Nghiên cứu tỷ lệ biểu lộ và đột biến gen LMP1 của virus epstein barr và HLA trên bệnh nhân ung thư vòm mũi họng tại thành phố cần thơ tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chun ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Mã ngành: 62 42 02 01 TRỊNH THỊ HỒNG CỦA NGHIÊN CỨU TỶ LỆ BIỂU LỘ VÀ ĐỘT BIẾN GEN LMP1 CỦA VIRUS EPSTEIN-BARR VÀ HLA TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ VÒM MŨI HỌNG TẠI THÀNH PHỐ CẦN THƠ Cần Thơ, 2020 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn chính: PGS.TS Trần Ngọc Dung Người hướng dẫn phụ: GS.TSKH Phan Thị Phi Phi Luận án bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp Trường Họp tại: ……………………………,Trường Đại học Cần Thơ Vào lúc … … ngày … tháng … năm 2020 Phản biện 1: ………………………………… Phản biện 2: ………………………………… Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ Thư viện Quốc gia Việt Nam DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Trịnh Thị Hồng Của, Trần Ngọc Dung, Hồng Đức Trình, Dương Thị Loan 2017 Đặc điểm lâm sàng thể mô bệnh học bệnh nhân ung thư biểu mơ vịm mũi họng điều trị Bệnh viện Ung Bướu thành phố Cần Thơ Tạp chí Y học Thực hành Journal of practical medicine JPM 12 (1064) 2017, ISSN: 1859-1663, trang 42-43 Trịnh Thị Hồng Của, Trần Ngọc Dung, Trần Văn Bé Năm, Phan Thị Phi Phi 2018 Xác định tỷ lệ biểu lộ gen LMP1 EBV mẫu sinh thiết tươi bệnh nhân ung thư vòm mũi họng Bệnh viện Ung Bướu thành phố Cần Thơ Tạp chí Y học Việt Nam, ISSN: 1859-1868, tháng 8-số 1&2, 2018, tập 469, trang 141-142 Trịnh Thị Hồng Của, Trần Ngọc Dung, Tạ Văn Tờ, Phan Thị Phi Phi 2018 Tần suất đột biến gen LMP1 virus Epstein-Barr mẫu sinh thiết vòm bệnh nhân ung thư vòm mũi họng Bệnh viện Ung Bướu Cần Thơ Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, ISSN: 1859-2333, tập 55, số chuyên đề: Công nghệ sinh học (2019) (1), trang 66-71 DOI: 10.22144/ctu.jsi.2019.008 Chương GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Ung thư vòm mũi họng (UTVMH) khối u ác tính xuất phát chủ yếu từ lớp tế bào biểu mơ phủ vịm mũi họng (Bùi Diệu, 2012) Việt Nam nước có tỷ lệ mắc bệnh trung bình (5,4 người/100.000 dân/năm) (Bùi Diệu, 2011) Bệnh UTVMH thường chẩn đoán muộn, dẫn đến kết điều trị làm tỷ lệ tử vong tăng cao Do đó, yêu cầu thiết tìm giải pháp giúp chẩn đốn bệnh giai đoạn sớm bệnh UTVMH Đột biến đoạn 30 bp gen LMP1 (Latent Membrance Protein 1) EBV (Virus Epstein-Barr), xem yếu tố định bệnh sinh học UTVMH yếu tố địa gen HLA (Human Leukocyte Antigen) nhạy cảm với UTVMH góp phần giải thích tỷ lệ bệnh khác khu vực địa lý Việc xác định đột biến gen LMP1 bệnh nhân UTVMH tần suất xuất HLA nhạy cảm bệnh xem yếu tố định chẩn đoán sớm bệnh hay không? Mối liên quan yếu tố sinh bệnh học UTVMH? Đây vấn đề nhiều bàn luận Xuất phát từ sở phân tích trên, luận án “Nghiên cứu tỷ lệ biểu lộ đột biến gen LMP1 Virus Epstein-Barr HLA bệnh nhân ung thư vòm mũi họng Thành phố Cần Thơ” thực 1.2 Mục tiêu đề tài (1) Xác định tỷ lệ diện đột biến gen LMP1 virus Epstein-Barr (2) Xác định tần suất type HLA phổ biến người bệnh ung thư vịm mũi họng (3) Tìm hiểu giá trị đột biến gen LMP1 type HLA chẩn đốn xác định bệnh ung thư vịm mũi họng 1.3 Ý nghĩa luận án 1.3.1 Ý nghĩa khoa học - Cung cấp liệu khoa học tỷ lệ diện kiểu đột biến gen (kiểu đột biến đoạn 30 bp) gen LMP1 EBV tần suất alen HLA bệnh nhân (BN) UTVMH Đồng sông Cửu Long, miền Nam Việt Nam - Là tài liệu khoa học làm tiền đề cho nghiên cứu 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn Nghiên cứu góp phần cung cấp thông tin sinh bệnh học UTVMH, hỗ trợ cho việc chẩn đoán xác định, tiên lượng bệnh nhân xác hơn, từ đó, góp phần mang lại hiệu điều trị thiết thực 1.4 Tính luận án - Luận án cơng trình nghiên cứu bệnh sinh học UTVMH Đồng sơng Cửu Long - Có thể ứng dụng triển khai kỹ thuật PCR LMP1 để xác định đột biến đoạn 30 bp gen LMP1 sở y tế có trang bị phịng xét nghiệm sinh học phân tử Thành phố Cần Thơ vùng Đồng sông Cửu Long Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Bệnh ung thư vòm mũi họng 2.1.1 Đặc điểm lâm sàng bệnh UTVMH: tùy vào vị trí khối u, hướng mức độ xâm lấn (tai, mũi, mắt, hạch cổ,…) 2.1.2 Phân loại mô bệnh học UTVMH: theo Tổ chức Y tế giới năm 2005 2.1.3 Xếp loại T, N, M giai đoạn bệnh UTVMH: theo Hiệp hội quốc tế chống ung thư năm 2010 2.2 Virus Epstein-Barr - Virus Epstein-Barr phân loại thuộc nhóm I (DNA chuỗi kép-dsDNA virus), Herpesvirales, họ Herpesviridae, chi gammaherpesviridae, loài Lymphocryptovirus, loại Human Herpesviridae - Gen LMP1 có kích thước khoảng 2,6 kb, vị trí từ 166483169088, mã hóa cho protein LMP1 gồm 386 acid amin chia làm vùng hoạt hóa, kích hoạt đường tín hiệu nội bào điểm mấu chốt sự phát triển tăng sinh tế bào ác tính UTVMH (Kang and Kieff, 2015) - Sự diện đột biến gen LMP1 (kiểu đột biến đoạn 30 bp) mẫu mô sinh thiết BN UTVMH khẳng định Thế giới Việt Nam: 81% (34/42) LMP1 (+) 56% (19/34) Del 30 bp (Hui et al., 2008); 85,7% (18/21) Del 30 bp (Tang et al., 2008); 100% (20/20) LMP1 (+) 90% (18/20) Del 30 bp (Phạm Thị Nguyệt Hằng, Phan Thị Phi Phi ctv, 2003); 60% Del 30 bp (Nguyen-Van D et al., 2008) - Vai trò đột biến đoạn 30 bp gen LMP1 giúp cho tồn EBV thoát khỏi giám sát hệ miễn dịch (Tang et al., 2008) 2.3 Yếu tố địa HLA 2.3.1 Cấu trúc gen HLA - Cụm gen HLA vùng chứa nhiều gen đa kiểu hình xếp tương đối gần nằm cánh ngắn nhiễm sắc thể thứ (đoạn 6p21.3), riêng gen mã hóa cho βmicroglobuline (thành phần cấu tạo HLA lớp I) nhiễm sắc thể thứ 15 (15q21-q22.2) (Phan Thị Phi Phi, 2007), đó: + HLA lớp I: gồm có gen HLA-A, HLA-B, HLA-C mã hố cho kháng nguyên HLA tương ứng + HLA lớp II: gồm có gen HLA-DR, -DQ, -DP mã hố cho kháng nguyên HLA tương ứng - Haplotype: kết hợp alen locus nhiễm sắc thể đơn Hình 2.1: Vị trí gen HLA nhiễm sắc thể số Nguồn:https://ghr.nlm.nih.gov/art/large/hla.jpeg, truy cập ngày12/7/2014 2.3.2 Vai trò HLA bệnh sinh UTVMH Bệnh UTVMH có liên quan đến vai trị trình diện kháng ngun phân tử HLA làm ảnh hưởng đến vai trò tế bào Tc tham gia đáp ứng miễn dịch tế bào chống kháng nguyên EBV có mặt tế bào ung thư biểu mơ vịm họng (đoạn peptid LMP1) (trích dẫn Trần Ngọc Dung, 2000; Su et al., 2013) 2.3.3 Tính cảm thụ bệnh lý HLA với bệnh UTVMH Các nghiên cứu cho thấy, tần suất kháng nguyên HLA cao (gen dễ mắc bệnh) hay thấp (gen bảo vệ) số bệnh lý, gọi tính cảm thụ bệnh Một số alen HLA có tần suất cao với bệnh HLA-A*02,-A*11, -A*24, -A*33; B*07, -B*15, -B*46; -DRB1*04,-DRB1*09, -DRB1*12; DQB1*03, -DQB1*05, -DQB1*06 (Trần Ngọc Dung, 2000; Yu et al., 2009; Su et al., 2013; Wang and Wang., 2014) 2.4 Các kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng chẩn đoán gen LMP1 EBV HLA Hiện nay, để nghiên cứu gen LMP1 EBV có hai kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng rộng rãi kỹ thuật khuếch đại gen kỹ thuật giải trình tự gen Riêng xác định gen HLA, bên cạnh kỹ thuật huyết học ngày có kỹ thuật sinh học phân tử có độ phân giải cao kỹ thuật PCR-SSP, PCR-SSO, PCR-SBT kỹ thuật giải trình tự gen hệ (NGS) Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tượng nghiên cứu 3.1.1 Tiêu chuẩn chọn mẫu: - BN có kết mơ bệnh học ung thư biểu mơ vịm mũi họng thể, điều trị Bệnh viện Ung bướu Cần Thơ; khơng giới hạn tuổi, giới tính nơi cư trú - Mẫu mơ sinh thiết vịm mũi họng: Mẫu tươi (khối lượng 0,5-4 mg; chưa qua xử lý) mẫu mô vùi nến parafin (sử dụng trường hợp mẫu tươi không đạt khối lượng mẫu bệnh nhân; thời gian thu nhận mẫu không tuần; khoảng 10 lát, dầy µm) 3.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ: tái phát; khám định kỳ q trình điều trị; kết mơ bệnh học sarcome hay u lympho; không đồng ý tham gia nghiên cứu 3.1.3 Thời gian nghiên cứu: từ tháng 9/2014 đến 12/2018 3.1.4 Địa điểm nghiên cứu - Thu thập ĐTNC Bệnh viện Ung bướu Cần Thơ - Thực kỹ thuật xét nghiệm: Khoa giải phẫu bệnh, Bệnh viện Ung bướu Cần Thơ; xác chẩn Khoa giải phẫu bệnh, Bệnh viện K Hà Nội; Phòng xét nghiệm Sinh học phân tử, Trường Đại học Y dược Cần Thơ; Phịng thí nghiệm Sinh học phân tử, Viện nghiên cứu phát triển công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ đơn vị xét nghiệm-miễn dịch, Bệnh viện Chợ Rẫy 3.2 Phương tiện phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất: Nghiên cứu sử dụng trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất để thực kỹ thuật tách chiết DNA, kỹ thuật PCR điện di; kỹ thuật giải trình tự hệ thống máy giải trình tự tự động; kỹ thuật PCR-SSO 3.2.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.2.1 Thiết kế nghiên cứu: nghiên cứu mô tả cắt ngang phân tích 3.2.2.2 Cở mẫu phương pháp chọn mẫu - Mục tiêu 1: + Áp dụng công thức ước lượng cho tỷ lệ để tính cở mẫu cho mục tiêu 1: Trong đó: α xác suất sai lầm loại 1, chọn α = 0,05 Z: trị số từ phân phối chuẩn p: Tỷ lệ phát đột biến gen LMP1 EBV mơ sinh thiết vịm họng kỹ thuật PCR 90% (theo Phạm Thị Nguyệt Hằng, Phan Thị Phi Phi ctv., 2003) d: sai số tương đối, chọn d = 0,06 Tính cở mẫu nghiên cứu 96 mẫu, làm tròn thành 100 mẫu nghiên cứu Trong thực tế, luận án nghiên cứu 108 trường hợp + Chọn mẫu toàn thỏa tiêu chuẩn chọn mẫu - Mục tiêu 2: + Mẫu BN: cở mẫu 30 BN UTVMH nghiên cứu có diện gen LMP1 EBV (mục tiêu 1); chọn ngẫu nhiên đơn + Mẫu đối chứng: Thu thập kết định type HLA từ 30 người bình thường khỏe mạnh, thực xét nghiệm gen HLA Bệnh viện Truyền máu huyết học Thành phố Hồ Chí Minh với mục đích hiến tạng; chọn ngẫu nhiên đơn từ kết lưu trữ, 4.2 Tỷ lệ diện gen LMP1 mẫu mơ sinh thiết vịm UTVMH M 200 bp Giếng M: Thang chuẩn 100 bp Giếng (mẫu 001): LMP1 (-) Giếng (mẫu 010): LMP1 (+) 230 bp Giếng (mẫu 005): LMP1 (+) 200 bp Giếng (mẫu 009): LMP1 (-) Giếng (mẫu 014): LMP1 (-) Giếng (nước cất - d2 H2O): (-) 230 bp 200 bp Hình 4.1: Hình ảnh vạch điện di có diện gen LMP1 EBV mẫu nghiên cứu - Từ kết Hình 4.1, chúng tơi tính tỷ lệ hiện gen LMP1 EBV mẫu mô sinh thiết BN UTVMH nghiên cứu 64,8% (70/108) tỷ lệ khơng có diện gen LMP1 EBV 35,2% (38/108) (Biểu đồ 4.1) So sánh với kết nghiên cứu ngồi nước có phương pháp khảo sát (kỹ thuật PCR cổ điển với thiết kế mồi vị trí gen LMP1), chúng tơi nhận thấy có khác tùy theo khu vực địa lý: Kết cao tác giả Lê Thanh Hà ctv., (2014) (53,1%); Hussain et al., (2015) (61,3%) lại thấp Adam et al., (2011) (84,5%), Tan et al., (2003) (83%), Hui et al., (2008) (81%) Sự khác biệt này, theo chúng tơi, khác loại mẫu mô đưa vào nghiên cứu 13 Biểu đồ 4.1: Tỷ lệ diện gen LMP1 EBV mẫu mơ sinh thiết vịm BN UTVMH nghiên cứu (n = 108) - Tỷ lệ diện gen LMP1 EBV mẫu mô sinh thiết vòm theo số đặc điểm chung BN UTVMH nghiên cứu: + Về đặc tính sinh học: tỷ lệ diện gen LMP1 EBV mô sinh thiết vịm BN UTVMH khơng có khác biệt hai giới (nam, nữ), không khác biệt nhóm tuổi (< 40 tuổi, ≥ 40 tuổi) giai đoạn bệnh (sớm, muộn) BN Nhận định phù hợp với kết nghiên cứu khác + Về loại mẫu mô sinh thiết: tỷ lệ diện gen LMP1 EBV mẫu mô tươi 76,3% (29/38) cao so với tỷ lệ biểu lộ gen LMP1 EBV mẫu mô vùi nến parafin 58,6% (41/70), nhiên, khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê với p = 0,065, có nghĩa tỷ lệ diện gen LMP1 EBV từ loại mẫu xem Tuy nhiên, để có nhận định xác điều cần nghiên cứu thêm cở mẫu lớn 14 + Về thể mô bệnh học: tỷ lệ diện gen LMP1 EBV thể ung thư tế bào biểu mơ khơng biệt hóa 68,3% (28/41) cao tỷ lệ diện gen thể ung thư tế bào biểu mơ gai khơng sừng hóa 62,7% (42/67) khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) 4.3 Tỷ lệ loại đột biến gen LMP1 mẫu mô sinh thiết vòm BN UTVMH nghiên cứu 4.3.1 Bằng kỹ thuật PCR điện di: Trong 70 mẫu mô sinh thiết vịm bệnh nhân có gen LMP1 EBV (+), kỹ thuật điện di phát 27,1% (19/70) sản phẩm khuếch đại có kích thước 230 bp 72,9% (51/70) sản phẩm khuếch đại có kích thước 200 bp Như vậy, phát 72,9% trường hợp có đột biến đoạn 30 bp LMP1 EBV Tương tự, so sánh với nghiên cứu trước ngồi nước, chúng tơi nhận thấy: kết cao tác giả Nurhantari et al., (2003) (25,5%); Zhang et al., (2004) (51,51%); Hui et al., (2008) (55,9%); Boutheina et al., (2006) (66,67%) lại thấp Phạm Thị Nguyệt Hằng, Phan Thị Phi Phi ctv, (2003) (90%); Zhang et al., (2002) (84%); Tan et al., (2003) (84%); Dardari et al., (2006) (84%) Sự khác biệt khác loại mẫu mô đưa vào nghiên cứu tỷ lệ diện gen LMP1 EBV thể mô bệnh học BN UTVMH 4.3.2 Bằng kỹ thuật giải trình tự gen: Trong tổng số 70 mẫu có diện gen LMP1 EBV, chúng tơi chọn ngẫu nhiên đơn 33 mẫu có vạch điện di rõ nét, bao gồm 25 mẫu có kích thước 200 bp mẫu có kích thước 230 bp (24,25%) để xác định 15 kiểu đột biến gen LMP1 EBV kỹ thuật giải trình tự Kết sau: Hình 4.2: Kết đột biến đoạn 30 bp LMP1 EBV mẫu 111 (so với chủng B95-8 (V01555) vị trí 168266-168295) - Tỷ lệ đột biến đoạn 30 bp vị trí 168266-168295 75,8% (25/33) 24,2% (8/33) không phát kiểu đột biến đoạn 30 bp - Vị trí đoạn 30 bp gen LMP1 EBV 168266168295, thuộc vùng gen exon LMP1 EBV (168965168163), mã hóa cho 10 acid amin từ 343-352 liên quan đến vùng TES2 (313-386) đoạn carboxyl phân tử LMP1 EBV Dẫn đến khả tính định kháng nguyên (epitope) phân tử LMP1 EBV đoạn quan trọng để giúp tế bào T CD4 nhận biết kháng nguyên kết EBV tránh nhận diện tế bào miễn dịch chống ung thư 16 Hình 4.3: Kết khơng có đột biến đoạn 30 bp LMP1 EBV mẫu 135 (so với chủng B95-8 (V01555) vị trí 168266-168295) có thay đổi nucleotide vị trí 168295 (T>A) - Chúng tơi phát thêm số thay đổi nucleotide: 168295 T>A (8/8), 168225 A>T (33/33), 168308 A>G (33/33), 168320 T>C hay T>G (1/33) (32/33); riêng mẫu 192 có thêm nucleotid (168268 168269) (GC → GTC), thêm nucleotide (168276 168277) (CA → CGAA), nên tổng chiều dài đoạn lên đến 33 bp thay 30 bp (phát nghiên cứu) 4.4 Tần suất alen gen HLA BN UTVMH nghiên cứu 4.4.1 Tần suất alen gen HLA lớp I - Phát loại alen HLA-A, đó, -A*02 (40,4%), -A*11 (21,2%) -A*24 (21,2%) alen có tần suất xuất cao, đặc biệt alen -A*02 có tần suất cao BN UTVMH nghiên cứu Sự khác biệt alen HLA-A nhóm bệnh so với nhóm chứng chưa có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) 17 40,4% 21,2% 21,2% 9,6% Biểu đồ 4.2: Tần suất alen HLA-A nhóm bệnh nhóm chứng 25% 23,1% 9,6% 7,7% Biểu đồ 4.3: Tần suất alen HLA-B nhóm bệnh nhóm chứng - Phát 16 loại alen HLA-B, đó, alen có tần suất xuất cao -B*15 (25%), -B*46 (23,1%), -B*38 (9,6%) -B*07 (7,7%) Tương tự khác 18 biệt alen HLA-B nhóm bệnh so với nhóm chứng chưa có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) 4.4.2 Tần suất alen gen HLA lớp II 17,3% 12,1% 13,8% 12,1% 12,1% Biểu đồ 4.4: Tần suất alen HLA-DRB1 nhóm bệnh nhóm chứng - Phát 12 loại alen HLA-DRB1 - DRB1*12 (17,3%), -DRB1*09 (13,8%), -DRB1*04 (12,1%), -DRB1*08 (12,1%), -DRB1*15 (12,1%) alen có tần suất xuất cao nhóm bệnh Đặc biệt, alen -DRB1*08 alen làm tăng nguy mắc bệnh UTVMH với (OR = 8,098, p = 0,025) ngược lại, alen -DRB1*12 lại alen làm giảm nguy mắc bệnh UTVMH với (OR = 0,335, p = 0,011) - Phát loại alen HLA-DQB1 loại alen HLADQA1 với alen có tần suất xuất cao HLA-DQB1*03 (44,7%), -DQB1*05 (21,4%) -DQB1*06 (17,9%); HLADQA1*01 (35,7%), -DQA1*03 (28,6%) -DQA1*06 (21,4%) 19 Tương tự, alen DQB1*03 alen làm giảm nguy mắc bệnh UTVMH với (OR = 0,367, p = 0,014) 4.4.4 Tần suất haplotype HLA xuất BN nghiên cứu - Tần suất haplotype A*02-B*15, A*24-B*46 A*11B*46; DRB1*08-DQB1*03, DRB1*15-DQB1*05 nhóm bệnh xuất cao so với nhóm chứng Ngược lại, số haplotype A*02-B*46 A*11-B*15; DRB1*09-DQB1*03, DRB1*12-DQB1*03 nhóm chứng lại xuất cao so với nhóm bệnh, nhiên khác biệt chưa có ý nghĩa 4.5 Giá trị đột biến gen LMP1 EBV tần suất alen HLA chẩn đoán bệnh UTVMH 4.5.1 Liên quan tỷ lệ đột biến đoạn 30 bp gen LMP1 EBV với giai đoạn bệnh, thể mô bệnh học tần suất alen HLA BN UTVMH nghiên cứu - Chưa tìm thấy khác biệt đột biến đoạn 30 bp gen LMP1 EBV với giai đoạn bệnh (p > 0,05) - Tỷ lệ đột biến đoạn 30 bp gen LMP1 EBV thể mô bệnh học ung thư tế bào biểu mơ khơng biệt hóa (85,7%) cao so với tỷ lệ đột biến thể ung thư tế bào biểu mơ gai khơng sừng hóa (64,3%) khác biệt có ý nghĩa thống kê, với p = 0,048 - Trong tất alen HLA xuất cao BN nghiên cứu, ghi nhận mối liên quan tỷ lệ đột biến đoạn 30 bp LMP1 EBV với tỷ lệ xuất alen HLA-B*15 BN UTVMH Người mang alen HLA-B*15 có nguy đột biến đoạn 30 bp LMP1 EBV cao gấp 4,6 lần so với người không mang alen (OR = 4,640, p = 0,018), cịn alen khác chưa thấy có khác biệt 20 4.5.2 Liên quan tần suất alen HLA với giai đoạn bệnh, thể mô bệnh học BN nghiên cứu - Trong tất alen HLA xuất BN nghiên cứu, chỉ có HLA-A*02 có khác biệt hai nhóm thể mơ bệnh học khơng biệt hóa khơng sừng hóa có ý nghĩa thống kê (p = 0,034), alen khác chưa thấy có khác biệt - Tương tự, tất alen HLA xuất BN nghiên cứu, chỉ có HLA-B*15 làm giảm 12,2% nguy mắc UTVMH giai đoạn muộn bệnh nhân nghiên cứu Sự xuất alen HLA-DQA1*03 yếu tố làm giảm 17,8% nguy mắc UTVMH giai đoạn muộn bệnh nhân nghiên cứu, alen khác chưa thấy có khác biệt 4.5.3 Độ nhạy, độ đặc hiệu số haplotype HLA chẩn đoán bệnh UTVMH: Các haplotype HLA có độ đặc hiệu cao với bệnh UTVMH A*11-B*46, A*24-B*46, DRB1*08-DQB1*03, DRB1*15-DQB1*05 A*02-B*46 21 Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN 5.1.1 Tỷ lệ diện gen đột biến gen LMP1 EBV mẫu mơ sinh thiết vịm BN UTVMH nghiên cứu - Tỷ lệ diện gen LMP1 EBV mẫu mơ sinh thiết vịm bệnh nhân UTVMH nghiên cứu 64,8% Mô sinh thiết tươi cho tỷ lệ diện gen LMP1 EBV cao (76,3%) so với mô sinh thiết vùi nến parafin Tỷ lệ diện gen thể mô ung thư tế bào biểu mơ khơng biệt hóa 68,3% - Tỷ lệ đột biến đoạn 30 bp gen LMP1 EBV mẫu mơ sinh thiết vịm BN UTVMH nghiên cứu kỹ thuật khuếch đại gen 72,9% Tỷ lệ đột biến đoạn 30 bp gen LMP1 EBV mẫu mơ sinh thiết vịm kỹ thuật giải trình tự 75,8%; có 24,2% mẫu mơ có biểu lộ gen LMP1 EBV khơng có đột biến đoạn 30 bp Vị trí đột biến đoạn 30 bp gen LMP1 EBV 168266 - 168295, mã hóa cho 10 acid amin 343-350 (vị trí TES2 CTAR2 phân tử LMP1 EBV) 5.1.2 Tần suất alen HLA BN UTVMH nghiên cứu - Đối với HLA lớp I: Tìm thấy loại alen HLA-A 16 loại alen HLA-B với tần suất alen HLA-A HLA-B xuất cao BN UTVMH nghiên cứu -A*02 (40,4%), -A*11 (21,2%), -A*24 (21,2%) -B*15 (25%), -B*46 (23,1%), B*38 (9,6%), -B*07 (7,7%) - Đối với HLA lớp II: + Tìm thấy 12 loại alen HLA-DRB1, loại alen HLA-DQB1 loại HLA-DQA1 với tần suất alen HLA-DRB1, HLA-DQB1 22 HLA-DQA1 xuất cao BN UTVMH nghiên cứu -DRB1*12 (17,3%) -DRB1*09 (13,8%); -DQB1*03 (44,7%), -DQB1*05 (21,4%) -DQB1*06 (17,9%); -DQA1*01 (35,7%), -DQA1*03 (28,6%) -DQA1*06 (21,4%) + Người mang alen -DRB1*08 có nguy mắc bệnh UTVMH cao gấp lần người bình thường (OR = 8,098, p < 0,05) Ngược lại, người mang alen -DRB1*12 (OR = 0,335, p < 0,05) -DQB1*03 (OR = 0,367, p < 0,05) nguy mắc bệnh lý UTVMH giảm cịn 33,5% 36,7% so với người khơng mang alen 5.1.3 Giá trị đột biến gen LMP1 EBV HLA chẩn đoán bệnh ung thư vòm mũi họng Bệnh viện Ung bướu Cần Thơ - Có mối liên quan đột biến đoạn 30 bp gen LMP1 EBV với thể mô bệnh học ung thư tế bào biểu mơ khơng biệt hóa UTVMH (p < 0,05) lại khơng có liên quan với xuất bệnh giai đoạn sớm hay muộn bệnh (p > 0,05) Người mang alen HLA-B*15 có nguy đột biến đoạn 30 bp LMP1 EBV cao gấp 4,6 lần so với người không mang alen - Tần suất alen HLA-A*02 xuất liên quan với thể mô bệnh học ung thư tế bào biểu mơ khơng biệt hóa (p < 0,05) Sự xuất alen HLA-B*15 HLA-DQA1*03 làm giảm 12,2% 17,8% nguy mắc UTVMH giai đoạn muộn bệnh nhân nghiên cứu - Một số haplotype HLA có độ đặc hiệu cao với bệnh UTVMH A*11 -B*46, A*24 - B*46, DRB1*08 - DQB1*03, DRB1*15 - DQB1*05 (98,33%) A*02 - B*46 (93,33%) 23 5.2 KIẾN NGHỊ - Cần tiếp tục nghiên cứu việc ứng dụng kỹ thuật khuếch đại gen LMP1 EBV điện di sản phẩm khuếch đại (230 bp, 200 bp) phát đột biến đoạn 30 bp BN nghi ngờ UTVMH, góp phần phát sớm bệnh UTVMH - Cần tiếp tục nghiên cứu kiểu đột biến khác đột biến đoạn 30 bp gen LMP1 EBV BN UTVMH thuộc vùng Đồng sông Cửu Long - Cần thực nghiên cứu với cở mẫu lớn sâu phân tích alen HLA liên quan đến vai trị trình diện nhóm định kháng nguyên (epitope) LMP1 EBV với alen HLA lớp I lớp II bệnh sinh học UTVMH TÀI LIỆU THAM KHẢO Bùi Diệu, 2011 Nghiên cứu số đặc điểm dịch tễ, lâm sàng ung thư vòm mũi họng bệnh viện K năm 2009 Tạp chí Y học thực hành (751)-Số 2/2011 24-27 Bùi Diệu, 2012 Ung thư vòm mũi họng Trong: Nguyễn Thị Xuyên (Chủ biên) Giới thiệu số bệnh ung thư thường gặp Hà Nội 31-47 Dardari, R., K Meriem, C Paulo, O Mohieddine, E Brahim, H Mohammad and J Menezes, 2006 High frequency of latent membrane protein-1 30-bp deletion variant with specific single mutaions in Epstein-Barr-associated nasopharyngeal carcinoma in Moroccan patients Int J Cancer, Vol 118 (8) 1977-1983 24 Hui, S.S., Y.Y Yap, W.K Yip and H.F Seow, 2008 EpsteinBarr virus latent membrane protein-1 (LMP-1) 30-bp delection and XhoI-loss is associated with type III nasopharyngeal carcinoma in Malaysia Word Journal of surgical oncology, Vol (18) 6-18 DOI:10.1186/14777819-6-18 Kang, M.S., E and E Kieff, 2015 Epstein-Barr Virus latent genes Experimental & Molecular Medicine, Vol 47: e131 1-16 DOI:10.1038/emm.2014.84 Nguyen-Van D, Enrberg I and Phan-Thi Phi P., 2008 Epstein Barr virus genetic variation in Vietnamese patinets with Nasopharyngeal carcinoma: full-length analysis of LMP Virus Genes Vol 37 (2) 273-281 Nurhantari, Y., N Emoto, P Rahayu and M Matsuo, 2003 Nasopharyngeal carcinoma in Indonesia has a low prevalence of the 30-base pair deletion of Epstein-Barr virus latent membrane protein Southeast Asia J Trop Med Public Health Vol 34 (1) 98-105 Phạm Thị Nguyệt Hằng, Phan Thị Phi Phi, Nguyễn Văn Đô, Bạch Khánh Hịa Trần Thị Chính, 2003 Tần suất đột biến đoạn gien LMP bệnh nhân ung thư vịm mũi họng Tạp chí nghiên cứu Y học, Bộ Y tế-Đại học Y Hà Nội, volume 23, số Phan Thị Phi Phi, 2007 Vai trò yếu tố di truyền đáp ứng miễn dịch Cơ chế chống virus hạt tế bào Tc gây độc Trong: Phan Thị Phi Phi (Chủ biên), Một 25 số vấn đề y sinh học cập nhật cho bác sĩ Nhà xuất Y học Hà Nội 151-193 Su, W.H., A Hildesheim and Y.S Chang, 2013 Human leukocyte antigens and Epstein-Barr Virus-association nasophagyngeal carcinoma: old association offer new clues into the role of immunity in infection-associated cancers Frontiers in oncology, Vol (299) 1-9 Tan, E.L., S.C Peh and C.K Sam, 2003 Analyses of EpsteinBarr virus latent membrane protein-1 in Malaysian from nasopharyngeal carcinoma: high prevalence of 30-bp deletion, Xho1 polymorphism and evidence of dual infections Journal of medical virology, Vol 69 251-257 Tang, Y.L., J.H Lu, L Cao, M.H Wu, S.P Peng, H.D Zhou, C Huang, Y.X Yang, Y.H Zhou, Q Chen, X.L Li, M Zhou and G.Y Li, 2008 Genetic variations of EBV-LMP from nasopharyngeal carcinoma biopsies: potential loss of T cell epitopes Brazilian Journal of Medicine and Biological Research, Vol 41 110-116 Trần Ngọc Dung, 2000 Nghiên cứu thông số miễn dịchsinh học giúp tiên lượng, phát triển sớm tái phát ung thư vòm họng kết hợp viên M sau xạ trị nhằm giảm tái phát Luận án tiến sĩ Y học Đại học Y Hà Nội Hà Nội Wang, R and X Wang, 2014 Association analysis between HLA-A, -B, -C-DRB1, and -DQB1 with nasopharyngeal carcinoma among a Han population in Northwestern China Human Immunology, Vol 75 (3) 197-202 26 Yu, K.J., X Gao, C.J Chen, X Yang, S.R Diehl, A Goldstein, W.L Hsu, X Liang, D Marti, M.Y Liu J.Y Chen, M Carrington and A Hildesheim, 2009 Association of human leukocyte antigen (HLA) with nasopharyngeal carcinoma (NPC) in high-risk multiplex families in Taiwan Hum Immunol, Vol 70 (11) 910-914 Zhang, M., Y.S Zong, J.H He, S.X Lin, B.L Zhong and Y.J Liang, 2004 Comparison of Epstein-Barr virus infection of 30 bp-deleted gene among four histological types of nasopharyngeal carcinoma Chinese medical journal, Vol 117 (4) 608-611 Zhang, X.S., K.H Song, H.Q Mai, W.H Jia, B.J Feng, J.C Xia, R.H Zhang, L.X Huang, X.J Yu, Q.S Feng, P Huang, J.J Chen and Y.X Zeng, 2002 The 30-deletion variant: a polymorphism of latent membrane protein prevalent in endemic and non-endemic areas of nasopharyngeal carcinomas in China Cancer letters, Vol 176 65-73 27 ... lệ biểu lộ đột biến gen LMP1 Virus Epstein- Barr HLA bệnh nhân ung thư vòm mũi họng Thành phố Cần Thơ? ?? thực 1.2 Mục tiêu đề tài (1) Xác định tỷ lệ diện đột biến gen LMP1 virus Epstein- Barr (2)... Giá trị đột biến gen LMP1 EBV HLA chẩn đốn bệnh ung thư vịm mũi họng Bệnh viện Ung bướu Cần Thơ - Có mối liên quan đột biến đoạn 30 bp gen LMP1 EBV với thể mô bệnh học ung thư tế bào biểu mô... Hồng Của, Trần Ngọc Dung, Trần Văn Bé Năm, Phan Thị Phi Phi 2018 Xác định tỷ lệ biểu lộ gen LMP1 EBV mẫu sinh thiết tươi bệnh nhân ung thư vòm mũi họng Bệnh viện Ung Bướu thành phố Cần Thơ Tạp