Thông tin tài liệu
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NGUYỄN NGỌC QUANG NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN, MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN GEN EGFR VÀ TÌNH TRẠNG METHYL HĨA MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƢ BIỂU MÔ TUYẾN Ở PHỔI LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NGUYỄN NGỌC QUANG NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN, MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN GEN EGFR VÀ TÌNH TRẠNG METHYL HĨA MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƢ BIỂU MÔ TUYẾN Ở PHỔI Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 942 02 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Chu Hoàng Hà TS BS Nguyễn Phi Hùng Hà Nội – 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận án cơng trình nghiên cứu tơi số kết nghiên cứu, cộng tác với nhà khoa học khác; Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần cơng bố tạp chí khoa học chun ngành hội nghị nước quốc tế với đồng ý cho phép đồng tác giả; kết lại luận án chưa tác giả công bố công trình khác Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Nghiên cứu sinh Nguyễn Ngọc Quang Nguyễn Ngọc Quang LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Chu Hồng Hà, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam hướng dẫn, bảo tận tình suốt q trình tơi thực luận án Thầy khơng truyền thụ cho nhiều kiến thức chuyên môn mà giúp tơi bồi đắp lòng say mê, nghiêm túc, tính cẩn thận nghiên cứu khoa học Đó tảng cho trình thực luận án hành trang giúp tự tin vững bước đường khoa học sau Trong thời gian học tập nghiên cứu, xin trân trọng cảm ơn TS BS Nguyễn Phi Hùng, Trung tâm Giải phẫu bệnh & Sinh học phân tử, Bệnh viện K Thầy hướng dẫn, động viên, dành cho nhiều lời khun q báu lúc tơi gặp khó khăn Tôi xin gửi lời cảm ơn đến PGS TS Tạ Văn Tờ, TS Vương Diệu Linh đồng nghiệp thuộc Trung tâm Giải phẫu bệnh & Sinh học phân tử, Bệnh viện K tạo điều kiện thuận lợi cho thực tốt đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn Học viện Khoa học Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, Phòng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ Gen, Viện Cơng Nghệ Sinh học bên cạnh giúp đỡ cổ vũ suốt thời gian qua Với tất lòng biết ơn, tơi xin dành cho bố mẹ, bạn bè tin tưởng, thông cảm, động viên, tạo điều kiện chia sẻ khó khăn thời gian qua, giúp tơi hồn thành tốt luận án Nghiên cứu sinh Nguyễn Ngọc Quang MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Ung thư phổi 1.1.1 Thực trạng ung thư phổi 1.1.2 Phân loại ung thư phổi 1.1.3 Các giai đoạn ung thư phổi 1.2 Ung thư biểu mô tuyến phổi 1.2.1 Đặc điểm ung thư biểu mô tuyến 1.2.2 Các phân típ mơ bệnh học ung thư biểu mơ tuyến 11 1.3 Biến đổi gen EGFR ung thư phổi 13 1.3.1 Cấu trúc chức gen EGFR 13 1.3.2 Đột biến gen EGFR ung thư phổi 15 1.3.3 Biểu protein EGFR ung thư phổi 17 1.4 Methyl hóa DNA ung thư phổi 17 1.4.1 Methyl hóa DNA 17 1.4.2 Methyl hóa gen EGFR, BRCA1, MLH1, MGMT RASSF1A ung thư phổi 20 1.5 Điều trị đích ung thư ung thư phổi 29 1.5.1 Điều trị đích ung thư 29 1.5.2 Điều trị đích ung thư phổi 31 1.6 Phương pháp phân tích biến đổi phân tử ung thư phổi 33 1.6.1 Phương pháp phân tích đột biến gen ung thư phổi 33 1.6.2 Phương pháp phân tích methyl hóa DNA ung thư phổi 35 1.7 Nghiên cứu dấu ấn phân tử ung thư phổi Việt Nam 37 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 39 2.1 Vật liệu 39 2.1.1 Mẫu nghiên cứu 39 2.1.2 Hóa chất 39 2.2 Thiết bị 42 2.3 Phương pháp nghiên cứu 43 2.3.1 Tách chiết DNA tổng số xác định nồng độ DNA 43 2.3.2 Xử lý bisulfite với DNA tổng số 44 2.3.3 Phương pháp PCR 44 2.3.4 Phương pháp điện di 47 2.3.5 Phương pháp xác đinh đột biến gen EGFR 47 2.3.6 Phương pháp nhuộm hóa mơ miễn dịch 48 2.3.7 Phương pháp tạo trình tự DNA methyl enzyme M.sssI 49 2.3.8 Xử lý kết thống kê sinh học 50 2.4 Sơ đồ nghiên cứu 50 CHƢƠNG III KẾT QUẢ 51 3.1 Đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu 51 3.2 Đột biến biểu gen EGFR 52 3.2.1 Đột biến gen EGFR tương quan với đặc điểm bệnh nhân 52 3.2.2 Biểu protein EGFR tương quan với đặc điểm bệnh nhân 56 3.3 Tình trạng methyl hóa số gen liên quan đến ung thư biểu mô tuyến phổi 59 3.3.1 Methyl hóa gen EGFR tương quan với đặc điểm bệnh nhân 59 3.3.2 Methyl hóa gen BRCA1 tương quan với đặc điểm bệnh nhân 61 3.3.3 Methyl hóa gen MGMT tương quan với đặc điểm bệnh nhân 63 3.3.4 Methyl hóa gen MLH1 tương quan đặc điểm bệnh nhân 65 3.3.5 Methyl hóa gen RASSF1A tương quan với đặc điểm bệnh nhân 66 3.4 Tương quan đột biến biểu gen EGFR với methyl hóa số gen liên quan đến ung thư tuyến phổi 68 3.4.1 Tương quan đột biến, biểu methyl hóa gen EGFR 68 3.4.2 Tương quan đột biến biểu gen EGFR với methyl hóa gen BRCA1, MGMT, MLH1 RASSF1A 71 3.4.3 Tương quan tình trạng methyl gen liên quan đến ung thư biểu mô tuyến phổi 74 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN 76 4.1 Đặc điểm phân tử gen EGFR bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến phổi 76 4.1.1 Đột biến vùng hoạt hóa Tyrosine Kinase gen EGFR 76 4.1.2 Biểu mức protein EGFR 78 4.1.3 Methyl hóa vùng promoter EGFR 80 4.1.4 Tương quan đặc điểm phân tử gen EGFR 81 4.2 Methyl hóa gen ức chế khối u BRCA1, MGMT, MLH1 RASSF1A bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến phổi 83 4.2.1 Methyl hóa vùng promoter gen BRCA1 83 4.2.2 Methyl hóa vùng promoter gen MGMT 84 4.2.3 Methyl hóa vùng promoter gen MLH1 86 4.2.4 Methyl hóa vùng promoter gen RASSF1A 87 4.3 Tương quan đặc điểm phân tử gen EGFR với methyl hóa BRCA1, MGMT, MLH1 RASSF1A ung thư biểu mô tuyến phổi 88 4.3.1 Đột biến EGFR với methyl hóa mức gen ức chế khối u 88 4.3.2 Biểu EGFR với methyl hóa gen ức chế khối u 90 4.3.3 Sự methyl hóa đồng thời số gen liên quan đến ung thư biểu mô tuyến phổi 91 KẾT LUẬN 94 KIẾN NGHỊ 95 DANH MỤC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TIẾN SĨ 96 TÀI LIỆU THAM KHẢO 97 DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên đầy đủ A260 Độ hấp thụ bước sóng 260 nm AAH Atipical Adenomatous Hyperplasias (Tế bào phân chia q mức khơng điển hình) ABL Abelson murine leukemia viral oncogene homolog gene ACS American Cancer Society (Hiệp hội ung thư Hoa Kỳ) AIS Adenocarcinoma in situ (Ung thư chỗ) ALK Anaplastic Lymphoma Kinase gene ALK-EML4, Chuyển đoạn ALK-EML4, BCR-ABL BCR-ABL APC Adenomatous polyposis of the colon gene BAC Bronchioloalveolar Carcinoma (Ung thư biểu mô tiểu phế nang) BCR Breakpoint Cluster Region gene BRCA1 Breast cancer susceptibility gene (Gen nhạy cảm với ung thư vú) BRAF v-Raf murine sarcoma viral oncogene homolog B CD74 Cluster of Differentiation 74 gene CHFR Checkpoint With Forkhead And Ring Finger Domains CK5/6 Cytokeratin 5/6 protein CK7 Cytokeratin protein COBRA Combined Bisulfite Restriction Analysis (Phân tích kết hợp Bisulfite cắt giới hạn) cs Cộng DAB 3, –diaminobenzidine DAPK Death‐associated protein kinase DNA Acid deoxyribonucleic DNMTs DNA methyltransferase (Enzyme methyl hóa DNA) dNTP Deoxynucleotide triphosphate EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid EGFR Epidermal growth factor receptor (Yếu tố phát triển biểu mô) ER Estrogen receptor (thụ thể estrogen) FDA Food and Drug Administration (Hiệp hội thực phẩm thuốc Hoa Kỳ) FFPE Formalin fixed paraffin embedded FISH Fluorescence In Situ Hybridization (Lai chỗ huỳnh quang) GTP Guanosine triphosphate GDP Guanosine diphosphate GSTP1 Glutathione S-transferase Pi gene H&E Hematoxylin & Eosin HDACs Histone deacetylase HRM High Resolution Melting (Độ phân giải cao nhiệt độ nóng chảy) HPR Horseradish Peroxidase IARC International Agency for Research on cancer (Tổ chức nghiên cứu ung thư giới) IHC Immunohistochemistry (Hóa mơ miễn dịch) MAPK Mitogen-activated protein kinase MDR Multidrug resistance gene MEK Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase (MAP2K1) MET Mesenchymal-epithelial transition factor MIA Minimally Invasive Adenocarcinoma MGMT O-6-methylguanine-DNA methyltransferase gene MLH1 MutL homolog gene MsssI CpG methyltransferase MS-PCR Methylation Specific PCR (PCR đặc hiệu methyl) MYC Myelocytomatosis genes NGS Next Generation Sequencing (Giải trình tự hệ mới) NSCLC Non-small cell lung cancer (Ung thư phổi không tế bào nhỏ) PI3K Phosphoinositide 3-kinases PTEN Phosphatase and tensin homologue PR Progesterone Receptor (Thụ thể progesterone) RASSF1A Ras association domain family 1A gene RARP2 The retinoic acid receptor P gene Ras Rat sarcoma RB2 Retinoblastoma-like protein RET Rearranged during transfection ROS1 c-ros oncogene 1gene SAM S-adenosylmethionine SCLC Small cell lung cancer (Ung thư phổi tế bào nhỏ) SDC4 Syndecan gene SLC34A2 Solute Carrier Family 34 Member gene SNP Single Nucleotide Polymorphism (Sự đa hình nucleotide) SSCP Single-strand conformation polymorphism (đa hình cấu trúc sợi đơn) TAE Tris-acetate-EDTA TBE Tris-borate-EDTA TEMED N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine TKIs Tyrosine Kinase Inhibitors (Các chất ức chế Tyrosine Kinase) TIMP3 Tissue Inhibitor of Metalloproteinases gene TTF-1 Transcription Termination Factor (Yếu tố kết thúc phiên mã 1) WHO World Heath Organization (Tổ chức Y tế giới) WNT Wingless genes YAP Yes-associated protein DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Tỷ lệ mắc tử vong số loại ung thư phổ biến giới Hình 1.2 Số ca mắc ung thư Việt Nam năm 2018 Hình 1.3 Phân loại mô bệnh học ung thư phổi Hình 1.4 Q trình hình thành ung thư biểu mơ tuyến 11 Hình 1.5 Một số phân típ phổ biến ung thư biểu mơ tuyến phổi 12 Hình 1.6 Đường truyền tín hiệu thơng qua phân tử EGFR 14 Hình 1.7 Tần suất dạng đột biến gen EGFR 15 Hình 1.8 Methyl hóa DNA tế bào bình thường tế bào ung thư 19 Hình 1.9 Các vị trí methyl hóa gen EGFR 22 Hình 1.10 Cấu trúc gen BRCA1ở người 22 Hình 1.11 Chức ức chế khối u BRCA1 23 Hình 1.12 Cấu trúc gen MLH1 24 Hình 1.13 Các phức hợp sửa chữa DNA MLH1 24 Hình 1.14 Cấu trúc gen MGMT 26 Hình 1.15 Cơ chế sửa chữa DNA MGMT 26 Hình 1.16 Cấu trúc gen RASSF1A đồng phân 27 Hình 1.17 Chức ức chế khối u RASSF1A 28 Hình 1.18 Điều trị đích ung thư phổi 32 Hình 1.19 Một số kỹ thuật phát đột biến gen 35 Hình 1.20 Lịch sử phát kỹ thuật phân tích methyl hóa DNA 36 Hình 2.1 Phương pháp xử lý bisulfite 44 Hình 2.2 Phương pháp RT-PCR Scorpion Arms 48 Hình 2.3 Phương pháp hóa mơ miễn dịch 49 Hình 2.4 Sơ đồ nghiên cứu 50 Hình 3.1 Kết phát đột biến EGFR 53 Hình 3.2 Kết hóa mơ miễn dịch protein EGFR Hình 3.3 Kết điện di sản phẩm MS-PCR phát methyl hóa gen EGFR Hình 3.4 Hình 4.1 63 Kết điện di sản phẩm MS-PCR phát methyl hóa MLH1 Hình 3.7 61 Kết điện di sản phẩm MS-PCR phát methyl hóa gen MGMT Hình 3.6 59 Kết điện di sản phẩm MS-PCR phát methyl hóa gen BRCA1 Hình 3.5 56 65 Kết điện di sản phẩm MS-PCR phát methyl hóa gen RASSF1A 67 Tương quan đột biến gen, methyl hóa biểu EGFR 81 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Kit hóa chất sử dụng nghiên cứu 40 Bảng 2.2 Trình tự cặp mồi sử dụng nghiên cứu 41 Bảng 2.3 Điều kiện phản ứng PCR sử dụng nghiên cứu 45 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR nghiên cứu 46 Bảng 3.1 Đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu 51 Bảng 3.2 Các đột biến gen EGFR phát nghiên cứu 52 Bảng 3.3 Tương quan đột biến EGFR với đặc điểm bệnh nhân 54 Bảng 3.4 Tương quan đột biến EGFR tình trạng hút thuốc bệnh nhân nam giới 55 Bảng 3.5 Mức độ biểu protein EGFR 57 Bảng 3.6 Tương quan mức độ biểu protein EGFR với đặc điểm bệnh nhân 58 Bảng 3.7 Tương quan methyl hóa EGFR với đặc điểm bệnh nhân 60 Bảng 3.8 Tương quan methyl hóa BRCA1 với đặc điểm bệnh nhân 62 Bảng 3.9 Tương quan methyl hóa MGMT với đặc điểm bệnh nhân 64 Bảng 3.10 Tương quan methyl hóa MHL1 với đặc điểm bệnh nhân 66 Bảng 3.11 Tương quan methyl hóa RASSF1A với đặc điểm bệnh nhân 68 Bảng 3.12 Tương quan đột biến gen, methyl hóa biểu protein EGFR 69 Bảng 3.13 Tỷ lệ đột biến, biểu protein bệnh nhân methyl hóa EGFR 70 Bảng 3.14 Tương quan đột biến methyl hóa với biểu EGFR 70 Bảng 3.15 Tương quan đột biến EGFR với methyl hóa gen BRCA1, MGMT, MLH1 RASSF1A Bảng 3.16 Tương quan biểu protein EGFR với methyl hóa gen BRCA1, MGMT, MLH1 RASSF1A Bảng 3.17 72 73 Tương quan tình trạng methyl gen liên quan đến ung thư biểu mô tuyển phổi 74 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Ung thư phổi loại ung thư có tỷ lệ mắc tử vong cao giới Theo ước tính Tổ chức Y tế giới, năm 2018 có đến 2,1 triệu trường hợp mắc 1,8 triệu người chết ung thu phổi Trong đó, số ca mắc tử vong Việt Nam 160 000 115 000 người Ung thư phổi chia làm hai nhóm ung thư phổi tế bào nhỏ chiếm 10 – 15 % ung thư phổi không tế bào nhỏ chiếm 85 – 90 % Trong đó, ung thư biểu mơ tuyến phổi dạng phổ biến nhất, không gặp người hút thuốc mà phổ biến người không hút thuốc, phụ nữ người trẻ tuổi Ung thư phổi nói chung ung thư biểu mơ tuyến phổi nói riêng có tiên lượng mức độ đáp ứng điều trị thấp, 10 – 15 % bệnh nhân ung thư phổi sống sót qua năm Tuy hiệu điều trị cải thiện rõ rệt bệnh nhân phát ung thư sớm sử dụng phác đồ điều trị đại Một phương pháp điều trị áp dụng phổ biến thuốc điều trị nhắm đích dựa hiểu biết biến đổi di truyền tế bào ung thư Ở ung thư phổi khơng tế bào nhỏ nói chung ung thư biểu mơ tuyến phổi nói riêng, phác đồ điều trị thuốc nhắm đích TKIs (Tyrosine Kinase Inhibitors) dựa đột biến gen EGFR (Epidermal growth factor receptor) sử dụng rộng rãi mang lại hiệu rõ rệt việc kéo dài thời gian sống thêm cải thiện chất lượng sống bệnh nhân ung thư phổi Bên cạnh việc đánh giá biểu gen EGFR góp phần quan trọng việc đưa tiên lượng tiến triển bệnh định hướng liều lượng thuốc cho bệnh nhân Mặt khác, biểu gen EGFR lại điều khiển mức độ methyl hóa vùng promoter gen Cùng với EGFR, methyl hóa gen ức chế khối u xem nguyên nhân dẫn đến hình thành phát triển ung thư Methyl hóa gen ức chế khối u như: BRCA1, MGMT, MLH1, RASSF1A… phát nhiều loại ung thư có ung thư phổi Thêm vào đó, tình trạng methyl hóa số gen ức chế khối u dẫn đến tiên lượng xấu cho bệnh nhân xem marker điển hình ung thư phổi Đồng thời, kết hợp thuốc điều trị nhắm đích TKIs với chất loại bỏ nhóm methyl mang lại hiệu ban đầu cao so với việc sử dụng TKIs dòng tế bào ung thư phổi điển hình Trên giới có nhiều nghiên cứu đột biến gen EGFR bệnh nhân ung thư phổi Tuy nhiên, khơng có nhiều nghiên cứu tổng thể biến đổi phân tử gen EGFR ảnh hưởng tượng methyl hóa gen ức chế khối u BRCA1, MGMT, MLH1, RASSF1A lên biến đổi Ở Việt Nam nay, nghiên cứu dừng lại mức độ xác định đột biến gen EGFR để đưa phác đồ điều trị TKIs Vì chúng tơi thực đề tài “Nghiên cứu đột biến, mức độ biểu gen EGFR tình trạng methyl hóa số gen liên quan bệnh nhân ung thƣ biểu mô tuyến phổi” với mục tiêu: Phân tích tỷ lệ đột biến mức độ biểu gen EGFR bệnh nhân ung thư biểu mô tuyển phổi Đánh giá tình trạng methyl hóa số gen bao gồm: EGFR, BRCA1, MGMT, MLH1, RASSF1A tương quan methyl hóa gen với đột biến biểu protein EGFR Nội dung nghiên cứu Sàng lọc bệnh nhân, thiết lập hồ sơ bệnh án hoàn chỉnh Thu thập mẫu bệnh phẩm ung thư phổi mẫu phổi liền kề Xác định tỷ lệ đột biến mức độ biểu gen EGFR Phân tích liên quan đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu với đột biến biểu gen EGFR Thiết lập xây dựng điều kiện tối ưu cho phản ứng PCR đặc hiệu methyl nhằm xác định tình trạng methyl hóa vùng promoter gen EGFR, BRCA1, MGMT, MLH1 RASSF1A tương quan tượng với đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu Phân tích tương quan đột biến biểu EGFR với tình trạng methyl hóa gen liên quan bao gồm: EGFR, BRCA1, MGMT, MLH1 RASSF1A Đóng góp luận án Đây nghiên cứu Việt Nam xác định toàn diện đặc điểm phân tử EGFR đột biến, methyl hóa biểu protein Đồng thời, đánh giá tình trạng methyl hóa gen ức chế khối u quan trọng ung thư biểu mơ tuyến phổi Nghiên cứu có số đóng góp ý nghĩ thực tiễn sau: Mô tả tỷ lệ đột biến, mức độ biểu protein EGFR methyl hóa số gen liên quan đến phát sinh ung thư, tiến triển bệnh đáp ứng điều trị ung thư biểu mô tuyến phổi Chỉ mối liên quan methyl hóa gen RASSF1A với methyl hóa gen BRCA1 MLH1 Sự khác methyl hóa vùng promoter gen EGFR BRCA1 với biểu protein EGFR bề mặt tế bào ung thư biểu mô tuyến phổi CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Ung thƣ phổi 1.1.1 Thực trạng ung thư phổi Ung thư phổi loại ung thư phổ biến giới Theo thống kê Tổ chức Y tế giới (WHO), năm 2018 có đến 1,8 triệu người chết ung thư phổi tổng số 9,6 triệu người chết ung thư (Hình 1.1) [35] Đây ung thư phổ biến nam giới toàn cầu (chiếm 14,5% tổng số) Tỷ lệ mắc cao Trung Âu Đông Âu (53,3/100 000 người) Đông Á (50,4/100 000 người) Tỷ lệ mắc thấp Trung Phi Tây Phi (2,0 1,7/100 000 người) Ở phụ nữ, ung thư phổi đứng thứ ba sau ung thư vú ung thư đại trực tràng (chiếm 8,4% tổng số) Tỷ lệ mắc ung thư phổi phụ nữ thấp nam giới có khác vùng địa lý khác nhau, chủ yếu phản ánh lịch sử tiếp xúc khác với thuốc Do đó, tỷ lệ mắc cao Bắc Mỹ (33,8/100 000 người) Bắc Âu (23,7/100 000 người), tỷ lệ mắc tương đối cao khu vực Đông Á (19,2/100 000 người) thấp Tây Phi Trung Phi (1,1 0,8/100 000 người) [35] Hiệp hội ung thư Hoa Kỳ (American Cancer Society) ước tính năm 2017, có thêm 225 500 trường hợp mắc ung thư phổi chiếm 13% tổng số ca ung thư phát Chỉ có 19% trường hợp bị phát ung thư phổi sống thêm năm Cũng theo thống kê Hiệp hội ung thư Hoa Kỳ, năm 2015 có đến 155 800 người chết bệnh này, chiếm 25% số trường hợp tử vong ung thư [102] Số trường hợp tử vong ung thư phổi lớn tổng số trường hợp tử vong ba loại ung thư phổ biến khác Hoa Kỳ bao gồm ung thư tuyến tiền liệt, ung thư vú ung thư đại tràng cộng lại [102] Theo thống kê Tổ chức Y tế giới 2018, Việt Nam, năm có khoảng 160 000 trường hợp mắc có tới 115 000 người tử vong ung thư Việt Nam đứng vị trí 78/172 quốc gia, vùng lãnh thổ khảo sát với tỉ lệ tử vong 110/100 000 người (Hình 1.2) Ung thư phổi có tỉ lệ mắc đứng hàng thứ nam giới đứng hàng thứ nữ giới lại có tỷ lệ tử vong cao thứ hai nam nữ (sau ung thư gan) Số ca mắc ung thư phổi nam giới năm 2000 905 ca với tỉ lệ 29,3/100 000 dân, đến năm 2018 số ca mắc 23 667 trường hợp (14,4% tổng số ca ung thư) tăng tỉ lệ lên 35,1/100 000 dân Dự báo, đến năm 2020, số trường hợp mắc lên tới 23 000 nam giới 34 000 hai giới [35] Cũng theo WHO, Việt Nam nằm nhóm nước có tần suất mắc ung thư phổi cao thuộc hàng thứ hai giới, với tỉ lệ mắc nam giới 25,5 – 41,5/100 000 dân nữ giới 7,3 – 13,6/100 000 dân [35] Hình 1.1 Tỷ lệ mắc tử vong số loại ung thư phổ biến giới [35] Hình 1.2 Số ca mắc ung thư Việt Nam năm 2018 [35] 1.1.2 Phân loại ung thư phổi Ung thư phổi phân loại dựa kết xét nghiệm mô bệnh học [84] Sự phân loại có ý nghĩa quan trọng cho việc theo dõi, điều trị tiên lượng bệnh Ung thư phổi hình thành từ khối u ác tính phát sinh từ tế bào biểu mô, gọi ung thư biểu mô Ung thư biểu mơ phổi phân loại theo kích thước hình thái tế bào ác tính quan sát kính hiển vi Để phục vụ cho mục đích điều trị, ung thư phổi chia hai loại lớn: Ung thư phổi không tế bào nhỏ (NSCLC – Non-Small Cell Lung Cancer) ung thư phổi tế bào nhỏ (SCLC – Small Cell Lung Cancer) (Hình 1.3) [72] 1.1.2.1 Ung thư phổi không tế bào nhỏ Ung thư phổi không tế bào nhỏ chia thành nhóm nhỏ hơn, ba phân nhóm ung thư biểu mô tuyến, ung thư biểu mô tế bào vảy ung thư biểu mô tế bào lớn [57] Ung thư biểu mô tuyến (AD - Adenocarcinoma) chiếm khoảng 40% trường hợp mắc ung thư phổi thường bắt nguồn từ mô phổi ngoại vi [57] Ung thư biểu mô tuyến xảy phổ biến nữ giới người không hút thuốc [135] Đây loại ung thư phổi có thời gian sống kéo dài nhóm khác [112] Ung thư biểu mơ tế bào vảy (SCC – Squamous Cell Cancer) chiếm khoảng 25 – 30% số trường hợp ung thư phổi Chúng thường bắt đầu xuất tế bào vẩy, tế bào phẳng nằm bên đường hô hấp phổi Ung thư biểu mơ tế bào vẩy có xu hướng tìm thấy phần trung tâm phổi, gần đường hơ hấp (phế quản), thường gặp nam giới có liên quan mật thiết với tiền sử hút thuốc nhiều so với hầu hết loại ung thư phổi khác [65] Ung thư biểu mô tế bào lớn (LCC – Large Cell Cancer) chiếm khoảng 10 – 15% số trường hợp mắc ung thư phổi Sở dĩ tên gọi tế bào ung thư có kích thước lớn, với dư thừa tế bào chất, nhân tế bào lớn hạch nhân dễ thấy [84] Ung thư biểu mô tế bào lớn xuất phần phổi Nó có xu hướng phát triển lan truyền nhanh chóng, điều làm cho việc điều trị trở nên khó khăn Một phân nhóm ung thư biểu mơ tế bào lớn, gọi ung thư biểu mô tế bào thần kinh lớn, loại ung thư phát triển nhanh, giống với ung thư phổi tế bào nhỏ [84] Ngồi ung thư phổi khơng tế bào nhỏ có thêm số phân típ khác gặp carcinoid thần kinh nội tiết [84] Hình 1.3 Phân loại mô bệnh học ung thư phổi [57] 1.1.2.2 Ung thư phổi tế bào nhỏ Đặc điểm bật ung thư phổi tế bào nhỏ tế bào chứa dày đặc hạt tiết thể dịch thần kinh túi tiết chứa hormone thần kinh nội tiết, khối u loại có liên quan đến với hội chứng cận ung thư/nội tiết [118, 135] Đa số trường hợp bệnh phát sinh đường dẫn khí lớn (phế quản phế quản thùy) Khoảng 60 – 70% trường hợp bệnh phát giai đoạn lan rộng tiến hành xạ trị phạm vi đơn lẻ [57] 1.1.3 Các giai đoạn ung thư phổi Ung thư phân chia theo giai đoạn phát triển dựa vào kích thước, vị trí khối u nguyên phát, mức độ xâm lấn khả di Hiện nay, hệ thống phân loại giai đoạn ung thư phổi sử dụng phổ biến hệ thống TNM, dựa kích thước khối u (Tumor), số hạch lympho phát sinh (Node) mức độ di (Metastasis) Theo hệ thống phân loại này, tiến triển ung thư phổi chia thành giai đoạn từ (STAGE 0) đến IV (STAGE IV) [3] Giai đoạn tương ứng với ung thư phổi không xâm lấn, khơng có hạch, khơng di xa Giai đoạn này, tế bào ung thư khu trú, không xuất tế bào ung thư hay tế bào dị thường xuất vùng phổi/phế quản, hay có biểu cơng vùng mô lành xung quanh [3] Giai đoạn I tương ứng với ung thư phổi xâm lấn, tế bào ung thư bắt đầu lan tỏa công phần mơ lành, với kích thước khối u ≤ cm Ở giai đoạn này, xâm lấn diễn ít, chủ yếu bao xung quanh phổi tạng màng phổi, không xâm lấn vào phế quản thùy; chưa có tượng di hạch Giai đoạn I chia làm IA, IB tùy thuộc vào kích thước khối u [3] Thời gian sống thêm sau năm bệnh nhân phát giai đoạn I khoảng 65% (55 – 90,5%) Thời gian sống thêm bệnh nhân nhóm phụ thuộc vào kích thước khối u phát bệnh Đối với bệnh nhân giai đoạn T1N0, tỷ lệ sống sau năm 82%, sau 10 năm 74% Trong tỷ lệ nhóm bệnh nhân T2N0 giảm xuống 68% 60% [84] Giai đoạn II chia làm IIA IIB IIA mô tả ung thư xâm lấn dạng khối u có kích thước nhỏ cm, di hạch cạnh phế quản bên và/hoặc hạch cạnh rốn phổi, bao gồm xâm lấn trực tiếp vào hạch, chưa có di xa IIB mơ tả ung thư xâm lấn dạng khối u có kích thước lớn 5cm nhỏ cm, có di hạch cạnh phế quản bên và/hoặc hạch cạnh rốn phổi; khối u có kích thước lớn cm, có xâm lấn trực tiếp vào thành ngực, hoành, thần kinh hoành, màng phổi trung thất, thành màng tim [3] Thời gian sống sau năm bệnh nhân phát giai đoạn II 42% Đặc điểm mô bênh học khối u có ảnh hưởng đến thời gian sống thêm Bệnh nhân thuộc nhóm T1 ung thư biểu mơ tế bào vẩy có 75% sống sau năm, số 25% bệnh nhân T2 ung thư biểu mô tuyến [84] Giai đoạn III tương ứng với ung thư có di hạch lympho, hạch tập trung thành cụm gắn lên cấu trúc khác Giai đoạn III chia làm IIIA IIIB Giai đoạn III mô tả ung thư xâm lấn chưa có di xa, khối u ngun phát có kích thước lên đến cm, xâm lấn vào tạng màng phổi, có liên quan đến phế quản, xâm lấn vào thành ngực, hoành, thành màng tim; khối u có kích thước xâm nhiễm vào trung thất, lan vào tim, mạch máu lớn, khí quản, thực quản, thân đốt sống, có tràn dịch màng phổi ác tính Giai đoạn IIIA IIIB khác tình trạng di hạch khối u, IIIB có di hạch trung thất đối bên, hạch rốn phổi đối bên, di hạch bậc thang bên đối bên, hạch thượng đòn Ngược lại, IIIA mơ tả khơng có di hạch, hạch cạnh phế quản bên và/hoặc hạch cạnh rốn phổi, di hạch trung thất bên và/hoặc hạch carina [3] Thời gian sống trung bình bệnh nhân nhóm IIIA 12 tháng có – 15% trường hợp sống thêm năm Trong đó, thời gian sống trung bình bệnh nhân giai đoạn IIIB tháng có 5% bệnh nhân sống sót sau năm [84] Giai đoạn IV mô tả ung thư phổi xâm lấn dạng di xa hình thành hạch lympho quan khác thể Ở giai đoạn này, có khối riêng biệt thùy đối bên, khối u có khối màng phổi, có tổn thương ác tính màng phổi [3] Với bệnh nhân giai đoạn IV việc phẫu thuật loại bỏ khối u điều gần khơng thể Thời gian sống thêm bệnh nhân nhóm ngắn, đồng thời bệnh nhân sống sót năm [84] Tuy nhiên, số trường hợp gặp, bệnh nhân phẫu thuật thành công, làm cải thiện đáng kể chất lượng sống thời gian sống thêm Thời gian sống sau năm lên tới 13 – 21% thời gian sống trung bình 14 tháng [84] 1.2 Ung thƣ biểu mô tuyến phổi 1.2.1 Đặc điểm ung thư biểu mô tuyến Ung thư biểu mô tuyến chiếm khoảng 40% số trường hợp ung thư phổi (Hình 1.3) Ung thư thường bắt đầu tế bào tiết thông thường tế bào tiết chất nhầy [57, 84] Ung thư biểu mô tuyến xảy người hút thuốc, phổ biến người không hút thuốc Ngồi ra, ung thư biểu mơ tuyến phổi phổ biến nữ giới nam giới hay gặp người trẻ tuổi loại ung thư phổi khác [84] Ung thư biểu mô tuyến phổi thường tìm thấy phần bên ngồi phổi Mặc dù có xu hướng phát triển chậm so với dạng ung thư phổi khác khả phát trước ung thư lan rộng lại khác bệnh nhân Những bệnh nhân ung thư phổi chỗ (Adenocarcinoma in situ) thường có tiên lượng tốt so với loại ung thư phổi khác [57, 84] Ung thư biểu mô tuyến ngoại vi phổi cho phát sinh từ tổn thương tiền ung thư gọi tế bào ung thư tân sản (Neuoplasia) sau phát triển thành tế bào ung thư phân chia q mức khơng điển hình (Atipical Adenomatous Hyperplasias - AAH), AAH coi hình ảnh mơ học q trình hình thành khối u ác tính (Hình 1.4) [41] AAH mang biến đổi di tuyền di truyền ngoại gen tương tự với biến đổi tìm thấy ung thư tuyến phổi kể đột biến KRAS, EGFR, TP53, đoạn dị hợp tử cánh dài nhiễm sắc thể số cánh ngắn nhiễm sắc thể số 16, biến đổi truyền ngoại gen WNT [59] Từ AAH tiếp tục hình thành ung thư biểu mơ tuyến chỗ (AIS – Adenocarcinoma in situ) hay gọi ung thư biểu mô tiểu phế nang (BAC – Bronchioloalveolar Carcinoma); lần tiến tới giai đoạn tiền ung thư trước gọi ung thư biểu mô tiểu phế nang (BAC) Đây coi giai đoạn không xâm lấn tế bào ung thư tuyến tân sản chúng thể tăng kích thước hình thái tế bào khơng điển hình Giai đoạn ung thư hình thành xâm lấn tối thiểu (MIA – Minimally Invasive Adenocarcinoma), định nghĩa ung thư biểu mô tuyến nhỏ (kích thước nhỏ cm) với thành phần chủ yếu tổn thương lepidic xâm lấn nhỏ 5mm vị trí Sau khối u chuyển sang trình xâm lấn (Invasive Carcinoma) yếu tố khơng xâm lấn tồn cạnh khối u [59] Di giai đoạn cuối trình phát triển khối u Ung thư biểu mơ phổi di theo hệ bạch huyết mạch máu Sự di theo đường mạch máu thường thấy khối u giai đoạn thấp, thường dẫn đến tăng tỷ lệ tái phát rút ngắn thời gian sống sót bệnh nhân Trong di qua đường bạch huyết thường nhiều thời gian cho hình thành khối u di căn, di qua đường bạch huyết hình thành khối u di xa [39] Ung thư biểu mô phổi có số địa điểm ưu tiên cho di như: Não, xương tuyến thượng thận Các quan khác có di thường giai đoạn cuối bệnh Đối với loại ung thư phổi khác có ưu tiên hình thành khối u di không giống nhau, chẳng hạn di gan ung thư biểu mô phổi tế bào nhỏ di não ung thư tuyến mơ [39] 10 Hình 1.4 Q trình hình thành ung thư biểu mơ tuyến [59] 1.2.2 Các phân típ mơ bệnh học ung thư biểu mô tuyến Khối u ung thư biểu mơ tuyến thể biệt hóa tuyến với hay nhiều dạng phát triển gồm số dạng chính: Tổn thương lepidic, chùm nang, nhú, vi nhú dạng đặc … (Hình 1.5) [57, 84] Tổn thương lepidic: Đây phát triển khơng điển hình tế bào vng đơn dọc theo thành phế nang có đặc điểm: Cấu trúc phế nang trì; khơng có sẹo xơ trung tâm hay lan rộng; thường có dày thành phế nang; khơng có phát triển dạng tầng; không tạo cấu trúc nhú Nếu mảnh sinh thiết thấy phát triển đơn thành phần lepidic khơng loại trừ u có thành phần xâm nhập [84] Ung thư biểu mô tuyến nhú (Papillary Adenocarcinoma): U thường đơn độc bao gồm cấu trúc nhú phủ tế bào kích thước lớn, khơng điển hình với nhân lớn, tăng sắc, hạt nhân rõ, nhiều nhân chia (Hình 1.5A) [84] 11 Hình 1.5 Một số phân típ phổ biến ung thư biểu mô tuyến phổi (A) ung thư biểu mô tuyến nhú (HE x 100); (B) ung thư biểu mô tuyến vi nhú (HE x 400); (C) ung thư biểu mô tuyến nhầy xâm nhập (HE x 400); (D) ung thư biểu mô tuyến dạng chùm nang (HE x 200) [84] Ung thư biểu mô tuyến vi nhú (Micropapillary Adenocarcinoma): Cấu trúc u gồm tế bào phát triển tạo búi nhú khơng có trục liên kết xơ mạch U liên tục với thành phế nang không Tế bào u thường nhỏ, vng đơn, nhân khơng điển hình mức độ nhẹ Thường có xâm nhập mơ đệm xâm nhập mạch Tỷ lệ xâm lấn di cao (Hình 1.5B) [84] Ung thư biểu mô tuyến nhầy xâm nhập (Invasive Mucinous Adenocarcinoma): Cấu trúc u gồm tế bào trụ có chế nhầy cực ngọn, nhân nhỏ nằm cực đáy Tế bào u lót dọc thành phế nang, tạo cấu trúc nhú (Hình 1.5C) [84] 12 Ung thư biểu mô tuyến chùm nang (Acinar Adenocarcinoma): U có dạng nang, túi tuyến ống với tế bào hình trụ hình khối vng, nhân lệch đáy, chế nhày, gợi tuyến phế quản (Hình 1.5D) [84] Ung thư biểu mơ tuyến đặc (Solid adenocarcinoma): U khơng có cấu trúc nhú, ống, nang; thay vào mảng tế bào hình đa diện có tế bào chế nhày vi trường có độ phóng đại lớn [84] Ung thư biểu mơ tuyến bào thai (Fetal Adenocarcinoma): Thường gặp độ tuổi trẻ típ khác U gồm tuyến ống lót tế bào trụ khơng có lơng với bào tương sáng, nhân nằm cực đáy thường có hốc Đơi u gợi hình ảnh u ngun bào phổi típ đơn pha (Monophasic Pulmonary Blastoma) Xảy đột biến gen β – catenin [84] Ung thư biểu mô tuyến nhày dạng keo (Mucinous “Colloid” Adenocarcinoma): U có đặc điểm giống với loại u tên đường tiêu hóa U gồm cấu trúc ống, tuyến kích thước khơng đều, mơ đệm có nhiều chất nhày đặc quánh Tế bào u trôi bể chất nhày [84] 1.3 Biến đổi gen EGFR ung thƣ phổi 1.3.1 Cấu trúc chức gen EGFR EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) nằm họ thụ thể yếu tố phát triển biểu bì bao gồm HER-1 (EGFR), HER-2, HER-3 HER-4 phân lớp thụ thể Tyrosine Kinase (Tyrosine Kinase Receptor) [12] Protein EGFR glycoprotein màng có kích thước 170 kDa với cấu trúc gồm phần là: Phần gắn phối tử ngồi màng, phần protein xuyên màng phần bên tế bào chất với vùng hoạt hóa Tyrosine Kinase mã hóa gen EGFR nằm cánh ngắn nhiễm sắc thể (7p12) gồm 28 exon EGFR chứa số yếu tố lặp lại, bao gồm SINE LINE, vùng giàu (TGG/A) intron 15, vùng lặp lại CA intron 27, đặc biệt exon giàu trình tự GC [49,114] EGFR có vai trò quan trọng trình nhân lên, chết theo chương trình, di động, xâm nhập, sửa chữa tương tác tế bào với tế bào Khi phân tử EGFR kết hợp với phối tử chúng thực trình nhị trùng hợp (homo/heterodimeration) hoạt hóa phân tử EGFR qua kích hoạt hai đường truyền tín hiệu tế bào đường qua PI3K/AKT/m-TOR RAS/RAF1/MAP2K1/MAPK1 làm cho tế 13 bào tăng phân chia, tăng khả sống sót chống lại q trình chết theo chương trình [96] Hình 1.6 Đường truyền tín hiệu thông qua phân tử EGFR [96] Con đường MAPK RAS-RAF-MEK-ERK đường quan trọng liên quan đến phản ứng sinh học EGFR, có gen RAS RAF tác nhân tiền gây ung thư (Hình 1.6) Mục tiêu liệu pháp điều trị ung thư MEK MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase) tương tác với 100 chất để khởi đầu loạt phản ứng sinh lý bệnh lý, bao gồm tăng trưởng, biệt hóa, di cư ức chế chết theo chương trình (Apoptosis) [96] Hệ thống dẫn truyền tín hiệu PI3K-AKT-mTOR kiểm sốt trao đổi chất, tăng sinh, kích thước tế bào, sống tính di động tế bào Trong ung thư, đường thường kích hoạt trạng thái tăng hoạt động tạo đột biến thành viên tham gia vào đường, chẳng hạn EGFR, PI3K, AKT; ngược lại đường giảm biểu gen ức chế khối u PTEN, từ ức chế hoạt động PI3K Con đường PI3K-AKT-mTOR rối loạn bệnh tiểu đường, tự kỷ lão hóa [22] 14 1.3.2 Đột biến gen EGFR ung thư phổi Đột biến hoạt hóa gen gây ung thư xem điểm nhạy ung thư Khi gen gây ung thư nhạy cảm với chất ức chế, đặc tính tăng sinh tế bào u bị loại bỏ, đặc biệt gây chết tế bào [149] Liệu pháp điều trị kháng EGFR ung thư phổi sử dụng trước có hiểu biết đột biến gen EGFR hoạt hóa Cụ thể, Gefitinib, sử dụng trường hợp quần thể khơng sàng lọc, có tỷ lệ đáp ứng 10 – 20% Erlotinib liên quan đến việc cải thiện thời gian sống thêm bệnh nhân, đặc biệt hiệu điều trị rõ rệt trường hợp ung thư biểu mô tuyến mang đột biến xảy với tỷ lệ cao bệnh nhân nữ giới, không hút thuốc chủng tộc Châu Á [70] Hình 1.7 Tần suất dạng đột biến gen EGFR [127] Đến nay, phát khoảng 40 đột biến khác gen EGFR nằm rải rác exon từ 18 – 21 thuộc vùng kinase domain (Hình 1.7) [127] Đột biến dẫn đến tự động hoạt hóa phân tử EGFR mà khơng cần đến có mặt phối tử Kết q trình làm cho tế bào ung thư tăng cường phân chia, 15 khả sống sót, tăng khả di căn, xâm lấn chống lại chết theo chương trình [88, 127] Hầu hết đột biến thường gặp đột biến điểm đột biến đoạn dẫn đến sai lệch khung đọc mở, đột biến đoạn exon 19 đột biến thay L858R exon 21 chiếm khoảng 90% tổng số trường hợp bị đột biến [88, 127] Ba đột biến điểm thường gặp G791C, L858R L861Q; ba đột biến đoạn Del E746 – A750, Del L747 – T751inS Del L747 – T753inS [85] Tỷ lệ đột biến gen EGFR bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến phổi tương đối khác nghiên cứu Những nghiên cứu thực bệnh nhân phương tây có tỷ lệ đột biến thấp 10 – 15% [8] Trong nghiên cứu cơng bố người châu Á có tỷ lệ đột biến 30 – 60% [105] Đột biến gen EGFR thường gặp bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến phổi nữ giới không hút thuốc [8, 105] Những hiểu biết sinh học phân tử, nguyên nhân chế phát triển ung thư nói chung ung thư phổi nói riêng góp phần quan trọng việc xây dựng phác đồ điều trị có hiệu nhiều so với phương pháp điều trị truyền thống trước khả lui bệnh chất lượng sống bệnh nhân ung thư [55] Tyrosine Kinase Inhibitors (TKIs) chất ức chế hoạt hóa phân tử EGFR phát triển dựa hiểu biết đột biến gen ung thư phổi [55, 139] TKIs gắn vào vị trí bám ATP phân tử EGFR làm cho phân tử hoạt hóa làm cho đường truyền tín hiệu qua EGFR không hoạt động Sự bất hoạt phân tử EGFR làm cho tế bào khả phân chia, giảm khả sống sót vào đường chết theo chương trình [68] Trong đột biến gen EGFR biết hầu hết đột biến có đáp ứng tốt với TKIs hệ thứ hệ thứ hai đột biến chiếm tỷ lệ lớn đoạn exon 19 thay L858R exon 21 nghiên cứu thử nghiệm nhiều Có nhiều cơng trình nghiên cứu công bố hiệu sử dụng TKIs bệnh nhân ung thư phổi [55, 68, 139] Những nghiên cứu cải thiện đáng kể tỷ lệ đáp ứng điều trị, thời gian tái phát u thời gian sống thêm bệnh nhân mang đột biến sử dụng TKIs so với bệnh nhân không sử dụng thuốc bệnh nhân không mang đột biến [55, 68] 16 1.3.3 Biểu protein EGFR ung thư phổi Biểu protein có liên quan mật thiết đến methyl hóa khuếch đại gen EGFR [80, 95] Methyl hóa làm giảm biểu protein khuếch đại gen lại tăng cường mức độ biểu [95, 122] Mức độ biểu protein chia thành cấp độ khác từ đến 3+ tùy thuộc vào cường độ tỷ lệ phần trăm tế bào có biểu protein EGFR bề mặt[80] Phương pháp xác định mức độ biểu EGFR bề mặt tế bào phổ biến hóa mô miễn dịch, sử dụng kháng thể kháng EGFR đặc hiệu kết hợp với hệ enzyme – chất tạo mầu đặc trưng quan sát kính hiển vi quang học [80] Khoảng 60 – 80% trường hợp ung thư biểu mơ tuyến phổi có biểu protein EGFR, biểu mức EGFR chiếm khoảng 35 – 50% [80, 122] Sự biểu EGFR phụ thuộc vào giai đoạn tiến triển bệnh Có đến 50% trường hợp bệnh nhân giai đoạn III có biểu mức EGFR tỷ lệ giai đoạn I II 20% 25% Sự biểu mức EGFR kèm với tiên lượng xấu cho bệnh nhân, thể việc tăng nguy xâm lấn di căn; ức chế biểu EGFR dẫn đến giảm phân chia tế bào ung thư, di cư, hình thành mạch máu trình apoptosis khối u thể rắn [122, 150] Biểu EGFR tế bào ung thư kiểm soát chặt chẽ, nhiên chế kiểm soát chưa nghiên cứu đầy đủ Điều hòa di truyền ngoại gen chế sinh học mà gen biểu hay bị kìm hãm thơng qua q trình methyl hóa DNA, biến đổi Histone miRNA, phổ biến tập trung nhiều methyl hóa DNA Nghiên cứu trạng thái methyl hóa vùng promoter liên quan đến biểu protein EGFR tạo điều kiện cho phát triển dấu ấn sinh học hữu ích thử nghiệm lâm sàng [150] 1.4 Methyl hóa DNA ung thƣ phổi 1.4.1 Methyl hóa DNA Methyl hóa DNA tượng gắn thêm gốc methyl (CH3) vào vị trí 5’ C nucleotide Ở số trường hợp, Adenine bị methyl hóa phổ biến đóng vai trò chế bảo vệ vi khuẩn [134] Trong động vật có vú, methyl hóa DNA xảy Cytosine đứng trước Guanine phức CpG tạo thành – methylcytosine (5mC) [81] Trong hệ gen người, đảo CpG vùng giàu phức 17 CpG, có kích thước từ 0,5 – 5,0 kb thường tìm thấy vùng promoter gen Khi đảo CpG bị methyl hóa, gen khơng phiên mã Methyl hóa xảy đảo CpG thuộc vùng promoter gen chiếm ưu so với vị trí khác, đánh giá tình trạng methyl hóa DNA thường xem xét vùng chứa đảo CpG (Hình 1.8) [54] Ngồi ra, methyl hóa DNA có vai trò định tế bào trạng thái bình thường in dấu gen, trì trạng thái dị nhiễm sắc, trì trạng thái bất hoạt nhiễm sắc thể X động vật có vú [128] Ở tế bào bình thường, Cytosine phức CpG khơng bị methyl hóa q trình phát triển biệt hóa mơ; nhiên đảo CpG thuộc vùng promoter gen bị methyl hóa dẫn đến trạng thái ức chế phiên mã gen Methyl hóa DNA hình thành q trình biệt hóa tế bào, làm tế bào phần hoàn toàn khả phân chia Methyl hóa DNA có tính đặc hiệu mô thể, vai trò tượng tế bào khác khơng giống Ở tế bào bình thường, promoter mang đảo CpG khơng bị methyl hóa có chức trì cấu trúc nhiễm sắc thực, cấu trúc hoạt hóa phiên mã cho phép gen biểu Tuy nhiên, trình phát sinh ung thư, CpG vùng promoter nhiều gen bị methyl hóa gây ức chế biểu gen thay đổi cấu trúc nhiễm sắc thực thành cấu trúc dị nhiễm sắc Enzyme DNA methyltransferase (DNMT1) DNA methyltransferase 3a, 3b (DNMT3a, DNMT3b) thực q trình methyl hóa DNA [117] DNMT1 trì nhóm methyl cho sợi DNA sau tái bản; trì trạng thái methyl hóa cho hệ sau [43] DNMT1 tương tác với số protein HDACs HMTs tạo phức liên kết với CpG bị methyl hóa, từ hình thành hệ thống phức tạp điều hòa xếp lại chất nhiễm sắc mức độ biểu gen Nhóm DNMT3 gồm enzyme DNMT3a, DNMT3b DNMT3L DNMT3a 3b enzyme methyl hóa DNA vị trí (denovo methylation) DNMT3b DNMT1 trì methyl hóa mức gen ức chế khối u p16INK4a dòng tế bào ung thư đại trực tràng [115] Khi hoạt tính hai enzyme bị ức chế, mức độ methyl hóa gen giảm tới 95% [115] Trong đó, DNMT3L có chức methyl hóa DNA gen in dấu (imprinting genes) [53] 18 Methyl hóa DNA chia thành loại: Methyl hóa mức methyl hóa mức Methyl hóa DNA mức ung thư thường xảy trình tự lặp lại, yếu tố vận động Alu hay LINE1, vùng DNA vệ tinh α gần tâm động Kết thúc đẩy vận động yếu tố di truyền, tăng khả xếp lại hệ gen phát sinh khối u Ví dụ methyl hóa mức promoter yếu tố vận động L1 xuất nhiều loại ung thư thận, bàng quang, đại trực tràng [18] Bên cạnh trình tự lặp lại yếu tố vận động, nghiên cứu gần methyl hóa mức xảy gen đơn loại ung thư Shao cs (2011) phát gen bị methyl hóa mức, bao gồm gen AQP1, CECR1, C1QR1, CTAG2, P53AIP1, TDRD12, BEX1 DYNLT3 ung thư biểu mô tuyến nước bọt, Gupta A cs (2003) có methyl hóa mức gen synuclein γ ung thư vú ung thư buồng trứng [45,124] Bên cạnh đó, methyl hóa mức có vai trò phát sinh ung thư cách hoạt hóa gen gây ung thư cMYC H-RAS [33] Hình 1.8 Methyl hóa DNA tế bào bình thường tế bào ung thư [43] Methyl hóa mức vùng promoter chế phổ biến gây bất hoạt gen ức chế khối u, xuất nhiều loại ung thư thể rắn Chẳng hạn, nhiều gen bị bất hoạt methyl hóa mức ung thư vú gen tham gia mã hóa thụ thể steroid ER, PR; gen mã hóa protein liên kết tế bào E-cadherin; gen có chức 19 sửa chữa DNA BRCA1, TIMP-3 [29, 111] Trong đó, methyl hóa mức gen p15, p21, ER, SDC4, MDR liên quan tới dạng ung thư máu [75] Bên cạnh gen RASSF1A p16 thường bị methyl hóa nhiều loại ung thư, số gen methyl hóa đặc hiệu loại ung thư, ví dụ gen GSTP1 bị methyl hóa mức 90% ung thư tuyến tiền liệt [91] Hơn nữa, mức độ methyl hóa gen loại ung thư khác Ví dụ gen RASSF1A bị methyl hóa ung thư đại tràng bị methyl hóa cao ung thư vú, ung thư tuyến tiền liệt [29, 91, 111] 1.4.2 Methyl hóa gen EGFR, BRCA1, MLH1, MGMT RASSF1A ung thư phổi Ung thư phổi nguyên nhân gây tử vong hàng đầu giới Di truyền ngoại gen xem dấu ấn phân tử giai đoạn sớm hình thành ung thư, hỗ trợ chẩn đoán, tiên lượng định hướng điều trị Methyl hóa DNA, biến đổi Histone miRNA lĩnh vực di truyền ngoại gen, methyl hóa DNA phổ biến tập trung nghiên cứu [61] Hiện nay, hầu hết dấu chuẩn ngoại gen ung thư phổi phát triển ứng dụng ngày rộng rãi lâm sàng Methyl hóa mức hay mức vùng chứa đảo CpG chứng minh liên quan đến ung thư phổi Đặc biệt, methyl hóa mức vùng CpG thường xảy giai đoạn sớm trình phát sinh ung thư [61] Nhiều gen methyl hóa mức ung thư phổi bao gồm p16, PAK3, NISCH, KIF1A, OGDHL, BRMS1, FHIT, CTSZ, CCNA1, NRCAM, LOX, MGMT, DOK1, SOX15, TCF21, DAPK, RAR, RASSF1, CYGB, MSX1, BNC1, CTSZ CDKN2A [104,110] Tần suất methyl hóa gen có biến đổi rộng, số gen p16 hay MGMT, tỷ lệ methyl hóa lên đến 100% trường hợp chẩn đoán ung thư phổi tế bào nhỏ trước năm Một số gen ức chế khối u bị methyl hóa mức có vai trò q trình tế bào khác nhau, chẳng hạn điều chỉnh chu kỳ tế bào (p16), sửa chữa DNA (MGMT), apoptosis (DAPK, caspase 8, ARF, FAS, TRAILR1, RASSF1A, NORE1A G0S2) [104, 109] Protein p16 thúc đẩy q trình chuyển pha G1 sang pha S khơng biểu methyl hóa promoter chiếm 70% ung thư phổi Điểm đặc biệt methyl hóa mức p16 thường xảy tế bào biểu 20 mô người hút thuốc dạng tổn thương, tần suất methyl hóa tăng lên với tiến triển ung thư Các nghiên cứu chứng minh thay đổi q trình methyl hóa q mức Cytosine có giá trị chẩn đốn tiên lượng ung thư phổi, số trường hợp sử dụng để dự đốn đáp ứng điều trị Zhang cs (2011) đánh giá methyl hóa 20 gen ức chế khối u 78 mẫu UTPKTBN 50 mẫu đối chứng cho thấy gen (APC, RASSF1A, CHD13, KLK10 DLEC1) bị methyl hóa cao đáng kể bệnh nhân ung thư phổi với độ nhạy 83,64% độ đặc hiệu 74%, gợi ý panel chẩn đoán bệnh nhân UTPKTBN Trung Quốc [157] Nghiên cứu tương tự 64 bệnh nhân UTPKTBN, bệnh nhân có gen bị methyl hóa đồng thời hệ thống 15 gen nghiên cứu (APC, CHD13, KLK13, DLEC1, RASSF1A, EFEMP1, SFRP1, RAR, p16INK4A, RUNX3, Hmlh1, DAPK, BRCA1, p14ARF) có tỷ lệ có tỷ lệ sống sót sau năm trường hợp bệnh nhân bị methyl hóa gen (13,8 tháng so với 17,8 tháng) Salazar cs khẳng định trình methyl hóa gen hữu ích việc dự đốn đáp ứng điều trị, cụ thể bệnh nhân có gen CHFR khơng bị methyl hóa đáp ứng với thuốc ức chế TKIs tốt so với trường hợp CHFR bị methyl [119] Bên cạnh methyl hóa mức, methyl hóa mức có vai trò định ung thư phổi Chẳng hạn, gen H19, IGF2 MEST bị in dấu methyl hóa mức phát tế bào ung thư phổi, làm kiểm sốt q trình tăng trưởng tế bào 1.4.2.1 Methyl hóa gen EGFR Bên cạnh nghiên cứu đột biến gen, nghiên cứu methyl hóa gen EGFR nhận nhiều quan tâm Methyl hóa gen EGFR tập trung nghiên cứu vùng promoter nằm khoảng –300 đến –100 đầu 5’ khơng dịch mã [120] Sự methyl hóa gen EGFR nghiên cứu số ung thư ung thư đại trực tràng, ung thư vú ung thư đầu cổ dạng tế bào vẩy ung thư phổi [95, 120] Tế bào phổi bình thường khơng xảy tượng methyl hóa EGFR, tượng xảy tế bào ung thư [95] Một nghiên cứu 54 mẫu bệnh phẩm từ bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ Hoa Kỳ cho thấy 11% trường hợp có vùng promoter gen EGFR bị methyl hóa [95] Tuy nhiên, số công bố tương tự bệnh nhân người Trung 21 Quốc lại cho thấy methyl hóa EGFR xảy phổ biến với tỷ lệ 30 - 40% [77, 106] Hình 1.9 Các vị trí methyl hóa gen EGFR 1.4.2.2 Methyl hóa gen BRCA1 BRCA1 ( Breast cancer – associated gene 1) gen ức chế khối u chủ yếu liên quan đến ung thư vú ung thư buồng trứng xác định tách dòng lần đầu năm 1994 Miki cs [93] Gen BRCA1chứa 24 exon với dài khoảng 100kb nằm cánh dài NST17 (17q21) mã hóa cho protein BRCA1 có chức sửa chữa DNA apotosis tế bào (Hình 1.10) [93] Hình 1.10 Cấu trúc gen BRCA1 người [97] Trong tế bào bình thường, BRCA1 mã hóa cho phosphoprotein đóng vai trò quan trọng việc trì ổn định di truyền, đồng thời hoạt động gen ức chế khối u BRCA1 tham gia điều khiển biểu p53, GADD45 đồng thời có vai trò trình sửa chữa tượng gãy DNA sợi đơi [66] BRCA1 tương tác trực tiếp với phức hợp sửa đổi NST SWI/SNF, với nhân tố điều hòa q trình acetyl hóa khử acetyl hóa histone, với DNA helicase bao gồm BLM BACH1 để tham gia vào q trình điều hòa phiên mã [133] (Hình 1.11) Methyl hóa vùng promoter gen BRCA1 tìm thấy chủ yếu ung thư vú ung thư buồng trứng Hiện tượng methyl hóa BRCA1 xảy chủ yếu đảo CpG chứa 30 vị trí CpG, nằm từ vị trí –567 đến +44 (Hình 1.10) Các nghiên cứu 22 đảo CpG vai trò quan trọng điều hòa phiên mã khơng bị methyl hóa tế bào bình thường lại có nhiều biến đổi trạng thái methyl tế bào ung thư [116] Sự methyl hóa BRCA1 ung thư vú nghiên cứu rộng rãi giới, kết cho thấy có khác mức độ methyl gen xảy với tỷ lệ cao người châu Á so với nước phương tây châu Úc [155] Ở Việt Nam, tỷ lệ methyl hóa gen BRCA1 xảy 58,2% bệnh nhân ung thư vú 18,6% bệnh nhân ung thư buồng trứng [142, 143] Hình1.11 Chức ức chế khối u BRCA1[125] Đã có số nghiên cứu tương methyl hóa vùng promoter gen BRCA1 ung thư phổi không tế bào nhỏ Nghiên cứu tiến hành Hòa Kỳ năm 2004 với 158 bệnh nhân, kết cho thấy có 4% trường hợp phát có methyl hóa gen [89] Những nghiên cứu sau bệnh nhân người Đài Loan Trung Quốc cho thấy tượng methyl hóa BRCA1 xảy phổ biến bệnh nhân ung thư phổi không tế bảo nhỏ bệnh nhân Châu Á với tỷ lệ 30% 27% [40, 73] Khơng vậy, methyl hóa q mức BRCA1 ung thư phổi cho thấy tiên lượng xấu cho bệnh nhân [40] 1.4.2.3 Methyl hóa gen MLH1 Gen MLH1 (human mutL homolog 1) nằm vị trí 3p22.2 nhiễm sắc thể số bao gồm 19 exon với kích thước khoảng 57 kb Protein in MLH1 chứa 756 acid amin với khối lượng phân tử 84,6 kDa (Hình 1.12) [24] MLH1 23 sáu thành phần phức hợp sửa chữa bắt cặp sai DNA bao gồm: MSH2, MLH1, PMS2, MSH3, MSH6 MPS1 Đối với bắt cặp sai một vài nucleotide MLH1 kết hợp với PMS2/1, MSH2 MSH6 để loại bỏ trình tự bắt cặp sai sợi DNA sau sợi DNA tổng hợp dựa sợi DNA bổ sung lại Ngược lại bắt cặp sai nhiều nucleotide, MLH1 kết hợp với PMS2/1, MSH2 MSH3 để tạo thành phức hợp sữa chữa (Hình1.13) [90] Hình1.12 Cấu trúc gen MLH1 [24] Hình1.13 Các phức hợp sửa chữa DNA MLH1 [90] Đột biến tế bào mầm gen MLH1 có liên quan đến hội chứng Lynch ung thư đại trực tràng với tần suất khoảng 37% [154] Ngồi methyl hóa vùng 24 promoter gen MHL1 phát phổ biến ung thư đại tràng với tỷ lệ khoảng 18% [78] Không vậy, đột biến tế bào mầm MLH1 methyl hóa mức MLH1 phát đồng thời bệnh nhân ung thư đại trực tràng Ngoài ra, methyl hóa mức MLH1 quan sát số ung thư khác như: Ung thư phổi ung thư dày [123] Methyl hóa MLH1 ung thư phổi nghiên cứu phổ biến, với tỷ lệ nằm khoảng từ – 58% [23] Một nghiên cứu 72 người Châu Âu vào năm 2006 không phát methyl hóa MLH1 bệnh nhân [137] Tuy nhiên, số nghiên cứu khác bệnh nhân ung thư phổi Trung Quốc lại cho thấy tỷ lệ methyl cao gen MLH1, đạt 35 – 56% [123, 148] Ngoài ra, Seng T.J cs (2008) so sánh tỷ lệ sống sót bệnh nhân bị methyl hóa khơng methyl hóa MLH1 cho thấy bệnh nhân mang gen MLH1 bị methyl hóa có tiên lượng xấu có thời gian sống sót thấp nhóm khơng methyl hóa [110] 1.4.2.4 Methyl hóa gen MGMT MGMT (O6-methylguanine DNA methyltransferase) protein có khả sửa chữa DNA có gắn chất gây ung thư tự bất hoạt Trình tự gen MGMT nhân lần vào năm 1988 Gen nằm nhiễm sắc thể 10 vị trí 10q26, bao gồm exon intron kéo dài 300 kb (Hình 1.14) Protein MGMT có chiều dài 207 axit amin bảo tồn thơng qua q trình tiến hóa [126, 127] MGMT tham gia vào nhiều đường sửa chữa sai hỏng DNA tế bào, thông qua việc loại bỏ nhóm Alkyl gắn vào Guanine Trong trường hợp khơng có có mặt MGMT, O6-meG chưa chỉnh sửa kết hợp với Cytosine Thymine dẫn đến lỗi bắt cặp sai O6-meG/T (Hình 1.15) Thiếu hụt MGMT methyl hóa mức thường quan sát thấy ung thư biểu mô đại trực tràng, u thần kinh đệm, ung thư phổi không tế bào nhỏ, u lympho ung thư biểu mô cổ đầu Trong ung thư đại trực tràng, bất hoạt MGMT kiện sớm liên quan đến phát sinh đột biến Hiện tượng methyl hóa promoter MGMT phát khoảng 45% bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm (GBM-Glioblastoma), liên quan đến việc tăng độ nhạy cảm với TMZ kéo dài thời gian sống thêm bệnh nhân [28] 25 Hình1.14 Cấu trúc gen MGMT [30] Methyl hóa vùng promoter MGMT quan sát ung thư phổi, nhiên tình trạng methyl hóa MGMT cho thấy khác báo cáo (8 – 50%) [113] Một nghiên cứu bệnh nhân Hàn Quốc cho thấy tỷ lệ methyl MGMT 17% [69] Trong đó, kết phân tích bệnh nhân người Trung Quốc có tỷ lệ methyl hóa gen cao nhiều 30 – 50% [83, 151] Đồng thời, methyl hóa MGMT bệnh nhân ung thư phổi giai đoạn I-III bệnh nhân trẻ tuổi cho thấy tiên lượng xấu trình tiến triển ung thư phổi [14] Hình 1.15 Cơ chế sửa chữa DNA MGMT [100] 26 1.4.2.5 Methyl hóa gen RASSF1A RASSF1A (Ras association domain-containing protein 1A) đồng phân gen RASSF1 bao gồm RASSF1A, RASSF1B, RASSF1C, RASSF1D, RASSF1E, RASSF1F, RASSF1G, RASSF1H RASSF1 nằm vị trí 3p21.3 nhiễm sắc số có kích thước khoảng 11 kb bao gồm exon [87] RASSF1A bao gồm exon 1α, 2αβ, 3, 4, 5, mã hóa cho chuỗi polypeptide ngắn với 340 axit amin có trọng lượng phân tử 38,8 kDa (Hình 1.16) [87] (Hình 1.16) Hình 1.16 Cấu trúc gen RASSF1A đồng phân [87] RASSF1A gen ức chế khối u tham gia vào đường điều hòa phát triển chết theo chương trình tế bào (Hình 1.16) [87] RASSF1A tham gia tổng hợp thoi vơ sắc gây kìm hãm chu kì tế bào cách tác động đến protein Rb (Retinoblastoma protein) RASSF1A ức chế q trình tích lũy cyclin D1 điều khiển phosphoryl hóa Rb kiểm sốt chương trình chết tự nhiên tế bào từ pha G1 Nhờ RASSF1A ức chế chu kỳ tế bào điểm chuyển đổi G1/S [87] Ngoài ra, RASSF1A kết hợp với serine/threonine kinase MST1 (mammalian sterile twenty - like protein) để điều khiển Ras theo đường chết theo chương trình [2] RASSF1A chứng minh có khả ức chế xâm lấn di dòng tế bào ung thư phổi thông qua ức chế protein YAP (Yes-associated protein) [26] 27 Methyl hóa mức gen RASSF1A xảy chủ yếu đảo CpG – A gồm 48 vị trí CpG nằm vùng promoter exon [87] Hiện tượng methyl hóa RASSF1A phát nhiều ung thư khác như: U nguyên bào thần kinh, ung thư biểu mô tuyến giáp, ung thư gan, tụy, tuyến thượng thận … đặc biệt phổ biến ung thư đường tiêu hóa [87] Tuy nhiên, mức độ methyl hóa gen RASSF1A khơng cho thấy tương đồng dạng ung thư khác đường tiêu hóa Tỷ lệ methyl hóa gen ung thư biểu mô tế bào gan 78% u nguyên bào gan có 34,6% trường hợp Tương tự, tỷ lệ methyl hóa RASSF1A dạng ung thư đường tiêu hòa khác là: Ung thư biểu mô tế bào vảy thực quản 50%, ung thư tuyến tụy tuyến tụy 54%, u nội tiết tụy 75%, ung thư biểu mô đại trực tràng 35,6% dày 31% [87] Hình 1.17 Chức ức chế khối u RASSF1A [25] Methyl hóa RASSF1A nghiên cứu rộng rãi trở thành dấu chuẩn chẩn đoán điều trị ung thư phổi Tỷ lệ methyl hóa RASSF1A nghiên cứu khác từ 20 – 80% [146] Một số nghiên cứu methyl hóa RASSF1A có tiên lượng xấu bệnh nhân ung thư phổi Những bệnh nhân mang gen RASSF1A bị methyl hóa có thời gian sống thêm thời gian sống không bệnh ngắn so với bệnh nhân khơng methyl hóa RASSF1A [21,74] Ngồi ra, methyl hóa RASSF1A có liên quan đến tiền sử hút thuốc bệnh nhân Năm 2011, Yanagawa N cs tiến hành phân tích 62 bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến phổi, kết cho thấy tỷ lệ methyl hóa RASSF1A nhóm khơng hút thuốc 28 34,6% tỷ lệ nhóm hút thuốc 61,9% [153] Nghiên cứu Lee S.M cs (2011) cho kết tương tự [74] Vì vậy, hút thuốc nguyên nhân gây nên methyl hóa RASSF1A bệnh nhân ung thư phổi 1.5 Điều trị đích ung thƣ ung thƣ phổi 1.5.1 Điều trị đích ung thư Ung thư thể rắn người gây nhiều nguyên nhân bao gồm thay đổi di truyền di truyền ngoại gen Trong phương pháp điều trị ung thư, hóa trị truyền thống chấp thuận từ 60 năm trước Các thuốc hóa trị nhắm vào tế bào ung thư có đặc điểm phân chia nhanh, nhiên, loại thuốc nhắm vào số tế bào bình thường, chẳng hạn tế bào biểu mơ ruột Với mục đích nhắm tới tế bào, liệu pháp điều trị đích phát triển nhằm ngăn chặn phát triển di ung thư Thay điều trị tồn hệ gen, liệu pháp điều trị đích tập trung vào thay đổi phân tử cụ thể giúp mang lại lợi ích điều trị cho nhiều loại ung thư phổi, đại trực tràng, vú, ung thư hạch bệnh bạch cầu [7] Từ năm 2000, quan quản lý thuốc thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) phê duyệt 15 liệu pháp điều trị đích ung thư Liệu pháp điều trị đích chia thành loại chính: 1) Kháng thể đơn dòng, 2) Chất ức chế phân tử nhỏ 3) Độc tố miễn dịch Mỗi liệu pháp điều trị có ưu khuyết điểm riêng dựa việc xác định thay đổi phân tử đặc hiệu tế bào ung thư, điều trị hiệu gây hại cho mơ tế bào bình thường phác đồ điều trị Những thay đổi bất thường hoạt tính kinase đường chủ yếu làm tế bào bình thường chuyển dạng sang ung thư Các chất ức chế phân tử nhỏ cạnh tranh vị trí liên kết Tyrosine Kinase dẫn tới bất hoạt kích hoạt ATP Các chất nhắm đến protein khơng kiểm sốt tăng biểu trình tiến triển ung thư BCR-ABL, Akt hay mTOR Khi phân tử liên kết với đích đặc hiệu, chúng bất hoạt vùng Tyrosine Kinase, từ ngăn chặn đường tín hiệu Các thuốc thuộc dòng đặc biệt có hiệu bệnh nhân điều trị kết hợp với phương pháp hóa trị Hiện nay, 20 đích kinase khác phát triển thử nghiệm lâm sàng [42] 29 Một cách điều trị đích tạo kháng thể đơn dòng chống lại protein đích có vai trò q trình hình thành khối u Các nhà khoa học phát triển kháng thể đơn dòng nhắm tới loạt protein liên quan đến nhiều loại ung thư Ba chế phá hủy tế bào ung thư bao gồm: Phá vỡ chức protein tín hiệu theo sau; gây độc tính độc lập với kháng thể độc tính độc lập với bổ thể [7] Bên cạnh phương pháp truyền thống, kháng thể đơn dòng ngày sử dụng phổ biến điều trị ung thư Liệu pháp sử dụng nhiều kháng thể tạo bên thể kháng thể hệ miễn dịch bệnh nhân sản xuất Các kháng thể đơn dòng tạo phòng thí nghiệm cách dung hợp tế bào ung thư chuột (Myeloma) với tế bào B chuột hình thành dạng tế bào lai Tất kháng thể đơn dòng ban đầu có nguồn gốc từ chuột, nhiên để đảm bảo an tồn có hiệu điều trị cao điều trị ung thư, kháng thể đơn dòng có nguồn gốc từ người Trong thập kỷ qua, nhiều kháng thể đơn dòng FDA chấp thuận để điều trị loạt bệnh ung thư [7] Độc tố miễn dịch loại thuốc bao gồm yếu tố sinh trưởng kháng thể đơn dòng bị biến đổi [1] Ban đầu, độc tố miễn dịch tạo cách gắn độc tố với protein thơng qua liên kết hóa học Tuy nhiên, với công nghệ DNA tái tổ hợp hình thành protein dung hợp có độc tố vùng bổ sung kháng thể yếu tố sinh trưởng Độc tố miễn dịch sau gắn với protein bề mặt tế bào xâm nhập vào bên tế bào, dẫn đến hoạt động chết theo chương trình tế bào đích, chẳng hạn độc tố bạch hầu (DT), protein kháng virus (PAP), ngoại độc tố A từ pseudomonas (PE), ricin saporin [1] Giải trình tự hệ phát 50% ung thư người mang đột biến ảnh hưởng đến trình tự DNA, cấu trúc nhiễm sắc thể Bên cạnh thay đổi liên quan đến trình tự gen, tế bào u có biến đổi di truyền ngoại gen nhằm trốn thoát hệ thống miễn dịch thể Do vậy, nghiên cứu phát triển loại thuốc với mục tiêu biến đổi di truyền di truyền ngoại gen ngày đặc biệt quan tâm, bao gồm thuốc liên quan đến đột biến gen, methyl hóa DNA biến đổi Histone, thử nghiệm chấp thuận FDA [62] Liệu pháp di 30 truyền ngoại gen (chất ức chế DNMT, HDAC) đảo ngược thay đổi acetyl hóa Histone methyl hóa DNA bệnh nhân ung thư Chất ức chế DNMT HDAC có tác dụng bổ trợ, tái kích hoạt lại gen ức chế khối u Vì vậy, chức bình thường tế bào phục hồi [71] 1.5.2 Điều trị đích ung thư phổi Những hiểu biết sinh học phân tử, nguyên nhân chế phát triển ung thư nói chung ung thư phổi nói riêng góp phần quan trọng việc xây dựng phác đồ điều trị có hiệu nhiều so với phương pháp điều trị truyền thống trước khả lui bệnh chất lượng sống bệnh nhân ung thư [55] EGFR đường truyền tín hiệu đóng vai trò quan trọng q trình sinh ung thư Hai nhóm liệu pháp đích EGFR phát triển, nhóm kháng thể đơn dòng chống lại vùng ngoại bào EGFR, với thiết kế nhằm ức chế phần gắn phối tử có vai trò trung gian giảm mức độ biểu [51] Lớp thứ hai bao gồm chất ức chế Tyrosine Kinase (TKIs), ngăn chặn truyền tín hiệu (Hình 1.18) [17] TKIs chất ức chế hoạt hóa phân tử EGFR phát triển dựa hiểu biết đột biến gen ung thư phổi [55, 139] TKIs gắn vào vị trí bám ATP phân tử EGFR làm cho phân tử hoạt hóa làm cho đường truyền tín hiệu qua EGFR không hoạt động Sự bất hoạt phân tử EGFR làm cho tế bào khả phân chia, giảm khả sống sót vào đường chết theo chương trình [68] Trong đột biến gen EGFR biết hầu hết đột biến có đáp ứng tốt với TKIs (trừ đột biến thay T790M, S768I, đột biến thêm đoạn exon 20) đột biến đoạn exon 19 thay L858R exon 21 gen EGFR nghiên cứu thử nghiệm nhiều Có nhiều cơng trình nghiên cứu công bố hiệu dụng TKIs bệnh nhân ung thư phổi [55, 68, 139] Những nghiên cứu cải thiện đáng kể tỷ lệ đáp ứng điều trị, thời gian tái phát u thời gian sống thêm bệnh nhân mang đột biến sử dụng TKIs so với bệnh nhân không sử dụng thuốc bệnh nhân không mang đột biến [55, 68] Hiện nay, FDA chấp thuận kháng thể đơn dòng EGFR bao gồm Cetuximab (Erbitux) Panitumumab (Vectibix); chất ức chế TKIs 31 Erlotinib (Tarceva), Gefitinib (Iressa) Lapatinib (Tykerb) Trong đó, Gefitinib Erlotinib cấp phép điều trị ung thư phổi [94] Gefitinib hệ thuốc đích sử dụng cho trường hợp ung thư phổi không tế bào nhỏ di có mang đột biến đoạn exon 19 đột biến thay L858R exon 21 gen EGFR, hai đột biến chiếm khoảng 90% đột biến EGFR kích hoạt biết [131] Tuy nhiên, khối u dương tính với đột biến EGFR kháng với chất ức chế EGFR, sàng lọc dấu ấn sinh học có khả dự đốn tính nhạy cảm với liệu pháp đích EGFR đặc biệt quan tâm Phản ứng với liệu pháp kháng EGFR bị biến đổi đột biến EGFR dạng soma, khuếch đại gen EGFR, tăng thể gắn EGFR tự do, đột biến protein đường truyền tín hiệu EGFR, bao gồm ERBB2, K-RAS, B-RAF, PI3KCA, PTEN BIM [9] Chẳng hạn, biểu mức protein EGFR chứng minh không tương quan đáp ứng với chất ức chế EGFR [16] Hình 1.18 Điều trị đích ung thư phổi [138] 32 Ngoài thử thách phát triển dấu ấn sinh học nhằm dự đoán phản ứng nhạy kháng thuốc điều trị liệu pháp kháng EGFR, thách thức thời gian đáp ứng thường bị hạn chế nhiều khối u phát triển kháng thuốc [9] Các đột biến EGFR thứ cấp xảy sau điều trị TKIs, ví dụ đột biến T790M dạng kháng thuốc phổ biến TKIs [158] TKIs hệ thứ ba phát triển để nhắm tới T790M, bao gồm Brigatinib, HM61713, Osimertinib Rociletinib Ngoài đột biến T790M, đột biến thứ cấp đường truyền tín hiệu EGFR đột biến KRAS, PI3K ảnh hưởng đến hiệu liệu pháp đích EGFR Ức chế EGFR chủ yếu giữ chu kỳ tế bào G1, ngăn cản q trình tổng hợp DNA, tăng sinh tế bào Thơng thường, TKIs sử dụng riêng lẻ kết hợp với hóa trị xạ trị liều cao [131] 1.6 Phƣơng pháp phân tích biến đổi phân tử ung thƣ phổi 1.6.1 Phương pháp phân tích đột biến gen ung thư phổi Sinh học phân tử cung cấp thơng tin chi tiết đặc tính di truyền người, phát triển ngày hoàn thiện phân tích dựa DNA/RNA nhằm kiểm sốt bệnh lý người Trong ung thư, phát đột biến gen gặp vài hạn chế Thứ nhất, tế bào bình thường (tế bào lành) không mang biến đổi gen; phương pháp lấy mẫu bệnh phẩm cần đảm bảo độ xác để tồn bệnh phẩm tế bào ác tính, khơng lẫn tế bào lành Thứ hai, tất tế bào ác tính mang đột biến gen Với hạn chế này, phương pháp phát đột biến gen phải có độ nhạy cao để phát đột biến xuất mức thấp mẫu bệnh phẩm Nhiều cách thức tiếp cận khác sử dụng xác định đột biến gen biết, phương pháp có ưu điểm nhược điểm khác biệt, thông thường bắt đầu với phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) (Hình1.19) [86] Vào năm 1980, Mullis giới thiệu phương pháp khuếch đại đoạn DNA thành số lượng lớn vài giờ; gọi phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR), thành tựu tiêu biểu sinh học phân tử [98] Một vài dạng PCR ứng dụng phổ biến PCR phiên mã ngược (Reverse transcriptase PCR), Multiplex PCR, Nested PCR, Scorpion-arm RT-PCR (ARMS-PCR), Real time PCR [94] Giải trình tự gen trực tiếp (Sanger sequencing) kỹ thuật mang tính kinh tế, dễ triển khai độ nhạy thấp (có thể phát đột biến lượng tế bào mang đột biến phải lớn 20% tổng số tế bào) Để đảm bảo lượng tế bào ác tính, kỹ thuật yêu cầu trợ giúp từ nhà giải phẫu bệnh với mục đích 33 khoanh vùng khu vực bệnh phẩm có tế bào ác tính trước tiến hành tách DNA để phát đột biến [37] Realtime PCR kỹ thuật PCR mà kết khuếch đại DNA đích hiển thị sau chu kỳ nhiệt phản ứng Realtime PCR có độ nhạy cao, phát đột biến tế bào ác tính mang đột biến mức 1% tổng số tế bào Trong phương pháp Realtime PCR, SYBR green sử dụng với ưu điểm đơn giản, dễ thao tác, liên kết với mạch kép DNA [5] Tuy nhiên, SYBR green có nhược điểm quan trọng tín hiệu huỳnh quang phát khơng cao ức chế phản ứng PCR Do đó, Realtime sử dụng SYBR green làm chất phát huỳnh quang ứng dụng Multiplex realtime PCR, realtime PCR phát SNP (Single Nucleotide Polymorphism) Để khắc phục nhược điểm này, hệ màu HRM (High Resolution Melting dye) phát triển thay Ưu điểm vượt trội hệ màu HRM khả phân biệt khác biệt với nucleotide hệ màu HRM không ức chế PCR cường độ phát huỳnh quang phân tử màu HRM chèn vào mạch đơi DNA tăng 250 lần so với tự dung dịch Với realtime PCR sử dụng probe làm chất phát huỳnh quang, tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu xác định SNP hay định genotype sử dụng Taqman probe probe lai (FRET) (Hình 1.19) [63] Kỹ thuật lai DNA chỗ (In stitu Hybridiration) cho phép xác định vị trí trình tự DNA đặc biệt nhiễm sắc thể Thí nghiệm lai chỗ lần điều tiên tiến hành vào năm 1969 với đầu dò DNA gắn phóng xạ, sau đầu dò huỳnh quang đời nhanh chóng thay đoạn DNA phóng xạ Cho đến kỹ thuật lại chỗ huỳnh quang cải thiện nhiều độ nhạy độ đặc hiệu Ngoài lai chỗ huỳnh quang, lai chỗ sử dụng enzyme đời nhằm cải thiện nhược điểm đầu huỳnh quang với thời gian tồn tín nhiệu ngắn sử dụng kính hiển vi quang học thay kính hiển vi huỳnh quang (Hình 1.19) [36] Vi dãy DNA sử dụng để phát nhiều đột biến Trong cơng nghệ này, đích DNA khác dạng mạch đơn cố định lên bề mặt rắn (chip) Mặt khác, DNA mẫu cDNA gắn huỳnh quang lai với chip Sau sử dụng hệ thống laser, tín hiệu huỳnh quang 34 kiểm tra; trình tự số lượng trình tự quan tâm mẫu nghiên cứu xác định [36] Hình 1.19 Một số kỹ thuật phát đột biến gen [36] Bên cạnh đột biến nghiên cứu, với đột biến mới, phương pháp đa hình cấu hình sợi đơn (SSCP) cho phép sàng lọc đơn giản hiệu đột biến thay nucleotide, đoạn ngắn, thêm đoạn đảo đoạn có kích thước nhỏ Ngun tắc kỹ thuật mạch DNA mạch mang đột biến mạch lại bình thường có độ di động khác trình điện di [64] Khoảng 80 – 90% đột biến điểm tiềm phát kỹ thuật SSCP Trong năm gần đây, cơng nghệ cho giải trình tự DNA với quy mô lớn gọi giải trình tự hệ tiếp (NGS) Ưu điểm trội kỹ thuật cho phép định tính định lượng toàn hệ gen thời gian vài ngày [121] 1.6.2 Phương pháp phân tích methyl hóa DNA ung thư phổi Hiện nay, ba phương pháp sử dụng để phân tích methyl hóa DNA tồn hệ gen gen đặc hiệu Thứ phương pháp kết tủa miễn dịch sử dụng kháng thể đặc hiệu nhận biết trình tự methyl hóa Thứ hai sử dụng enzyme giới hạn nhạy cảm với trình tự methyl hóa/khơng methyl hóa, dẫn đến cắt khơng cắt trình tự Cuối kỹ thuật dựa DNA xử lý bisulfite, Cytosine khơng bị methyl sau q trình xử lý biến đổi thành 35 Uracil Cytosine bị methyl giữ nguyên sau trình (Hình 1.20) [129] Với đặc điểm phòng thí nghiệm nước phát triển Việt Nam, phát triển kỹ thuật phân tích định tính định lượng methyl hóa gen đặc hiệu loại ung thư đặc biệt quan tâm Hình 1.20 Lịch sử phát kỹ thuật phân tích methyl hóa DNA [52] PCR đặc hiệu methyl (Methyl specific PCR, MS-PCR) kỹ thuật đơn giản, độ nhạy cao, cho phép phát alen methyl hóa 1000 alen khơng methyl hóa với ngun tắc DNA xử lý bisulfite dùng làm khuôn cho phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu thiết kế vùng giàu CpG, cho phép khuếch đại trình tự DNA methyl hóa DNA khơng methyl hóa [129, 156] Như vậy, MS-PCR cho phép đánh giá trình tự quan tâm đồng hợp methyl hóa hay khơng methyl hóa (chỉ thu sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu cho DNA meythyl hay khơng methyl hóa), dị hợp methyl hóa (thu đồng thời sản phẩm khuếch đại với cặp mồi methyl hóa khơng methyl hóa) Tuy nhiên, nhược điểm phương pháp khơng đánh giá mức độ methyl hóa vùng trình tự nằm vị trí thiết kế mồi đặc hiệu [156] Để khắc phục điểm yếu này, kỹ thuật định lượng methyl hóa DNA dựa biến đổi bisulfite phát triển hoàn thiện Giải trình tự bisulfite (Bisulfite sequencing) tiêu chuẩn vàng cho phép đánh giá methyl hóa vị trí CpG sản phẩm khuếch đại từ khuôn DNA xử lý bisulfite, không phù hợp tiến hành phân tích số lượng mẫu nghiên cứu lớn [38] 36 Bên cạnh đó, phương pháp COBRA (Combined bisulfite restriction analysis) định lượng Cytosine bị methyl hóa/khơng methyl hóa trình tự nhận biết enzyme giới hạn DNA sau xử lý bisulfite dẫn đến thay đổi nucleotide (C thành U) làm xuất vị trí nhận biết enzyme giới hạn [152] Phương pháp định lượng qMS – PCR đánh giá methyl hóa sản phẩm PCR dựa nguyên lý khác Đầu tiên, định lượng qua SYBR green cho phép phát tín hiệu huỳnh quang sau chu kỳ khuếch đại SYBR green liên kết với mạch kép DNA [141] Với mục đích giảm kết dương tính giả, ngun lý sử dụng đầu dò Taqman mồi đặc hiệu cho DNA methyl hóa DNA khơng methyl hóa phát triển ngày hồn thiện [10] Vì vậy, qMS – PCR thường ứng dụng thường quy để phân tích methyl hóa DNA nhiều bệnh nhân đánh giá đồng thời nhiều trình tự gen quan tâm 1.7 Nghiên cứu dấu ấn phân tử ung thƣ phổi Việt Nam Hiện nay, ung thư phổi loại ung thư phổ biến có tỷ lệ tử vong cao Việt Nam, 80 - 90% dạng không tế bào nhỏ (UTPKTBN) [60] Thụ thể yếu tố phát triển biểu mơ EGFR trở thành đích nhắm cho liệu pháp điều trị đích nhóm bệnh nhân UTPKTBN có đột biến gen EGFR đáp ứng tốt với thuốc ức chế Tyrosine Kinase (TKIs) EGFR Erlotinib hay Gefitinib [107] Nhằm định hướng công tác điều trị đích Erlotinib Gefitinib, nghiên cứu mơ tả tỷ lệ đột biến gen EGFR bệnh nhân UTPKTBN Việt Nam ngày phổ biến Cụ thể, Vu H A cs (2016) phân tích 332 mẫu bệnh phẩm UTPKTBN kỹ thuật giải trình tự tự động nhận thấy 40,7% mẫu có đột biến gen EGFR [145] Bên cạnh đó, nghiên cứu đột biến gen EGFR 120 mẫu UTPKTBN giai đoạn muộn, Nguyễn Minh Hà cs (2013) sử dụng kỹ thuật realtime PCR Scorpion ARMS phát 25/70 (35,7%) mẫu phân tích có tượng [47] Sử dụng kỹ thuật lai DNA, Mai Trọng Khoa cs (2016) nhận thấy 204/511 (40,1%) mẫu UTPKTBN có đột biến gen EGFR [67] Ngồi ra, có số luận án tiến sỹ nghiên cứu đặc điểm đột biến đáp ứng với TKIs bệnh nhân ung thư phổi Việt Nam luận án Nguyễn Minh Hà (2014) Lê Thu Hà (2017) [46, 48] Bên cạnh đột biến gây ung thư, nguyên nhân ngoại cảnh dẫn đến hình thành phát triển ung thư gồm có nhiễm mơi trường sống (khói 37 thuốc lá, chất thải, hóa chất nguồn phóng xạ cơng nghiệp ), nguồn thực phẩm khơng an tồn (bị nhiễm chất gây ung thư), tác nhân gây bệnh truyền nhiễm Những nghiên cứu cuối thập kỷ 20 cho thấy tác nhân ngoại cảnh nêu có khả gây biến đổi di truyền ngoại gen [32] Nói cách khác hầu hết loại ung thư, có ung thư biểu mơ tuyến phổi nhiều gây rối loạn kiểm soát di truyền ngoại gen Tuy nhiên, báo cáo phân tích methyl hóa DNA ung thư phổi phân tích đồng thời đột biến gen EGFR tượng methyl hóa DNA chưa triển khai rộng rãi Việt Nam Methyl hóa gen liên quan ung thư nghiên cứu rải rác số dạng ung thư methyl hóa gen BRCA1, ER, RASSF1A, APC ung thư vú ung thư buồng trứng; gen GSTP1, RASSF1A ung thư tuyến tiền liệt [27, 142, 143] Chỉ có nghiên cứu tượng methyl hóa MiR34 bệnh nhân ung thư phổi Vo T.T.L cs (2018) [144] Methyl hóa khuếch đại gen EGFR có liên quan mật thiết đến biểu biểu mức gen EGFR Methyl hóa làm giảm biểu protein khuếch đại gen lại tăng cường mức độ biểu [95] Tại Việt Nam, việc nghiên cứu biểu số dấu ấn miễn dịch hóa mơ miễn dịch ung thư phổi nói chung UTPKTBN nói riêng chưa nghiên cứu rộng rãi Các dấu ấn sử dụng chủ yếu tập trung vào p63, TTF–1, CK5/6, CK7 Napsin A [19] Đặc biệt, nghiên cứu đánh giá mối tương quan biến đổi phân tử EGFR bao gồm đột biến gen, methyl hóa DNA biểu mức protein tương ứng với thay đổi methyl hóa gen ức chế khối u phổ biến MGMT, MLH1, BRCA1, RASSF1A…trong ung thư phổi hoàn toàn chưa triển khai, lĩnh vực nghiên cứu Việt Nam Bởi vậy, tiến hành đề tài “Nghiên cứu đột biến, mức độ biểu gen EGFR tình trạng methyl hóa số gen liên quan bệnh nhân ung thƣ biểu mô tuyến phổi” 38 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu 2.1.1 Mẫu nghiên cứu Một trăm ba mươi chín (139) mẫu bệnh phẩm đúc paraffin từ bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến phổi Trung tâm Giải phẫu bệnh Sinh học phân tử, Bệnh viện K cung cấp thời gian từ năm 2015 đến 2018 Mẫu lựa chọn dựa tiêu chuẩn: Bệnh phẩm ung thư biểu mô tuyến có nguồn gốc từ phổi chẩn đốn mô bệnh học dựa phương pháp nhuộm H&E (Hematoxiline Eosine) chẩn đoán loại trừ khối u di từ quan khác đến nhuộm hóa mô miễn dịch Năm mẫu mô phổi lành thu thập từ vùng mô cách khối u – cm Đặc điểm mô bênh học mẫu bệnh phẩm xác định phân loại chuyên gia giải phẫu bệnh Trung tâm Giải phẫu bệnh Sinh học phân tử, Bệnh viện K Thông tin lâm sàng bệnh nhân tiến hành thu thập khoa lâm sàng, Bệnh viện K Thông tin lâm sàng chẩn đoán giải phẫu bệnh bệnh nhân tham gia nghiên cứu trình bày Phụ lục Mẫu máu người khỏe mạnh cung cấp Khoa huyết học – vi sinh, Bệnh viện K DNA từ mẫu máu người khỏe mạnh sử dụng làm đối chứng dương cho trình tự EGFR, BRCA1, MGMT, MLH1 RASSF1A khơng bị methyl hóa trình tự EGFR, BRCA1, MGMT, MLH1 RASSF1A methyl hóa sau xử lý với enzyme M.sssI 2.1.2 Hóa chất Hóa chất kit sử dụng nghiên cứu trình bày bảng 2.1 Trình tự cặp mồi cho phản ứng PCR trình bày bảng 2.2 Các hóa chất kit đạt tiêu chuẩn dùng cho nghiên cứu sinh học phân tử 39 Bảng 2.1 Kit hóa chất sử dụng nghiên cứu Tên kit, hóa chất STT Hãng sản xuất Kit tách chiết DNA tổng số từ mẫu mô mẫu máu - QIAmp DNA FFPE Tissue kit - Reliaprep Miniprep TM Blood Qiagen gDNA Promega Qiagen 874111 Qiagen 1570022598 Kit giải trình tự DNA máy ABI 3130 - Bigdye Termiator v3.1 Sequencing Applied Bio-System kit Universal DAB Roche Y26202 Hỗn hợp PCR master mix - HotstarTaq DNA Polymerase 1603386 Kit nhuộm hóa mơ miễn dịch - Ultra View Detection Kit A5081 Kit xử lý bisulfite - Epitect Bisulfite kit 157015287 Kit phát đột biến gen EGFR công nghệ Scorpion-arm RTPCR - Therascreen EGFR RGQ PCR kit Cat No Qiagen 203203 Các hóa chất - Xylen Merk - Cồn tuyệt đối Sigma SHBG7326V - Agarose Roche 11315400 - Bisacrylamide Sigma M 1533 - Kháng thể kháng EGFR Roche (CONFIRM anti-EGFR -5B7) Y21127 - Tris Acetate – EDTA Buffer Sigma SLBM5034V - Tris- Borate – EDTA Buffer Sigma SLBN7008V - Nuclease Free Water Apex 150713 - DNA 100Bp Ladder … - Ethidium Bromide - Gelred -TEMED 40 Bảng 2.2 Trình tự cặp mồi sử dụng nghiên cứu Gen Tên mồi β-globin Globin F caa ctt cat cca cgt tca cc 268 Globin R gaa gag cca agg aca ggt ac [99] U01317.1 Trình tự nucleotide (5’-3’) Kích thƣớc (bp) EGFR EGFR UnF ggt tgg gtt tgt aag ttt gt 150 NC_000007.14 EGFR UnR ata aac aac aat aac ccc ca [79] EGFR Me F1 ttt atg cgt cgt ttt att ttc gtc 495 EGFR MeR1 cgg tcg ttt cgg agg gtc gta tcg (Tự thiết kế) EGFR MeF2 tgt ttt tcg cgt ttc ggt tcg cgc Vòng 2: 158 EGFR MeR2 cgt cta aac gac gac gcc gcc g [120] MGMT meF1 gta tgg gtt cga ttc ggt cgg gc MGMT meF2 ttt cga cgt tcg tag gtt ttc gc MGMT meR gca ctc ttc cga aaa cga aac g MGMT unF1 gta tgt gtt gat ttg gtt ggg tg MGMT unF2 ttt gtg ttt tga tgt ttg tag gt Vòng 2: 93 MGMT unR ggg tgg ttt tat att tga tgg tg (Tự thiết kế) MLH1 meF1 gcg tta agt att ttt ttc gtt ttg c MLH1 meF2 cga att aat agg aag agc gga ta Vòng 2: 301 MLH1 meR tac cac gaa cga cat ttt aac g (Tự thiết kế) MLH1 unF1 gtg tta agt att ttt ttg ttt tgt MLH1 unF2 tga att aat agg aag agt gga tag t Vòng 2: 303 MLH1 unR cct acc aca aac aac att tta aca (Tự thiết kế) MGMT NC_000010.11 MLH1 NC_000003.12 41 Vòng 1: 249 (Tự thiết kế) Vòng 2: 81 [83] Vòng 1: 249 (Tự thiết kế) Vòng 1: 417 (Tự thiết kế) Vòng 1: 417 (Tự thiết kế) Bảng 2.2 Trình tự cặp mồi sử dụng nghiên cứu (tiếp) Gen BRCA1 NC_000017.11 RASSF1A NC_000003.12 Tên mồi Trình tự nucleotide (5’-3’) Kin lung cancer - molecular and clinical predictors of outcome, N Engl J Med, 2005, 353, 133-144 140 M Uhlen, P Oksvold, L Fagerberg, E Lundberg, K Jonasson, et al (2010) Towards a knowledge-based Human Protein Atlas Nature Biotechnology pp 1248-1250 141 V.H van der Velden, A Hochhaus, G Cazzaniga, T Szczepanski, J Gabert, et al., Detection of minimal residual disease in hematologic malignancies by real-time quantitative PCR: principles, approaches, and laboratory aspects, Leukemia, 2003, 17, 1013-1034 142 L.T Vo, T.B Thuan, D.M Thu, N.Q Uyen, N.T Ha, et al., Methylation profile of BRCA1, RASSF1A and ER in Vietnamese women with ovarian cancer, Asian Pac J Cancer Prev, 2013, 14, 7713-7718 143 T.T Vo, B.T Ta, V.T Ta, D.L Vuong, Q.U Nguyen, Promoter methylation profile of GSTP1 and RASSF1A in prostate cancerand benign hyperplasia in Vietnamese men, Turk J Med Sci, 2016, 46, 228-235 144 T.T.L Vo, S Ho, T Vu, T Nguyen, P Nguyen, et al., Methylation profiles of MIR34 gene family in Vietnamese patients suffering from breast and lung cancers, Molecular Medicine Reports, 2018, 18 145 H.A Vu, P.T Xinh, H.T Ha, N.T Hanh, N.D Bach, et al., Spectrum of EGFR gene mutations in Vietnamese patients with non-small cell lung cancer, Asia Pac J Clin Oncol, 2016, 12, 86-90 146 J Wang, B Wang, X Chen, J Bi, The prognostic value of RASSF1A promoter hypermethylation in non-small cell lung carcinoma: a systematic review and meta-analysis, Carcinogenesis, 2011, 32, 411-416 106 147 Y Wang, D Zhang, W Zheng, J Luo, Y Bai, et al., Multiple gene methylation of nonsmall cell lung cancers evaluated with 3‐dimensional microarray, Cancer, 2008, 112, 1325-1336 148 Y.C Wang, Y.P Lu, R.C Tseng, R.K Lin, J.W Chang, et al., Inactivation of hMLH1 and hMSH2 by promoter methylation in primary non-small cell lung tumors and matched sputum samples, J Clin Invest, 2003, 111, 887-895 149 I.B Weinstein, A.K Joe, Mechanisms of disease: Oncogene addiction a rationale for molecular targeting in cancer therapy, Nat Clin Pract Oncol, 2006, 3, 448-457 150 X Weng, H Zhang, J Ye, M Kan, F Liu, et al., Hypermethylated Epidermal growth factor receptor (EGFR) promoter is associated with gastric cancer, Sci Rep, 2015, 151 J.Y Wu, J Wang, J.C Lai, Y.W Cheng, K.T Yeh, et al., Association of O6methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) promoter methylation with p53 mutation occurrence in non-small cell lung cancer with different histology, gender, and smoking status, Ann Surg Oncol 2008, 15, 3272-3277 152 Z Xiong, P.W Laird, COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay, Nucleic Acids Res, 1997, 25, 2532-2534 153 N Yanagawa, G Tamura, H Oizumi, M Endoh, M Sadahiro, et al., Inverse correlation between EGFR mutation and FHIT, RASSF1A and RUNX3 methylation in lung adenocarcinoma: relation with smoking status, Anticancer Res, 2011, 31, 1211-1214 154 T Yokoyama, K Takehara, N Sugimoto, K Kaneko, E Fujimoto, et al., Lynch syndrome-associated endometrial carcinoma with MLH1 germline mutation and MLH1 promoter hypermethylation: a case report and literature review, BMC Cancer, 2018, 18, 018-4489 155 L Zhang, X Long, Association of BRCA1 promoter methylation with sporadic breast cancers: Evidence from 40 studies, Scientific reports, 2015, 5, 1786917869 156 Y Zhang, V Bailey, C.M Puleo, H Easwaran, E Griffiths, et al., DNA methylation analysis on a droplet-in-oil PCR array, Lab Chip, 2009, 9, 1059-1064 157 Y Zhang, R Wang, H Song, G Huang, J Yi, et al., Methylation of multiple genes as a candidate biomarker in non-small cell lung cancer, Cancer Lett, 2011, 303, 21-28 158 Z Zhang, A.L Stiegler, T.J Boggon, S Kobayashi, B Halmos, EGFRmutated lung cancer: A paradigm of molecular oncology, Oncotarget, 2010, 1, 497–514 107 PHỤ LỤC 1: Bảng 1.1 Danh sách bệnh nhân ung nghiên cứu STT Số GPB Ký hiệu Họ tên Giới tính Tuổi Kết chẩn đốn 22724 S1 Nguyễn Thị B Nữ 43 K Phế quản 30706 S2 Vũ Văn K Nam 64 Hạch di AC 38917 S3 Nguyễn Xuân Đ Nam 57 K Phế quản 34221 S4 Đinh Thị D Nữ 37 K Phế quản 52455 S5 Nguyễn Văn B Nam 55 K Phổi 38814 S6 Lê Văn T Nam 59 Hạch di AC 36505 S7 Phạm Văn C Nam 53 Hạch di AC 38663 S8 Nguyễn Thị T Nữ 71 K Phế quản 62635 S9 Đỗ Văn B Nam 68 K Phế quản 10 24617 S10 Nguyễn Xuân B Nam 61 K Phế quản 11 3634 S11 Lâm Thiên T Nữ 56 Hạch di AC 12 17030 S12 Phạm Thị D Nữ 59 Hạch di AC 13 30270 S13 Cao Thị H Nữ 53 Hạch di AC 14 7821 S14 Hà Thị H Nữ 60 K Phổi 15 445 S15 Phùng Ngọc C Nam 61 K Phổi 16 36391 S16 Phùng Quyết T Nam 66 Hạch di AC 17 33066 S17 Nguyễn Văn T Nam 67 Hạch di AC 18 36868 S18 Vũ Thị T Nữ 61 Hạch di AC 19 31542 S19 Trịnh Thị C Nam 64 Hạch di AC 20 29023 S20 Nguyễn Thị Xuân T NAm 46 K Phế quản 21 27189 S21 Nguyễn Kim H Nữ 60 Hạch di AC 22 38698 S22 Mai Thế T Nam 50 K Phế quản 23 37451 S23 Nguyễn Văn T Nam 40 K Phế quản 24 64484 S24 Nguyễn Thị Đ Nữ 56 K Phổi 25 61609 S25 Đỗ Tất M Nam 67 K Phổi 26 43883 S26 Nguyễn Duy D Nam 33 K Phổi 27 58838 S27 Lê Thăng L Nam 65 K Phổi 28 34385 S28 Ngô Thị N Nữ 47 K Phế quản 29 17026 S29 Nguyễn Công L Nữ 38 K Phổi 30 30550 S30 Đặng Văn S Nữ 55 K Phổi 31 72498 S31 Trịnh Văn B Nam 53 K Phế quản 32 32540 S32 Phạm G nam 59 K Phổi 33 39886 S33 Nguyễn Đình S Nam 60 K Phế quản 34 64146 S34 Nguyễn Hữu T Nam 80 K Phế quản 35 40828 S35 Phạm Văn P Nam 44 K Phổi 36 39305 S36 Tống Quốc Đ Nam 62 K Phổi 37 32926 S37 Nguyễn Ngọc D Nam 53 K Phổi 38 41294 S38 Bùi Cao T Nam 69 Hạch di AC 39 64249 S39 Đỗ Đức B Nam 65 Hạch di AC 40 R1097 S40 Lê Thanh H Nam 51 K Phổi 41 63959 S41 Hà Huy Đ Nam 78 K Phổi 42 61036 S42 Trần Tiến Đ Nam 27 K Phế quản 43 41240 S43 Nguyễn Thị Hồng T nữ 49 K Phổi 44 29311 S44 Nguyễn Văn C Nam 59 K Phế quản 45 5999 S45 Trần Thị T Nữ 54 Hạch di AC 46 33351 S46 Trần Văn T nam 52 K Phổi 47 3163 S47 Hoàng Văn T Nam 53 K Phế quản 48 63005 S48 Đàm Ngọc S Nam 41 Hạch di AC 49 32040 S49 Trần Văn Đ nam 50 K Phổi 50 41730 S50 Nguyễn Thị G Nữ 77 K Phổi 51 1525 S51 Lê Anh Đ Nam 64 K Phổi 52 57820 S52 Nguyễn Thị T Nữ 53 K Phổi 53 47854 S53 Trần Mỹ S Nam 54 K Phế quản 54 33244 S54 Vũ Văn C Nam 66 K Phế quản 55 DA394 S55 Đỗ Tất T Nam 57 K Phế quản 56 42712 S56 Lê Thị Y Nữ 58 Hạch di AC 57 39816 S57 Lê Hồng N Nam 72 K Phế quản 58 40539 S58 Nguyễn Văn T Nam 69 Hạch di AC 59 32335 S59 Trần Quy D Nam 56 K Phế quản 60 62660 S60 Nguyễn Tuấn K Nam 55 Hạch di AC 61 33892 S61 Đồng Như H Nam 56 K Phế quản 62 5821 S62 Đào Thị T Nữ 49 K Phổi 63 42536 S63 Nguyễn Thị Đ Nữ 54 Hạch di AC 64 5290 S64 Đồng Xuân C Nam 69 K Phổi 65 22624 S65 Phạm Thị T Nữ 56 K Phổi 66 44004 S66 Nguyễn Văn B Nam 75 K Phế quản 67 42705 S67 Hoàng Thị L Nữ 65 K Phế quản 68 32862 S68 Nguyễn Đức L Nam 58 K Phế quản 69 42850 S69 Trần Văn N Nam 62 K Phổi 70 90391 S70 Nguyễn Thị O Nữ 70 K Phổi 71 57965 S71 Nguyễn Văn Q Nam 57 K Phế quản 72 66349 S72 Vũ Thế M Nam 71 K Phổi 73 44507 S73 Tô Văn Đ Nam 53 K Phế quản 74 14090 S74 Lê Kim T Nam 53 K Phế quản 75 M828 S75 Lê Quang N Nam 69 K Phế quản 76 33960 S76 Trần Mạnh H Nam 53 Hạch di AC 77 10808 S77 Phạm Quang T Nam 56 K Phế quản 78 42516 S78 Đậu Thị Huyền T Nữ 25 Hạch di AC 79 38272 S79 Hoàng Văn M Nam 66 K Phổi 80 44006 S80 Kiều Văn Đ Nam 66 K Phế quản 81 45150 S81 Trần Vũ H Nam 70 K Phế quản 82 44748 S82 Trịnh Phú Đ Nam 53 K Phế quản 83 39062 S83 Nguyễn Huy L Nam 61 K Phế quản 84 93133 S84 Hoàng Văn K Nam 42 K Phổi 85 44874 S85 Nguyễn Thị T Nữ 59 K Phế quản 86 49313 S86 Nguyễn Thị L Nữ 40 K Phế quản 87 45407 S87 Phạm Thị Thu G Nữ 31 Hạch di AC 88 10087 S88 Tơ Đình M Nam 67 K Phổi 89 89195 S89 Trần Thị V Nữ 50 K Phế quản 90 45282 S90 Đỗ Văn C Nam 64 Hạch di AC 91 43942 S91 Lê Thị C Nữ 48 K Phổi 92 52957 S92 Lê Trung T Nam 60 K Phổi 93 10793 S93 Trần Văn H Nam 62 K Phổi 94 12395 S94 Đỗ Văn T Nam 25 K Phổi 95 12905 S95 Phan Duy T Nam 30 K Phế quản 96 41967 S96 Nguyễn Văn T Nam 70 K Phổi 97 52178 S97 Nguyễn Thanh T Nam 66 K Phế quản 98 44771 S98 Phan Thị Đ Nữ 65 Hạch di AC 99 44144 S99 Nguyễn Đình T Nam 47 K Phế quản 100 46210 S100 Nguyễn Hữu K Nam 70 K Phế quản 101 46628 S101 Nguyễn Thị G Nữ 57 Hạch di AC 102 45998 S102 Đào Hoa D Nam 68 Hạch di AC 103 47046 S103 Vũ Thị N Nữ 69 Hạch di AC 104 38325 S104 Lê Đức Đ Nam 49 Hạch di AC 105 43861 S105 Nguyễn Văn H nam 51 K Phế quản 106 94807 S106 Bùi Thị Minh H Nữ 47 K Phế quản 107 46146 S107 Đặng Như H Nam 63 K Phế quản 108 57240 S108 Hà Thị H Nữ 58 K Phế quản 109 68116 S109 Ngô Thị M Nữ 69 K Phổi 110 32619 S110 Quách Thị Q Nữ 61 K Phổi 111 94607 S111 Nguyễn Văn V Nam 62 Hạch di AC 112 47562 S112 Trần Văn H nam 63 Hạch di AC 113 45312 S113 Đỗ Văn Đ Nam 59 K Phổi 114 62319 S114 Triệu Thị H Nữ 40 Hạch di AC 115 95421 S115 Hoàng Văn Y Nam 33 K Phế quản 116 59222 S116 Nguyễn Đình M Nam 68 Hạch di AC 117 45392 S117 Trần Trọng P Nam 69 K Phế quản 118 52412 S118 Nguyễn Văn H nam 64 K Phổi 119 67142 S119 Nguyễn Quốc S nam 66 K Phế quản 120 37039 S120 Nguyễn Ngọc M Nam 69 K Phế quản 121 99551 S121 Nguyễn Văn Đ Nam 54 K Phế quản 122 56484 S122 Hồ Mạnh T nam 63 K Phổi 123 99696 S123 Nguyễn Thị C Nữ 41 Hạch di AC 124 56128 S124 Phạm Thị Phương H Nữ 51 Hạch di AC 125 56309 S125 Vũ Đức Q Nam 72 K Phổi 126 55923 S126 Đặng Thị H Nữ 65 K Phế quản 127 59068 S127 Lê Quang T Nam 57 K Phế quản 128 30471 S128 Đặng Thu H Nữ 57 K Phế quản 129 43248 S129 Nguyễn Thị L Nữ 54 K Phế quản 130 43860 S130 Vũ Đình T Nam 51 K Phế quản 131 59993 S131 Nguyễn Thị V Nữ 70 K Phế quản 132 41418 S132 Đào Đình Đ nam 69 K Phổi 133 45528 S133 Hồng Đình B Nam 56 K Phế quản 134 59050 S134 Phạm Văn N nam 61 K Phế quản 135 43573 S135 Phạm Văn H Nam 52 K Phế quản 136 62996 S136 Nguyễn Văn P Nam 62 K Phổi 137 39885 S137 Trần Tiến D nam 60 K Phổi 138 22053 S138 Nguyễn Thị L Nữ 57 K Phế quản 139 49473 S139 Nguyễn Thị T Nữ 50 Hạch di AC 140 38917-2 S140 Nguyễn Xuân Đ Nam 57 Mẫu liền kề 141 34221-2 S141 Đinh Thị D Nữ 37 Mẫu liền kề 142 38698-2 S142 Mai Thế T Nam 50 Mẫu liền kề 143 32540-2 S143 Phạm G Nam 59 Mẫu liền kề 144 39816-2 S144 Lê Hồng N Nam 72 Mẫu liền kề 145 Máu S145 Nguyễn Thị T Nữ 25 Khám SK tổng quát Hà Nội, ngày 09 tháng năm 2020 Xác nhận TT GPB - SHPT Bệnh viện K Bảng 1.2 Đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu STT Số GPB Ký hiệu Phân type mơ bệnh học Tình trạng khối u Giai Đoạn Tình trạng hút thuốc 22724 S1 Acinar Nguyên phát Khơng 30706 S2 Acinar Di Có 38917 S3 Papilary Nguyên phát 2B Có 34221 S4 Papilary Nguyên phát 2B Không 52455 S5 Acinar Nguyên phát 3A Không 38814 S6 Papilary Di Có 36505 S7 Acinar Di Có 38663 S8 Acinar Nguyên phát 3B Không 62635 S9 Acinar Nguyên phát Có 10 24617 S10 Acinar Nguyên phát 3B Có 11 3634 S11 Acinar Di Có 12 17030 S12 Acinar Di Khơng 13 30270 S13 Solid Di Không 14 7821 S14 Acinar Nguyên phát 3A Không 15 445 S15 Papilary Nguyên phát 3B Có 16 36391 S16 Acinar Di Có 17 33066 S17 Acinar Di Có 18 36868 S18 Acinar Di Không 19 31542 S19 Acinar Di Có 20 29023 S20 Papilary Nguyên phát 2B Không 21 27189 S21 Papilary Di Không 22 38698 S22 Acinar Nguyên phát 3A Không 23 37451 S23 Papilary Nguyên phát 3A Có 24 64484 S24 Papilary Nguyên phát Không 25 61609 S25 Solid Nguyên phát Có 26 43883 S26 Acinar Nguyên phát 3A Có 27 58838 S27 Acinar Nguyên phát 2B Có 28 34385 S28 Papilary Nguyên phát Không 29 17026 S29 Papilary Nguyên phát 3B Không 30 30550 S30 Acinar Nguyên phát 3A Không 31 72498 S31 Acinar Nguyên phát Có 32 32540 S32 Acinar Ngun phát Khơng 33 39886 S33 Acinar Nguyên phát Không 34 64146 S34 Papilary Nguyên phát 3A Không 35 40828 S35 Acinar Nguyên phát 3B Có 36 39305 S36 Acinar Nguyên phát 3B Có 37 32926 S37 Acinar Nguyên phát 2B Có 38 41294 S38 Solid Di Không 39 64249 S39 Solid Di Có 40 R1097 S40 Acinar Nguyên phát Có 41 63959 S41 Acinar Nguyên phát 3A Có 42 61036 S42 Acinar Nguyên phát 3A Có 43 41240 S43 Acinar Nguyên phát Không 44 29311 S44 Solid Nguyên phát 3B Không 45 5999 S45 Acinar Di Không 46 33351 S46 Acinar Nguyên phát Có 47 3163 S47 Papilary Ngun phát Khơng 48 63005 S48 Micro-Papillary Di Có 49 32040 S49 Acinar Nguyên phát Có 50 41730 S50 Acinar Nguyên phát 3B Không 51 1525 S51 Acinar Nguyên phát 2B Không 52 57820 S52 Micro-Papillary Nguyên phát 3A Không 53 47854 S53 Acinar Nguyên phát Có 54 33244 S54 Acinar Nguyên phát 3B Có 55 DA394 S55 Acinar Nguyên phát 2B Có 56 42712 S56 Acinar & Papillary Di Không 57 39816 S57 Acinar Nguyên phát 3B Có 58 40539 S58 Acinar Di Có 59 32335 S59 Acinar Nguyên phát 3A Có 60 62660 S60 Acinar Di Có 61 33892 S61 Papilary Nguyên phát Có 62 5821 S62 Acinar Nguyên phát Không 63 42536 S63 Acinar Di Không 64 5290 S64 Papilary Nguyên phát 3A Có 65 22624 S65 Solid Nguyên phát 2B Không 66 44004 S66 Solid Nguyên phát 3A Có 67 42705 S67 Acinar Nguyên phát 3B Không 68 32862 S68 Solid Nguyên phát 3A Không 69 42850 S69 Acinar Nguyên phát 3A Có 70 90391 S70 Solid Nguyên phát 3B Không 71 57965 S71 Solid Nguyên phát Có 72 66349 S72 Solid Nguyên phát Có 73 44507 S73 Acinar Nguyên phát 3B Có 74 14090 S74 Solid Nguyên phát Có 75 M828 S75 Papilary Nguyên phát 3A Có 76 33960 S76 Acinar Di Có 77 10808 S77 Papilary Nguyên phát 2A Có 78 42516 S78 Acinar Di Khơng 79 38272 S79 Solid Nguyên phát Có 80 44006 S80 Acinar Nguyên phát 3A Có 81 45150 S81 Acinar Nguyên phát Có 82 44748 S82 Acinar Nguyên phát 3A Khơng 83 39062 S83 Acinar Ngun phát Có 84 93133 S84 Solid Nguyên phát 2B Có 85 44874 S85 Acinar Nguyên phát 3B Không 86 49313 S86 Acinar Nguyên phát 3B Không 87 45407 S87 Solid Di Khơng 88 10087 S88 Papilary Ngun phát Có 89 89195 S89 Solid Nguyên phát 3A Không 90 45282 S90 Acinar Di Không 91 43942 S91 Acinar Nguyên phát 3B Không 92 52957 S92 Acinar Nguyên phát 3A Khơng 93 10793 S93 Acinar Ngun phát 2B Có 94 12395 S94 Solid Nguyên phát 3B Không 95 12905 S95 Acinar Nguyên phát 2B Không 96 41967 S96 Acinar Nguyên phát 3B Có 97 52178 S97 Solid Nguyên phát Có 98 44771 S98 Acinar Di Khơng 99 44144 S99 Solid Nguyên phát 3B Có 100 46210 S100 Acinar Nguyên phát Có 101 46628 S101 Acinar Di có 102 45998 S102 Solid Di Có 103 47046 S103 Acinar Di Có 104 38325 S104 Solid Di Có 105 43861 S105 Solid Nguyên phát 3A Có 106 94807 S106 Papilary Nguyên phát Không 107 46146 S107 Solid Nguyên phát 3B Có 108 57240 S108 Acinar Ngun phát Khơng 109 68116 S109 Solid Nguyên phát Không 110 32619 S110 Acinar Nguyên phát 3A Không 111 94607 S111 Acinar Di Có 112 47562 S112 Solid Di Có 113 45312 S113 Acinar Nguyên phát 3B Có 114 62319 S114 Acinar Di Không 115 95421 S115 Papilary Nguyên phát Có 116 59222 S116 Acinar Di Có 117 45392 S117 Acinar Nguyên phát 3A Khơng 118 52412 S118 Acinar Ngun phát 3B Có 119 67142 S119 Solid Nguyên phát 3A Không 120 37039 S120 Solid Nguyên phát 3B Có 121 99551 S121 Solid Nguyên phát Có 122 56484 S122 Solid Nguyên phát Có 123 99696 S123 Solid Di Khơng 124 56128 S124 Papilary Di Không 125 56309 S125 Solid Nguyên phát 3A có 126 55923 S126 Acinar Nguyên phát 3B Không 127 59068 S127 Acinar Nguyên phát 3A Có 128 30471 S128 Solid Ngun phát 3B Khơng 129 43248 S129 Acinar Nguyên phát Không 130 43860 S130 Papilary Nguyên phát Có 131 59993 S131 Acinar Nguyên phát 3A Không 132 41418 S132 Acinar Nguyên phát 3A Có 133 45528 S133 Solid Nguyên phát Có 134 59050 S134 Acinar Nguyên phát 3A Có 135 43573 S135 Papilary Nguyên phát Có 136 62996 S136 Micro-Papillary Nguyên phát Có 137 39885 S137 Solid Nguyên phát 3B Có 138 22053 S138 Acinar Ngun phát Khơng 139 49473 S139 Acinar Di Không PHỤ LỤC 2: Kết nồng độ DNA, đột biến, methyl hóa biểu EGFR STT Số GPB Ký hiệu Nồng độ DNA (ng/µl) Đột biến EGFR Methyl hóa EGFR Biểu EGFR 22724 S1 190,5 Wildtype - Âm tính 30706 S2 262,4 Wildtype - 2+ 38917 S3 220,4 L858R + 2+ 34221 S4 196,8 Wildtype - 2+ 52455 S5 107,6 Wildtype - 2+ 38814 S6 238,9 Del - 3+ 36505 S7 90,59 Wildtype - 3+ 38663 S8 175,2 L858R + Âm tính 62635 S9 141,0 Wildtype - 3+ 10 24617 S10 137,4 Wildtype - 2+ 11 3634 S11 101,8 Wildtype - 2+ 12 17030 S12 207,4 Wildtype - Âm tính 13 30270 S13 271,9 T790 - 1+ 14 7821 S14 186,8 G719X, L861Q + Âm tính 15 445 S15 265,3 Wildtype + Âm tính 16 36391 S16 306,4 Wildtype - 2+ 17 33066 S17 212,7 Wildtype - 3+ 18 36868 S18 318,5 Wildtype + 1+ 19 31542 S19 304,3 L858R + 2+ 20 29023 S20 284,2 Wildtype - Âm tính 21 27189 S21 273,3 T790M+Del - 1+ 22 38698 S22 211,8 S768I - Âm tính 23 37451 S23 90,76 Wildtype - 2+ 24 64484 S24 106,3 Wildtype - 2+ 25 61609 S25 138,0 Wildtype + Âm tính 26 43883 S26 140,1 L858R - 2+ 27 58838 S27 216,0 Wildtype - 2+ 28 34385 S28 167,4 G719X - 1+ 29 17026 S29 127,0 Wildtype - 3+ 30 30550 S30 350,9 Wildtype - 2+ 31 72498 S31 128,8 Del - 3+ 32 32540 S32 205,8 Wildtype - 2+ 33 39886 S33 25,59 Del - 3+ 34 64146 S34 196,0 Wildtype + 2+ 35 40828 S35 25,46 Del - 2+ 36 39305 S36 34,44 Del - 2+ 37 32926 S37 147,0 G719X, S768I - 1+ 38 41294 S38 386 Wildtype - 3+ 39 64249 S39 194,1 Wildtype - 3+ 40 R1097 S40 105,1 L858R - 2+ 41 63959 S41 206,0 Wildtype - 2+ 42 61036 S42 344,9 Wildtype + Âm tính 43 41240 S43 108,2 L858R - 2+ 44 29311 S44 163,3 Wildtype - 2+ 45 5999 S45 174,3 Wildtype + 1+ 46 33351 S46 170,1 Wildtype - 1+ 47 3163 S47 53,89 G719X, L858R - 2+ 48 63005 S48 120,2 Wildtype + Âm tính 49 32040 S49 25,90 Del + 1+ 50 41730 S50 180,0 L858R - 3+ 51 1525 S51 301,7 Wildtype - 2+ 52 57820 S52 237,8 Del + 2+ 53 47854 S53 242,2 Wildtype - 2+ 54 33244 S54 241,4 L858R - 2+ 55 DA394 S55 62,38 G719X, S768I - 3+ 56 42712 S56 229,0 Del - Âm tính 57 39816 S57 158,9 Wildtype - 1+ 58 40539 S58 202,8 Wildtype - 3+ 59 32335 S59 138,9 Wildtype - 2+ 60 62660 S60 285,8 Wildtype - 2+ 61 33892 S61 196,9 Wildtype + 1+ 62 5821 S62 145,7 Wildtype - 1+ 63 42536 S63 120,4 L858R - 2+ 64 5290 S64 164,9 Wildtype - 1+ 65 22624 S65 112,4 L858R - Âm tính 66 44004 S66 23,48 Wildtype + 1+ 67 42705 S67 79,31 Wildtype - 1+ 68 32862 S68 205,0 Wildtype - Âm tính 69 42850 S69 875,7 Wildtype - 1+ 70 90391 S70 103,2 Wildtype - 2+ 71 57965 S71 467,1 Wildtype + Âm tính 72 66349 S72 457,6 Wildtype + 1+ 73 44507 S73 39,37 Wildtype - 2+ 74 14090 S74 96,51 Wildtype + Âm tính 75 M828 S75 134,3 Wildtype - 2+ 76 33960 S76 389,4 Wildtype - 1+ 77 10808 S77 420,2 Wildtype - 1+ 78 42516 S78 181,3 Wildtype - 1+ 79 38272 S79 127,4 Wildtype - 2+ 80 44006 S80 68,11 Wildtype - 3+ 81 45150 S81 187,8 Wildtype - 2+ 82 44748 S82 161,1 Del, L858R + 3+ 83 39062 S83 94,72 L858R + Âm tính 84 93133 S84 124,8 L861Q - 3+ 85 44874 S85 287,4 Wildtype - Âm tính 86 49313 S86 34,43 Wildtype - 2+ 87 45407 S87 142,0 Wildtype + 1+ 88 10087 S88 264,1 Wildtype - 2+ 89 89195 S89 177,5 L858R - 2+ 90 45282 S90 284,6 Wildtype - 1+ 91 43942 S91 50,66 Del + 2+ 92 52957 S92 235,1 Wildtype + 2+ 93 10793 S93 157,0 Wildtype - 2+ 94 12395 S94 961,0 Wildtype - 2+ 95 12905 S95 1172,5 Del - 3+ 96 41967 S96 29,91 Wildtype - Âm tính 97 52178 S97 273,9 Wildtype - 1+ 98 44771 S98 22,74 Del - 2+ 99 44144 S99 72,25 Del + 1+ 100 46210 S100 408,3 Wildtype + 3+ 101 46628 S101 183,9 Del - 2+ 102 45998 S102 421,3 Wildtype - Âm tính 103 47046 S103 124,0 Del + 2+ 104 38325 S104 346,5 Ins - Âm tính 105 43861 S105 72,75 Wildtype - 2+ 106 94807 S106 92,14 L858R - 2+ 107 46146 S107 95,68 Wildtype - Âm tính 108 57240 S108 224,8 Del - 2+ 109 68116 S109 293,8 Wildtype - 2+ 110 32619 S110 43,62 L858R - 2+ 111 94607 S111 257,8 Del + 1+ 112 47562 S112 116,9 Wildtype + Âm tính 113 45312 S113 188,9 Wildtype + 2+ 114 62319 S114 189,6 Wildtype - 2+ 115 95421 S115 132,2 Wildtype - 2+ 116 59222 S116 807,3 Wildtype - 2+ 117 45392 S117 96,04 Wildtype - 3+ 118 52412 S118 679,7 Wildtype - Âm tính 119 67142 S119 102,1 Wildtype - 2+ 120 37039 S120 114,2 Wildtype - 2+ 121 99551 S121 411,4 Wildtype - 2+ 122 56484 S122 324,3 Wildtype + 2+ 123 99696 S123 114,8 Wildtype - Âm tính 124 56128 S124 306,4 L858R + Âm tính 125 56309 S125 176,3 Wildtype - 2+ 126 55923 S126 152,0 Del - 1+ 127 59068 S127 58,18 Wildtype - 3+ 128 30471 S128 380,5 T790M + Âm tính 129 43248 S129 184,8 L858R - Âm tính 130 43860 S130 39,06 Wildtype - 2+ 131 59993 S131 32,76 L858R + 2+ 132 41418 S132 200,8 Wildtype - Âm tính 133 45528 S133 172,6 Wildtype - Âm tính 134 59050 S134 117,5 Wildtype - 2+ 135 43573 S135 177,8 Wildtype - Âm tính 136 62996 S136 195,8 Del - Âm tính 137 39885 S137 264,8 Wildtype - 3+ 138 22053 S138 125,6 Del - 2+ 139 49473 S139 208,5 Del - Âm tính PHỤ LỤC 3: Kết methyl hóa gen BRCA1, MGMT, MLH1 RASSF1A STT Số GPB Ký hiệu Methyl hóa gen BRCA1 Methyl hóa gen MGMT Methyl hóa gen MLH1 Methyl hóa gen RASSF1A 22724 S1 - - - - 30706 S2 - - - + 38917 S3 - - - - 34221 S4 - - - - 52455 S5 - + - - 38814 S6 - + - + 36505 S7 - + - + 38663 S8 + - - - 62635 S9 - - - - 10 24617 S10 - - - - 11 3634 S11 - - + + 12 17030 S12 - - - + 13 30270 S13 - + - - 14 7821 S14 - - - - 15 445 S15 + + + + 16 36391 S16 - + + + 17 33066 S17 - - + + 18 36868 S18 + + + + 19 31542 S19 - + - - 20 29023 S20 - + + - 21 27189 S21 - + - - 22 38698 S22 - - + - 23 37451 S23 - - - - 24 64484 S24 - - - - 25 61609 S25 - - - - 26 43883 S26 - - - - 27 58838 S27 - - - - 28 34385 S28 + - + + 29 17026 S29 + - - - 30 30550 S30 - - - - 31 72498 S31 + - - - 32 32540 S32 + - - - 33 39886 S33 - - - - 34 64146 S34 - - - - 35 40828 S35 + - - + 36 39305 S36 - - - - 37 32926 S37 - - - - 38 41294 S38 - + - - 39 64249 S39 - + - - 40 R1097 S40 - - - - 41 63959 S41 + - - + 42 61036 S42 + + - - 43 41240 S43 - - - + 44 29311 S44 - + - - 45 5999 S45 - + - + 46 33351 S46 + + - - 47 3163 S47 + - - - 48 63005 S48 + + - + 49 32040 S49 - - - - 50 41730 S50 - - - - 51 1525 S51 + - - + 52 57820 S52 - + + - 53 47854 S53 + - - - 54 33244 S54 + - - - 55 DA394 S55 - - - - 56 42712 S56 + - - - 57 39816 S57 + - - + 58 40539 S58 + - - + 59 32335 S59 - + - + 60 62660 S60 + - + + 61 33892 S61 + - + + 62 5821 S62 - - + - 63 42536 S63 - - - - 64 5290 S64 - - - + 65 22624 S65 + - - + 66 44004 S66 + - - - 67 42705 S67 - + - - 68 32862 S68 + + - - 69 42850 S69 + + + + 70 90391 S70 + + + + 71 57965 S71 - - - + 72 66349 S72 - - + + 73 44507 S73 + + - + 74 14090 S74 - + + + 75 M828 S75 - - - - 76 33960 S76 + - - - 77 10808 S77 + + - + 78 42516 S78 - - - - 79 38272 S79 + - - + 80 44006 S80 + + - - 81 45150 S81 + + + + 82 44748 S82 - - - - 83 39062 S83 - + - - 84 93133 S84 - - - - 85 44874 S85 - - - - 86 49313 S86 - - - - 87 45407 S87 + - - + 88 10087 S88 - + - - 89 89195 S89 - - - - 90 45282 S90 + - + - 91 43942 S91 - - + + 92 52957 S92 - - + - 93 10793 S93 - + + + 94 12395 S94 - - - - 95 12905 S95 - - - - 96 41967 S96 - + - - 97 52178 S97 + - - + 98 44771 S98 - + - - 99 44144 S99 - - - - 100 46210 S100 - - - - 101 46628 S101 - + - - 102 45998 S102 - + + + 103 47046 S103 - + + - 104 38325 S104 - - + - 105 43861 S105 - - - - 106 94807 S106 - - + - 107 46146 S107 - - + - 108 57240 S108 - - + + 109 68116 S109 - - - - 110 32619 S110 - - - - 111 94607 S111 - - - - 112 47562 S112 + - - - 113 45312 S113 - + - - 114 62319 S114 - + - - 115 95421 S115 - - - + 116 59222 S116 - - - - 117 45392 S117 - - - - 118 52412 S118 - + - - 119 67142 S119 - - - - 120 37039 S120 + - - - 121 99551 S121 - + - - 122 56484 S122 + + + - 123 99696 S123 + + - + 124 56128 S124 + - - - 125 56309 S125 - + - - 126 55923 S126 - + - - 127 59068 S127 - - - - 128 30471 S128 - - - - 129 43248 S129 - - - - 130 43860 S130 - - - - 131 59993 S131 - + - - 132 41418 S132 + + - - 133 45528 S133 - - - + 134 59050 S134 - - - - 135 43573 S135 - - - - 136 62996 S136 - - - - 137 39885 S137 - - - - 138 22053 S138 - - - - 139 49473 S139 - - - - 140 38917-2 S140 - - - - 141 34221-2 S141 - - - - 142 38698-2 S142 - - - - 143 32540-2 S143 - - - - 144 39816-2 S144 - - - - 145 Máu S145 - - - - PHỤ LỤC 4: 29 đột biến đƣợc phát kit Therascreen EGFR RGQ PCR Đột biến Exon Vị trí thay đổi COSMIC ID T790M 20 2369C>T 6240 L858R 21 2573T>G 6224 L861Q 21 2582T>A 6213 S768I 20 2303G>T 6241 G719A 18 2156G>C 6239 G719S 18 2155G>A 6252 G719C 18 2155G>T 6253 Thêm đoạn 20 2307_2308ins9 12376 2319_2320insCAC 12377 2310_2311insGGT 12378 2237_2255>T (complex) 12384 2236_2250del15 6225 2238_2255del18 6220 2238_2248>GC (complex) 12422 2238_2252>GCA (complex) 12419 2239_2247del9 6218 2239_2253del15 6254 2239_2256del18 6255 Mất đoạn 19 2239_2248TTAAGAGAAG>C (complex) 12382 2239_2258>CA (complex) 12387 2240_2251del12 6210 2240_2257del18 12370 2240_2254del15 12369 2239_2251>C (complex) 12383 PHỤ LỤC 5: Kết giải trình tự Phụ lục 5.1: Trình tự promoter gen EGFR methyl hóa Hình 5.1 Trình tự vùng promoter gen EGFR methyl Phụ lục 5.2 Trình tự promoter gen EGFR khơng methyl hóa Hình 5.2 Trình tự vùng promoter gen EGFR khơng methyl PHỤ LỤC 6: Một số kết điện di sản phẩm MS-PCR Phụ lục 6.1: Một số kết điện di sản phẩm MS-PCR gen EGFR Hình 6.1 Kết điện di sản phẩm MS-PCR phát methyl hóa gen EGFR S: Các mẫu bệnh phẩm ung thư biểu mô tuyến phổi, L: Thang chuẩn DNA 100bp (Fermentas), M: Sản phẩm EGFR methyl hóa (158 bp), U: Sản phẩm EGFR khơng methyl hóa (150 bp), NTC: Đối chứng âm, Phụ lục 6.2: Một số kết điện di sản phẩm MS-PCR gen BRCA1 Hình 6.2 Kết điện di sản phẩm MS-PCR phát methyl hóa gen BRCA1 S: Các mẫu bệnh phẩm ung thư biểu mô tuyến phổi, L: Thang chuẩn DNA 100 bp (Fermentas), M: Sản phẩm BRCA1 methyl (70 bp), U: Sản phẩm BRCA1 không methyl (77 bp), NTC: Đối chứng âm, Phụ lục 6.3: Một số kết điện di sản phẩm MS-PCR gen MGMT Hình 6.3 Kết điện di sản phẩm MS-PCR phát methyl hóa gen MGMT S: Các mẫu bệnh phẩm ung thư biểu mô tuyến phổi, L: Thang chuẩn DNA 100 bp (Fermentas), M: Sản phẩm MGMT methyl (81 bp), U: Sản phẩm MGMT không methyl (93 bp), NTC: Đối chứng âm, Phụ lục 6.4: Một số kết điện di sản phẩm MS-PCR gen MLH1 Hình 6.4 Kết điện di sản phẩm MS-PCR phát methyl hóa MLH1 S: Các mẫu bệnh phẩm ung thư biểu mô tuyến phổi, L: Thang chuẩn DNA 100 bp (Fermentas), M: Sản phẩm MLH1 methyl (303 bp), U: Sản phẩm MLH1 không methyl (301 bp), NTC: Đối chứng âm, Phụ lục 6.5: Một số kết điện di sản phẩm MS-PCR gen RASSF1A Hình 6.5 Kết điện di sản phẩm MS-PCR phát methyl hóa gen RASSF1A, S: Các mẫu bệnh phẩm ung thư biểu mô tuyến phổi, L: thang chuẩn DNA 100bp (Fermentas), M: Sản phẩm RASSSF1A methyl (175 bp), U: Sản phẩm RASSF1A không methyl (137 bp), NTC: Đối chứng âm PHỤ LỤC 7: Kết hóa mơ miễn dịch S8 S12 S14 S13 S18 S21 S1 S2 S3 S6 S7 S29 S42 S48 S56 S37 S45 S46 S51 S52 S53 S39 S55 S58 Hình 7.1 Kết hóa mơ miễn dịch, S: Các mẫu bệnh phẩm ung thư biểu mô tuyến phổi độ phóng đại 200X ... Nghiên cứu đột biến, mức độ biểu gen EGFR tình trạng methyl hóa số gen liên quan bệnh nhân ung thƣ biểu mơ tuyến phổi với mục tiêu: Phân tích tỷ lệ đột biến mức độ biểu gen EGFR bệnh nhân ung. .. sơ bệnh án hoàn chỉnh Thu thập mẫu bệnh phẩm ung thư phổi mẫu phổi liền kề Xác định tỷ lệ đột biến mức độ biểu gen EGFR Phân tích liên quan đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu với đột biến biểu gen EGFR. .. giá tình trạng methyl hóa gen ức chế khối u quan trọng ung thư biểu mơ tuyến phổi Nghiên cứu có số đóng góp ý nghĩ thực tiễn sau: Mô tả tỷ lệ đột biến, mức độ biểu protein EGFR methyl hóa số gen
Ngày đăng: 22/01/2020, 11:24
Xem thêm: Nghiên cứu đột biến, mức độ biểu hiện gen EGFR và tình trạng METHYL hoá một số gen liên quan trên bệnh nhân ung thu biểu mô tuyến ở phổi
