giông v ́ ́ ̣ ̣ ́ ới mâu đôi ch ̃ ́ ứng dương tinh ́ ­ Mâu âm tinh: Không co vach ̃ ́ ́ ̣ Đanh gia kêt qua: ́ ́ ́ ̉  Co virus Cum hoăc virus Cum thuôc subtype nao d ́ ́ ̣ ́ ̣ ̀ ựa vao primer chay mâu ̀ ̣ ̃ 2.1.4. Phương phap Realtime RT­PCR (RRT­PCR) ́  Phương phap nay co gia tri chân đoan nh ́ ̀ ́ ́ ̣ ̉ ́ ư phương phap RT­PCR.  ́ a. Chiết tách ARN: xem phần RT­PCR b. Tiến hành phản ứng RRT­PCR: ­ Pha hỗn hợp phản ứng: Tùy thuộc loại kít được sử dụng  ­ Chu trình nhân gien: Tùy thuộc kít, primer, probe và loại máy realtime PCR được sử  dụng c. Đọc kết quả: ­ Kết quả  được đánh giá dựa trên ngưỡng vòng (Ct) được phát hiện của các mẫu  kiểm tra ­ Phản ứng được chấp nhận khi đ/c (­) có Ct = 0 và  đ/c (+) có Ct dao động quanh 25 ­ Mẫu dương tính: khi Ct ≤ 35 ­ Mẫu nghi ngờ khi Ct ≥ 35 ­ Mẫu âm tính khi khơng có Ct 2.2. Phat hiên khang thê ́ ̣ ́ ̉ 2.2.1. Phan  ̉ ưng HI phat hiên khang thê subtype H5 (hoăc cac subtype khac ) ́ ́ ̣ ́ ̉ ̣ ́ ́ Huyêt thanh kiêm tra: Huyêt thanh ga không cân x ́ ̉ ́ ̀ ̀ ử ly băng RDE, huyêt thanh vit, ngan ́ ̀ ́ ̣   co thê x ́ ̉ ử ly băng RDE đê chông hiên t ́ ̀ ̉ ́ ̣ ượng ưc chê ng ́ ́ ưng kêt không đăc hiêu va x ́ ̣ ̣ ̀ ử ly hông ́ ̀   câu đê chông hiên t ̀ ̉ ́ ̣ ượng ngưng kêt hông câu gia. (cac ph ́ ̀ ̀ ̉ ́ ương phap x ́ ử  ly huyêt thanh xem ́ ́   phân phu luc) ̀ ̣ ̣ a. Chuân bi khang nguyên:  ̉ ̣ ́ ­ Chuân đô khang nguyên – Xac đinh hiêu gia HA (phan  ̉ ̣ ́ ́ ̣ ̣ ́ ̉ ưng ng ́ ưng kêt hơng câu HA)  ́ ̀ ̀ ­ Pha khang ngun chn 4HA/25 µl ́ ̉                                                                                                                                                      10TCN 814­2006 Chu y ́ ́: Trươc khi pha cân tinh l ́ ̀ ́ ượng khang nguyên dung cho phan  ́ ̀ ̉ ưng công thêm 1ml ́ ̣   đê đam bao l ̉ ̉ ̉ ượng khang nguyên cân dung ́ ̀ ̀ ­ Chuân đô khang nguyên 4HA tr ̉ ̣ ́ ươc khi tiên hanh phan  ́ ́ ̀ ̉ ứng HI b. Phan  ̉ ưng HI: ́ ­ Nho 25 µl PBS vao cac giêng cua đia 96 giêng  ̉ ̀ ́ ́ ̉ ̃ ́ ­ Nho tiêp 25 µl huyêt thanh vao giêng đâu tiên ̉ ́ ́ ̀ ́ ̀ ­ Pha loang hut thanh theo c ̃ ́  sơ 2, băng cach chun 25 µl khang hut thanh t ́ ̀ ́ ̉ ́ ́ ư ̀ giêng 1 sang giêng 2 va tn t ́ ́ ̀ ̀ ự đên giêng 11 va bo đi 25 µl ci cung ́ ́ ̀ ̉ ́ ̀ ­ Nho 25 µl khang nguyên 4HA đa chuân bi vao cac giêng t ̉ ́ ̃ ̉ ̣ ̀ ́ ́ ừ giêng 1 ­ 11. Thêm 25 µl ́   PBS vao hang đơi ch ̀ ̀ ́ ứng hông câu (giêng 12) ̀ ̀ ́ ­ Lăc đia va u  ́ ̃ ̀ ̉ ở nhiêt đô phong 30 phut ̣ ̣ ̀ ́ ­ Nho 25 µl dung dich hơng câu vao tât ca cac giêng cua đia, lăcđêu ̉ ̣ ̀ ̀ ̀ ́ ̉ ́ ́ ̉ ̃ ́ ̀ ­ Đê đia  ̉ ̃ ở nhiêt đô phong 30­ 40 phut. Đoc kêt qua ̣ ̣ ̀ ́ ̣ ́ ̉ Đoc kêt qua: ̣ ́ ̉ Phan  ̉ ưng (+) d ́ ương tinh: ́  Hông câu lăng xuông đay ̀ ̀ ́ ́ ́ Hiêu gia HI cua mâu đ ̣ ́ ̉ ̃ ược tinh  ́ ở đô pha loang huyêt thanh cao nhât con co hiên t ̣ ̃ ́ ́ ̀ ́ ̣ ượng   ưc chê ng ́ ́ ưng kêt hông câu. Huyêt thanh đ ́ ̀ ̀ ́ ược coi la d ̀ ương tinh khi co hiêu gia huyêt thanh ≥ ́ ́ ̣ ́ ́   1/16. Huyêt thanh đôi ch ́ ́ ưng âm tinh phai co hiêu gia ≤ 1/4 ́ ́ ̉ ́ ̣ ́ Chu y ́ ́:  Khi kiêm tra huyêt thanh cac loai khac không phai la ga nên co 1 giêng chi co ̉ ́ ́ ̀ ́ ̉ ̀ ̀ ́ ́ ̉ ́  huyêt thanh va hông câu đê kiêm tra hiên t ́ ̀ ̀ ̀ ̉ ̉ ̣ ượng ngưng kêt hông câu không đăc hiêu. Nêu phat ́ ̀ ̀ ̣ ̣ ́ ́  hiên thây co ng ̣ ́ ́ ưng kêt hông câu không đăc hiêu xay ra v ́ ̀ ̀ ̣ ̣ ̉ ơi mâu huyêt thanh nao cân x ́ ̃ ́ ̀ ̀ ử ly lai ́ ̣  mâu huyêt thanh đo va kiêm tra lai băng phan  ̃ ́ ́ ̀ ̉ ̣ ̀ ̉ ứng HI 2.2.2. Phan  ̉ ưng ELISA  ́ Cac bô kit ELISA th ́ ̣ ương mại chi phat hiên đ ̉ ́ ̣ ược khang thê gia câm v ́ ̉ ̀ ới khang nguyên ́   Nucleocapsid, tưc la phat hiên đ ́ ̀ ́ ̣ ược khang thê cum A ma không phân biêt đ ́ ̉ ́ ̀ ̣ ược subtype cuả   khang thê co trong huyêt thanh. Khi s ́ ̉ ́ ́ ử dung kit ELISA nên ap dung theo quy trinh kem theo.  ̣ ́ ́ ̣ ̀ ̀ 2.3. Chân đoan phân biêt ̉ ́ ̣ Chân đoan phân biêt v ̉ ́ ̣ ới cac bênh sau đây: ́ ̣ ­ Bênh Niu cat x ̣ ́ ơn ­ Bênh Gumboro ̣ ­ Bênh Dich ta vit  ̣ ̣ ̉ ̣ ­ Bênh Tu huyêt trung ̣ ̣ ́ ̀ VI. Kêt luân ́ ̣ ­ Nêu kêt qua phân lâp HA d ́ ́ ̉ ̣ ương tinh, giam đinh HI d ́ ́ ̣ ương tinh v ́ ơi khang huyêt ́ ́ ́  thanh chuân, kêt luân co virus cum ̉ ́ ̣ ́ ́ ­ Nêu kêt qua RT­PCR (RRT­PCR) d ́ ́ ̉ ương tinh, kêt luân d ́ ́ ̣ ương tinh virus cum ́ ́ ­ Nêu gia câm ch ́ ̀ ưa tiêm phong, phat hiên co khang thê cum, kêt luân gia câm đa nhiêm ̀ ́ ̣ ́ ́ ̉ ́ ́ ̣ ̀ ̃ ̃   virus cum ́ ­ Nêu kêt qua phân lâp âm tinh, RT­PCR (RRT­PCR) âm tinh, kêt luân âm tinh virus  ́ ́ ̉ ̣ ́ ́ ́ ̣ ́ cum ́ VII. Tài liệu tham khảo Manual of standards for diagnosis tests and vaccines (OIE) WHO manual on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance                                                                                                                                                      10TCN 814­2006        KT. BỘ TRƯỞNG           THỨ TRƯỞNG                                                                                                                                                                              Bùi Bá Bổng             PHỤ LỤC I. Lây va Bao quan bênh phâm  ́ ̀ ̉ ̉ ̣ ̉ 1. Lây mâu: ́ ̃ ­ Dich ngoay hong, khi quan: Đ ̣ ́ ̣ ́ ̉ ưa tăm bông vao sâu trong hong ho ̀ ̣ ặc khí quản rơì  ngoay thu lây dich nhay, sau đo t ́ ́ ̣ ̀ ́ ừ từ rut ra rơi đ ́ ̀ ưa vao ông ch ̀ ́ ứa dung dich bao quan, be que ̣ ̉ ̉ ̉   vưa v ̀ ơi chiêu dai cua ông, đong kin năp ́ ̀ ̀ ̉ ́ ́ ́ ́ ­ Dich ngoay ô nh ̣ ́ ̉ ơp: Cho que ngoay sâu vao hâu môn gia câm, ngoay quanh thanh hâu ́ ́ ̀ ̣ ̀ ́ ̀ ̣   môn, đưa vao ông ch ̀ ́ ưa dung dich bao quan nh ́ ̣ ̉ ̉ ư trên ­ Mâu phân: Dung tăm bông ngoay tr ̃ ̀ ́ ực tiêp vao phân t ́ ̀ ươi  ở  chuông ga, rôi cho vao ̀ ̀ ̀ ̀  ông ch ́ ưa dich bao quan ́ ̣ ̉ ̉ ­ Mâu tô ch ̃ ̉ ưc: Lây keo căt phân tô ch ́ ́ ́ ́ ̀ ̉ ức cân lây cho vao tui nilon hay hôp nh ̀ ́ ̀ ́ ̣ ựa sach, ̣   bao quan lanh. Mâu tô ch ̉ ̉ ̣ ̃ ̉ ưc nho co thê cho vao dung dich bao quan ́ ̉ ́ ̉ ̀ ̣ ̉ ̉ ­ Mâu huyêt thanh: Lây 3­5 ml mau gia câm vao ông nghiêm, đê nghiêng, ch ̃ ́ ́ ́ ̀ ̀ ́ ̣ ̉ ờ maú   đông chăt lây huyêt thanh ́ ́ ́ 10                                                                                                                                                      10TCN 814­2006 Bênh phâm sau khi cho vao dung dich vân chuyên co thê bao quan  ̣ ̉ ̀ ̣ ̣ ̉ ́ ̉ ̉ ̉ ở  40C từ 1­2 ngay, ̀   nêu bao quan lâu h ́ ̉ ̉ ơn nên giư ̃ở nhiêt đô ­20 ̣ ̣ C.  Mâu huyêt thanh co thê đê  ̃ ́ ́ ̉ ̉ ở nhiêt đô 4 ̣ ̣ 0C trong vong 1 tuân, nêu bao quan lâu h ̀ ̀ ́ ̉ ̉ ơn nên  giư ̃ở nhiêt đô ­20 ̣ ̣ C.  Mâu đ ̃ ược chuyên t ̉ ơi phong xet nghiêm trong điêu kiên lanh (phich đa), cang s ́ ̀ ́ ̣ ̀ ̣ ̣ ́ ́ ̀ ơm ́   cang tôt, co phiêu g ̀ ́ ́ ́ ửi bênh phâm kem theo ̣ ̉ ̀ 2. Môi trương bao quan bênh phâm ̀ ̉ ̉ ̣ ̉ Bênh phâm la dich ngoay ô nh ̣ ̉ ̀ ̣ ́ ̉ ớp, hong, khi quan đ ̣ ́ ̉ ược bao quan trong dung dich vân ̉ ̉ ̣ ̣   chuyên. Co thê s ̉ ́ ̉ ử dung môi tr ̣ ương 199 hoăc môi tr ̀ ̣ ương glycerol co bô sung khang sinh, bao ̀ ́ ̉ ́ ̉   0 quan  ̉ ở 4 C tư 1­2 ngay, nêu lâu nên gi ̀ ̀ ́ ữ ở nhiêt đô ­20 ̣ ̣ C ­ Môi trương 199 ch ̀ ưa 0,5% BSA (Albumin huyêt thanh bo) ́ ́ ̀ Bô sung khang sinh  ̉ ́ Penicillin G 2.000.000U/lit́ Streptomycin 200 mg/lit́ Polymyxin B 2.000.000 U/lit́ Gentamicin 250 mg/lit́ Nystatin 500.000 U/lit́ Ofloxacin HCl 60 mg/lit́ Sulfmethoxasole 200 mg/lit́ ­ Môi trương Glycerol ̀ + Pha chê PBS ́ NaCl 8 g KCl 0,2 g Na2HPO4 1,15 g KH2PO4 0,2 g Nươc cât vđ ́ ́ 1000 ml + Hâp vô trung (121 ́ ̀ C/15) phut, bô sung khang sinh (nh ́ ̉ ́ ư trên) va trôn v ̀ ̣ ới  glycerol theo ty lê 1:1 ̉ ̣ Ngoai ra co thê s ̀ ́ ̉ ử  dung cac môi tr ̣ ́ ương bao quan khac nh ̀ ̉ ̉ ́ ư: Muôi đêm Hank, môi tr ́ ̣ ường   M.E.M, PBS, Tryptose Phosphate broth, Veal Infusion Broth, Sucrose­phosphate buffer. Cać   dung dich nay co thê đ ̣ ̀ ́ ̉ ược bô sung bovine serum albumin (BSA), gelatin 0,5­1%, cac chât ̉ ́ ́  khang sinh, khang nâm ́ ́ ́ II. Chuân bi cac dung dich va x ̉ ̣ ́ ̣ ̀ ử ly huyêt thanh ́ ́ 1. Dung dich PBS 0,01M pH7.2 ̣ Na2HPO4 1,096 g NaH2PO4.H2O 0,316 g Na Cl 8,5 g Nươc c ́ ất 1 lit́ Chinh pH = 7.2 băng NaOH 1N hoăc HCl 1N, hâp vô trung, bao quan 4 ̉ ̀ ̣ ́ ̀ ̉ ̉ 0C không qua 3 ́   tuân ̀ 2. Dung dich n ̣ ươc muôi sinh ly 0,85%:  ́ ́ ́ 8,5 g NaCl trong 1 lit n ́ ươc cât ́ ́ Hâp vô trung, bao quan 4 ́ ̀ ̉ ̉ C không qua 3 tuân ́ ̀ 11                                                                                                                                                      10TCN 814­2006 3. Dung dich hông câu ga 1%: ̣ ̀ ̀ ̀ ­ Mau ga trông khoe manh đa tr ́ ̀ ́ ̉ ̣ ̃ ưởng thanh, không co khang thê cum va newcastle ̀ ́ ́ ̉ ́ ̀ ­ Dung b ̀ ơm tiêm 5 – 10 ml hut săn 1ml (10 % thê tich) dung dich chông đông (Natri ́ ̃ ̉ ́ ̣ ́   Citrat 4%, Alserver) rôi lây mau ga cho mau vao ông nghiêm ̀ ́ ́ ̀ ́ ̀ ́ ̣ ­ Ly tâm 1000 – 1500 vong/phut, trong 15 phut, đô bo huyêt t ̀ ́ ́ ̉ ̉ ́ ương, cho thêm nước  sinh ly (NaCl 0,85%) vao hông câu, lăc đêu. Ly tâm nh ́ ̀ ̀ ̀ ́ ̀ ư trên 3 – 4 lân đê r ̀ ̉ ửa hông câu. Sau ̀ ̀   lân ly tâm cuôi hut bo n ̀ ́ ́ ̉ ước ở trên ­ Pha hông câu thanh huyên dich 1% băng cach pha 1 ml hông câu v ̀ ̀ ̀ ̃ ̣ ̀ ́ ̀ ̀ ới 99 ml nươć   muôi sinh ly ́ ́ ­ Bao quan huyên dich hông câu  ̉ ̉ ̃ ̣ ̀ ̀ ở nhiêt đô 4 – 8 ̣ ̣ C. Hông câu sau khi pha co thê dung ̀ ̀ ́ ̉ ̀   trong 4­5 ngay (nêu dung dich hông câu bi dung huyêt loai bo không dung) ̀ ́ ̣ ̀ ̀ ̣ ́ ̣ ̉ ̀ 4. Xử lý huyết thanh:  a. Xử lý huyết thanh chống hiện tượng ức chế không đặc hiệu Khang huyêt thanh chuân chê trên cac loai khác gà nh ́ ́ ̉ ́ ́ ̀ ư tho, dê, c ̉ ừu  cân đ ̀ ược xử lý  băng RDE (Receptor Destroying Enzyme) tr ̀ ươc khi xet nghiêm.  ́ ́ ̣ Các mẫu huyết thanh có phan  ̉ ưng cho kêt qua khơng ro rang co thê x ́ ́ ̉ ̃ ̀ ́ ̉ ử  ly RDE đê ́ ̉  khăng đinh kêt qua d ̉ ̣ ́ ̉ ương tinh ́ Các bước tiến hành: ­ Trôn 3 phân RDE v ̣ ̀ ơi 1 phân khang huyêt thanh (vd: 0,9 ml RDE+0,3 ml huyêt thanh) ́ ̀ ́ ́ ́ ­ Ủ ở nhiêt đô 37 ̣ ̣ 0C trong nôi đun cach thuy (water bath) qua đêm ̀ ́ ̉ ­ Sau u tiêp  ̉ ́ ở nôi đun cach thuy nhiêt đô 56 ̀ ́ ̉ ̣ ̣ 0C/30 phut đê vô hoat RDE con d ́ ̉ ̣ ̀ ư.  ­ Khang huyêt thanh đa x ́ ́ ̃ ử ly đê nguôi  cho thêm 6 phân n ́ ̉ ̣ ̀ ước muôi sinh ly (0,3 ml HT ́ ́   + 1,8ml SL), đô pha loang cuôi cung cua khang huyêt thanh se la 1/10 ̣ ̃ ́ ̀ ̉ ́ ́ ̃ ̀ b. Xử ly huyêt thanh chông hiên t ́ ́ ́ ̣ ượng gây ngưng kêt hông câu không đ ́ ̀ ̀ ặc hiệu Hiên t ̣ ượng gây ngưng kêt hông câu gia co thê x ́ ̀ ̀ ̉ ́ ̉ ử  ly băng cach hâp phu huyêt thanh ́ ̀ ́ ́ ̣ ́   kiêm tra v ̉ ơi hơng câu ga. Thêm 25 µl hơng câu đăc vao 500 µl hut thanh, lăc nhe va đê  ́ ̀ ̀ ̀ ̀ ̀ ̣ ̀ ́ ́ ̣ ̀ ̉ ở   nhiêt đô phong trong 30 phut, sau đo ly tâm  ̣ ̣ ̀ ́ ́ ở tôc đô 800 g trong vong 2­5 phut. Thu l ́ ̣ ̀ ́ ấy huyêt́  thanh đa hâp phu ̃ ́ ̣        KT. BỘ TRƯỞNG            THỨ TRƯỞNG                                                                                                                                                                Bùi Bá Bổng 12                                                                                                                                                      10TCN 814­2006 13 ...                                                                                                                                                     1 0TCN 814­2006 Hà Nội  ­ 2006 TIÊU CHUẨN NGÀNH                                                                                                         10 TCN 814­2006 QUY TRÌNH CHẨN ĐỐN BỆNH CÚM GIA CẦM... ­ Pipet thuy tinh: 1, 5 va 10 ml ̉ ̀ ­ Micropipet đơn: 0,5 10,  5­40, 40­200, 200 100 0 ml ­ Micropipet nhiêu đâu (8­12): 5­50, 50­300  ̀ ̀ ml ­ Đâu tip cac c ̀ ́ ́ ỡ 10,  20, 100 , 200 va 100 0 ̀ ml sử dung cho micropipet (co loc va không...                                                                                                                                                      1 0TCN 814­2006 + Bo tăm bông cua ông dich ngoay  ̉ ̉ ́ ̣ ́ + Bô sung 1 /10 l ̉ ượng khang sinh đâm đăc 10X (xem phu luc), lăc đêu ́ ̣ ̣ ̣ ̣ ́ ̀ + Đê mâu lăng căn khoang 30 phut