Nghiên cứu đột biến, mức độ biểu hiện gen EGFR và tình trạng METHYL hoá một số gen liên quan trên bệnh nhân ung thu biểu mô tuyến ở phổi tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NGUYỄN NGỌC QUANG NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN, MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN GEN EGFR VÀ TÌNH TRẠNG METHYL HĨA MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƢ BIỂU MÔ TUYẾN Ở PHỔI Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 942 02 01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2020 Cơng trình hồn thành tại: Học viện Khoa học Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS Chu Hồng Hà, Viện Cơng nghệ sinh học Người hướng dẫn khoa học 2: TS BS Nguyễn Phi Hùng, Bệnh viện K Phản biện 1: … Phản biện 2: … Phản biện 3: … Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … ’, ngày … tháng … năm 201… Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam ĐẶT VẤN ĐỀ Tính cấp thiết luận án Ung thư phổi loại ung thư có tỷ lệ mắc tử vong cao giới Điều trị nhắm đích TKIs dựa đột biến EGFR sử dụng rộng rãi mang lại hiệu rõ rệt Xác định mức độ biểu protein EGFR góp phần quan trọng đưa tiên lượng, tiến triển bệnh cho bệnh nhân Mặt khác, biểu gen EGFR điều khiển tình trạng methyl hóa vùng promoter Cùng với EGFR, methyl hóa gen ức chế khối u như: BRCA1, MGMT, MLH1, RASSF1A xem nguyên nhân dẫn đến hình thành phát triển ung thư phổi không tế bào nhỏ Trên giới nhiều nghiên cứu đột biến EGFR bệnh nhân ung thư phổi Tuy nhiên, khơng có nhiều nghiên cứu tổng thể biến đổi phân tử gen EGFR ảnh hưởng tượng methyl hóa gen ức chế khối u lên biến đổi Với lý trên, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đột biến, mức độ biểu gen EGFR tình trạng methyl hóa số gen liên quan bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến phổi” Mục tiêu luận án Phân tích tỷ lệ đột biến mức độ biểu gen EGFR bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến phổi Đánh giá tình trạng methyl số gen bao gồm: EGFR, BRCA1, MGMT, MLH1, RASSF1A tương quan methyl hóa gen với đột biến biểu protein EGFR Nội dung nghiên cứu luận án Sàng lọc bệnh nhân, thiết lập hồ sơ bệnh án hoàn chỉnh Thu thập mẫu bệnh phẩm ung thư phổi mẫu phổi lành tính Xác định tỷ lệ đột biến biểu gen EGFR Đánh giá ảnh hưởng đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu đến đột biến biểu protein EGFR Xác định tình trạng methyl hóa vùng promoter gen EGFR, BRCA1, MGMT, MLH1 RASSF1A tương quan tượng với đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu Phân tích tương quan đột biến gen, methyl hóa vùng promoter biểu protein EGFR với methyl hóa gen ức chế khối u BRCA1, MGMT, MLH1 RASSF1A CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Ung thƣ phổi 1.1.1 Thực trạng ung thư phổi Ung thư phổi (UTP) loại ung thư phổ biến giới Việt Nam nằm nhóm nước có tần suất mắc ung thư phổi cao thuộc hàng thứ hai giới, với tỉ lệ mắc nam giới 25,5 – 41,5/100 000 dân nữ giới 7,3 – 13,6/100 000 dân 1.1.2 Phân loại ung thư phổi Ung thư phổi phân loại dựa kết xét nghiệm mô bệnh học gồm: Ung thư phổi không tế bào nhỏ (UTPKTBN) ung thư phổi tế bào nhỏ (UTPTBN) Trong ung thư biểu mô tuyến (UTBMT) dạng UTPKTBN phổ biến 1.1.3 Các giai đoạn ung thư phổi Hiện nay, hệ thống phân loại giai đoạn ung thư phổi sử dụng phổ biến hệ thống TNM (Tumor – Node – Metastasis), dựa kích thước khối u, số hạch lympho phát sinh mức độ di Theo hệ thống phân loại này, tiến triển UTP chia thành giai đoạn từ (STAGE 0) đến IV (STAGE IV) 1.2 Ung thƣ biểu mô tuyến phổi 1.2.1 Đặc điểm ung thư biểu mô tuyến Ung thư biểu mô tuyến chiếm khoảng 40% UTP, thường bắt đầu tế bào tiết thông thường tế bào tiết chất nhầy, phổ biến người không hút thuốc, nữ giới người trẻ tuổi 1.2.2 Các phân típ mơ bệnh học UTBMT Khối u ung thư biểu mơ tuyến thể biệt hóa tuyến với hay nhiều dạng phát triển gồm số dạng chính: Tổn thương lepidic, chùm nang, nhú, vi nhú dạng đặc 1.3 Biến đổi gen EGFR UTP 1.3.1 Cấu trúc chức gen EGFR EGFR nằm họ thụ thể yếu tố phát triển biểu bì (Epidermal Growth Factor Receptor) với cấu trúc gồm phần: Phần gắn phối tử màng, phần protein xuyên màng vùng hoạt hóa Tyrosine Kinase EGFR có vai trò quan trọng q trình nhân lên, apoptosis, di động, xâm nhập, sửa chữa tương tác tế bào 1.3.2 Đột biến gen EGFR UTP Đến phát khoảng 40 đột biến gen EGFR nằm rải rác exon từ 18 – 21 thuộc vùng kinase domain, có ý nghĩa quan trọng đánh giá khả đáp ứng điều trị TKIs ung thư biểu mô tuyến phổi 1.3.3 Biểu protein EGFR UTP Methyl hóa có liên quan mật thiết đến biểu gen EGFR Nghiên cứu đặc điểm phân tử tạo điều kiện cho phát triển dấu ấn sinh học hữu ích thử nghiệm lâm sàng 1.4 Methyl hóa DNA UTP 1.4.1 Methyl hóa DNA Methyl hóa DNA tượng gắn thêm gốc methyl (CH3) vào vị trí 5’ C nucleotide Methyl hóa DNA có vai trò định tế bào trạng thái bình thường in dấu gen, trì trạng thái dị nhiễm sắc, trì trạng thái bất hoạt nhiễm sắc thể X động vật có vú chia thành loại: Methyl hóa mức methyl hóa mức 1.4.2 Methyl hóa DNA UTP Methyl hóa DNA xem dấu ấn phân tử giai đoạn sớm hình thành ung thư, hỗ trợ chẩn đốn, tiên lượng định hướng điều trị ung thư phổi Trong đó, methyl hóa EGFR có liên quan trực tiếp đến hiệu điều trị thuốc điều trị đích Ngồi methyl hóa gen ức chế khối như: BRCA1, MGMG, MLH1, RASSF1A… chứng minh vai trò việc tiên lượng tiến triển bệnh nhân ung thư phổi 1.5 Điều trị đích ung thƣ UTP 1.5.1 Điều trị đích ung thư Điều trị đích ung thư chia thành loại chính: 1) Kháng thể đơn dòng, 2) Chất ức chế phân tử nhỏ 3) Độc tố miễn dịch 1.5.2 Điều trị đích UTP Hiện nay, FDA chấp thuận kháng thể đơn dòng EGFR bao gồm Cetuximab Panitumumab; chất ức chế TKIs Erlotinib, Gefitinib, Osimertinib; chất ức chế TKIs ALK Crizotinib, Ceritinib điều trị UTP 1.6 Phƣơng pháp phân tích biến đổi phân tử UTP 1.6.1 Phương pháp phân tích đột biến gen UTP Đột biến gen UTP phát thông qua nhiều phương pháp như: Giải trình tự gen, Realtime PCR, lai DNA chỗ, … 1.6.2 Phương pháp phân tích methyl hóa DNA UTP Hiện nay, ba phương pháp sử dụng để phân tích methyl hóa DNA: Kết tủa miễn dịch; sử dụng enzyme nhạy cảm methyl dựa DNA xử lý bisulfite 1.7 Nghiên cứu dấu ấn phân tử UTP Việt Nam Nhằm định hướng điều trị đích có số nghiên cứu xác định tỷ lệ đột biến gen EGFR UTPKTBN Việt Nam, Vu A.H cs., Nguyễn Minh Hà cs., Mai Trọng Khoa cs 332, 120 511 mẫu UTPKTBN nhận thấy tỷ lệ đột biến EGFR 40,7; 35,7 40,1% Cũng số luận án tiến đột biến gen EGFR UTP Tuy nhiên, chưa có cơng bố đánh giá đồng thời tương quan biến đổi phân tử EGFR bao gồm đột biến gen, methyl hóa DNA biểu mức protein tương ứng với thay đổi methyl hóa gen ức chế khối u phổ biến MGMT, MLH1, BRCA1, RASSF1A…trong UTP Đây xem lĩnh vực nghiên cứu ung thư Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu 139 mẫu UTBMT phổi, mẫu phổi liền kề, mẫu máu người khỏe mạnh cung cấp Bệnh viện K Việc sử dụng mẫu bệnh phẩm cho phép Bệnh viện K Các hóa chất kit dùng nghiên cứu đạt tiêu chuẩn dùng cho phân tích sinh hoc phân tử 2.2 Thiết bị Các thiết bị chuyên dụng cho nghiên cứu sinh học phân tử 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu Luận án thực PTN trọng điểm cơng nghệ gen, Viện CHSH Phòng Sinh học phân tử, Trung tâm GPB&SHPT, BV K Đề tài thực theo phương pháp mô tả cắt ngang, sử dụng kỹ thuật bao gồm: Tách chiết DNA tổng số, xác định nồng độ DNA; xử lý bisulfite DNA tổng số; PCR; MS-PCR; điện di; xác định đột biến EGFR; nhuộm hóa mơ miễn dịch; xử lý kết thống kê sinh học Chƣơng KẾT QUẢ 3.1 Đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu Trong 139 bệnh nhân nghiên cứu, độ tuổi trung bình nhóm bệnh nhân 57,4 Trong 94 nam, 45 trường hợp nữ giới 79 bệnh nhân hút thuốc 76/79 trường hợp nam Bệnh nhân nghiên cứu thuộc phân típ mơ bệnh học chủ yếu: Tuyến chùm nang (56,8%), tuyến nhú (15,8%) tuyến đặc (24,5%) 104 mẫu từ khối u nguyên phát 35 mẫu di Hầu hết bệnh nhân giai đoạn II&IV (127/139) có 12 trường hợp giai đoạn I&II 3.2 Đặc điểm phân tử EGFR bệnh nhân UTBMT phổi 3.2.1 Đột biến EGFR tương quan với đặc điểm bệnh nhân Đột biến EGFR phát 35,3% (49/139) bệnh nhân, với 12 dạng đột biến khác Đột biến đoạn exon 19 đột biến L858R (exon 21) chiếm 85,5% Bên cạnh đó, trường hợp phát đột biến xảy đồng thời Đột biến thay G719X thường xảy đồng thời với đột biến khác (4/5 trường hợp) S768I, L861Q, L858R đoạn exon 19 Đột biến EGFR xảy với tần suất cao nhóm bệnh nhân trẻ tuổi, nữ giới không hút thuốc Đồng thời, bệnh nhân thuộc phân típ đặc có tỷ lệ đột biến thấp so với phân típ lại (Bảng 3.3) 3.2.3 Biểu EGFR tương quan với đặc điểm bệnh nhân Biểu protetin EGFR đánh giá phương pháp hóa mơ miễn dịch Kết cho thấy 57 (41,0%) mẫu âm tính (IHC: 0, 1+) 82 (59,0%) mẫu dương tính (IHC: 2+, 3+) với biểu EGFR Khơng có tương quan biểu EGFR với đặc điểm bệnh nhân bao gồm: Tuổi, giới tính, tình trạng hút thuốc, phân típ mơ bệnh học, tình trạng u giai đoạn bệnh (p>0,05) (Bảng 3.6) Bảng 3.3: Tương quan đột biến EGFR với đặc điểm bệnh nhân Đột biến EGFR Số lƣợng Tuổi (57,4 ±10,8) ≤57,4 ˃ 57,4 Giới tính Nam Nữ Hút thuốc Có Khơng Phân típ mơ học Chùm nang Nhú Vi nhú Đặc Hỗn hợp Khối u Nguyên phát Di Giai đoạn I & II III & IV Có Khơng 139 49 90 67 72 30 19 37 53 94 45 23 26 71 19 79 60 20 29 59 31 79 22 34 32 7 47 15 27 104 35 36 13 68 22 12 127 43 84 p 0,023 0,05) bệnh nhân nghiên cứu Bảng 3.6: Tương quan biểu EGFR với đặc điểm bệnh nhân Biểu EGFR p Số lƣợng Tuổi (57,4 ±10,8) ≤57,4 >57,4 Giới tính Nam Nữ Hút thuốc Có Khơng Phân típ mơ học Chùm nang Nhú Vi nhú Đặc Hỗn hợp Khối u Nguyên phát Di Giai đoạn I & II III & IV Âm Dƣơng 139 57 82 67 72 29 28 38 44 94 45 35 22 59 23 79 60 31 26 48 34 79 22 34 27 18 52 13 16 104 35 39 18 64 18 12 127 32 95 0,599 0,191 0,627 0,060 0,992 0,361 0,104 0,229 0,203 0,572 3.4.2 Tương quan đột biến biểu gen EGFR với methyl hóa gen BRCA1, MGMT, MLH1 RASSF1A Kết cho thấy mối tương quan ngược đột biến EGFR methyl hóa BRCA1, MGMT RASSF1A; đột biến EGFR với methyl hóa đồng thời gen ức chế khối u (Bảng 15) Tương quan biểu EGFR methyl hóa gen MGMT, MLH1 RASSF1A ngẫu nhiên, khơng có sai khác Tuy nhiên, có tương quan mức độ biểu protein EGFR methyl BRCA1; cụ thể methyl hóa BRCA1 có xu hướng ức chế biểu EGFR Bảng 3.15: Tương quan đột biến EGFR với methyl hóa gen BRCA1, MGMT, MLH1 RASSF1A ĐỘT BIẾN EGFR METHYL BRCA1 MGMT MLH1 RASSF1A trong 4 Số lƣợng Đột biến Kiểu dại 139 49 90 M 41 32 U 98 40 58 M 46 11 35 U 93 38 55 M 28 20 U 111 41 70 M 41 34 U 98 42 56 M 90 26 64 U 49 23 26 M 41 35 U 98 43 55 M 17 16 U 122 48 74 M 5 U 134 49 85 11 Giá trị p 0,034 0,049 0,408 0,004 0,041 0,001 0,004 0,106 3.4.3 Tương quan tình trạng methyl gen liên quan đến UTP Hiện tượng methyl hóa EGFR gen BRCA1, MGMT, MLH1 RASSF1A mẫu UTBMT phổi nghiên cứu xảy ngẫu nhiên, khơng có khác biệt Có tương quan thuận methyl RASSF1A với methyl MLH1 BRCA1 (p