Ghép thực nghiệm mảnh san hô mang nguyên bào xương để tái tạo khuyết hổng xương: Mô hình thực nghiệm trên thỏ

Đề tài này với mục đích sử dụng san hô porites lutea để mang các tế bào gốc được thu nhận từ tủy xương thỏ và kích thích biệt hóa các tế bào gốc này thành các nguyên bào xương để tạo ra vật liệu sinh học dùng để ghép thay xương không những là một giá thể để thay thế cấu trúc xương mà còn bổ sung thêm yếu tố tế bào để giúp quá trình liền xương diễn ra nhanh hơn và chất lượng lành xương hiệu quả hơn.

Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số * 2013 Nghiên cứu Y học GHÉP THỰC NGHIỆM MẢNH SAN HÔ MANG NGUYÊN BÀO XƯƠNG ðỂ TÁI TẠO KHUYẾT HỔNG XƯƠNG: MƠ HÌNH THỰC NGHIỆM TRÊN THỎ Huỳnh Duy Thảo*, Ciro Gargiulo**, Trần Thị Thanh Thủy*, Nguyễn Khánh Hòa*, Lê Thanh Hùng***, Trần Cơng Toại* TĨMTẮT ðặt vấn đề: Nhu cầu ghép xương để điều trị cho khuyết hõng xương lớn bệnh lý tai nạn lao động ngày tăng cao số lượng mô xương ghép lại hạn chế, không cung cấp đủ nhu cầu cho người bệnh Từ đó, nhóm chúng tơi nghiên cứu đề tài với mục đích sử dụng san hô Porites lutea để mang tế bào gốc thu nhận từ tủy xương thỏ kích thích biệt hóa tế bào gốc thành nguyên bào xương để tạo vật liệu sinh học dùng để ghép thay xương giá thể để thay cấu trúc xương mà bổ sung thêm yếu tố tế bào để giúp trình liền xương diễn nhanh chất lượng lành xương hiệu ðối tượng phương pháp nghiên cứu: Thỏ chia làm hai nhóm nghiên cứu Một nhóm ghép san hơ có mang ngun bào xương có ghép san hơ (mẫu đối chứng) Kết ghép đánh giá hình ảnh học (X-Quang) nhuộm mô học H&E Kết quả: Kết nghiên cứu cho thấy nhóm ghép san hơ có mang ngun bào xương trình liền xương xảy nhanh chất lượng lành xương tốt so với nhóm đối chứng Kết luận: Với kết đạt mơ hình nghiên cứu tốt có bước tiến hành nghiên cứu người Từ khóa: Tế bào gốc trung mơ, tủy xương thỏ, giá thể san hô, khuyết hổng xương ABSTRACT RABBIT MODEL OSTEOBLAST FROM BONE MARROW CULTURE AND DIFFERENTIATE ON CORAL AUTOGRAFT FOR BONE DEFECTED Huynh Duy Thao, Ciro Gargiulo, Tran Thi Thanh Thuy, Nguyen Khanh Hoa, Le Thanh Hung, Tran Cong Toai * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 17 - No - 2013: - 15 Introduction: Demand bone graft for the treatment of large bone defects due to pathology or accident are increasing but the amount of bone grafts are limited, not supply the needs of the patient Since then, Our group studied the subject for the purpose of using coral Porites lutea to bring stem cells derived from rabbit bone marrow and stimulates the differentiation of this stem cell into osteoblasts to produce biomaterial used for bone graft replacement not only a scaffold to replace the bone structure but also have brought cells to help the bone healing process takes place faster and more effective healing of bone quality Materials and methods: Rabbits were divided into two groups A group of coral transplants bring osteoblasts and only coral transplantation (control samples) Results of transplantation was assessed by imaging (X-ray) and histological staining H & E * Bộ môn Mô-Phôi-Di truyền, ðH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch ** University of Western Autralia School of Anatomy and Human Biology, Perth, Australia *** Khoa Răng-Hàm-Mặt, ðH Y Dược TP.HCM Tác giả liên lạc: BS Lê Thanh Hùng, ĐT: 0918.686.151, Email: ranghammat@gmail.com Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số * 2013 Results: Research results showed that coral transplantation group brings osteoblasts, the bone healing process occurs faster and the quality of bone healing is better than the control group Conclusion: With the results obtained, this will be a good research model when conducting research on human Keywords: Mesenchymal Stem Cells, Rabbit Bone Marrow, Coral Scaffold, Bone Defect ðẶTVẤNĐỀ ðỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Mơ xương có khả tự lành trường hợp khuyết xương nhỏ Tuy nhiên, trường hợp xương dẫn đến khuyết hụt xương lớn tai nạn bệnh lý mơ xương khơng có khả tự sửa chửa ðể điều trị hiệu trường hợp phải tiến hành ghép xương để lắp đầy chổ hổng khuyết(17) Xương ghép thu từ thể người bệnh (ghép xương tự thân) từ người hiến (ghép xương đồng loại) có nguồn gốc khơng phải từ người (ghép xương dị loại) Thỏ Có nhiều loại vật liệu thay xương có nguồn gốc từ kim loại, gốm, sứ, loại polymer sinh học tổng hợp Bên cạnh đó, để cải thiện chất lượng mảnh ghép nhà nghiên cứu tạo mảnh ghép có mang tế bào xương hay tế bào tiền thân tạo xương để tạo mô ghép xương vừa có đặc tính học mơ xương vừa mang tế bào để giúp trình tái tạo sửa chữa mơ xương diễn nhanh chóng hiệu hơn(3,7,9) Do đó, chúng tơi tiến hành nghiên cứu sử dụng san hô Porites lutea để sử dụng làm giá thể ghép có mang nguyên bào xương thu từ tế bào gốc tủy xương tạo mơ hình thực nghiệm ghép xương sử dụng giá thể san hô mang nguyên bào xương tự thân đối tượng thỏ để thay khuyết hổng xương tạo thân xương đùi(1,2,3,4,8,9,11,12,15,17) Từ đó, nghiên cứu hồn thiện quy trình ghép mảnh san hơ thay xương thỏ để làm sở cho bước tiến hành nghiên cứu người nghiên cứu nhóm chúng tơi 10 Thỏ sử dụng nghiên cứu loại thỏ nâu, thu từ trang trại Việt Nam Thỏ nhóm nghiên cứu thỏ đực, khỏe mạnh, lượng từ 2,0 - 2,5 kg ðược ni chăm sóc điều kiện nuôi nhốt Thu nhận tủy xương Thỏ tiến hành gây mê Zoletil 50 (VIRBAC Lboratories, France) Sau đó, cắt lơng phần đầu khớp xương gối, sử dụng Betadine (Zuellig Pharma) để sát trùng vùng lấy tủy Sử dụng bơm đầu kim 18G (Vihanmedico, HN, VN) để chọc hút dịch tủy Mỗi lần thu nhận khoảng 2ml dịch tủy xương Sau cho nhanh vào tube 15ml vô trùng (Corning, USA) chuyển nhanh phòng thí nghiệm Tất thao tác tiến hành Trung tâm phẫu thuật thực nghiệm, ðH Y Dược TP HCM, bước tiến hành đảm bảo tối đa yêu cầu vô trùng Phân lập tế bào gốc Tế bào gốc thu nhận theo phương pháp lắng dựa vào tỉ trọng dung dịch FicollHypaque (Amersham, Germany) Tủy xương pha loãng với dung dịch PBS (Gibco, USA) theo tỉ lệ 1:2 (1 tủy xương: PBS, v/v) Sau đó, đặt hỗn hợp dịch tủy xương lớp dịch Ficoll theo tỉ lệ 1:2 (1 dịch tủy xương: Ficoll, v/v) Tiến hành quay ly tâm với tốc độ 2000 vòng/phút 20 phút Thu nhận lớp tế bào đơn nhân nằm lớp Ficoll lớp huyết tương Nuôi cấy tế bào với mật độ khoảng 105 tế bào/ml vào chai cấy 25 cm2 (Nunc, Wiesbaden, Germany) đem ủ tủ ủ ấm nhiệt độ 370C, 5% CO2 Sau ngày thay mơi trường Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số * 2013 Nghiên cứu Y học Biệt hóa tế bào gốc thu từ tủy xương thành nguyên bào xương hóa tế bào gốc thành nguyên bào xương tiến hành nhuộm alkaline phosphatase Biệt hóa thành nguyên bào xương hỗn hợp môi trường cảm ứng tạo xương gồm DMEM/F12, 10% FBS, Dexamethasone 10-8M (Sigma), 10 mM/ml β-Glycerol phosphate (Sigma), 50 ng/ml Acid ascorbic (Sigma), 10ng/ml FGF-9 (Sigma), 10-7M Vitamin D2 (MekomPharma, HCM City, VN) Pen/strep (100UI/0,1mg/ml) Môi trường cảm ứng tạo xương thay ngày Sau khoảng thời gian nuôi từ 14-21 ngày tiến hành xác định tế bào sau biệt hóa phương pháp nhuộm mơ học Alizarin Red, Von kossa alkaline phosphatase Ghép thực nghiệm in vivo mảnh san hô mang nguyên bào xương tự thân thỏ Chuyển tế bào gốc lên giá thể san hô San hô sử dụng nghiên cứu lồi Porites lutea lấy từ Phòng thí nghiệm Vật liệu sinh học, Bộ môn Mô-Phôi-Di truyền, Trường ðại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch San hô thu nhận, xử lý vơ trùng theo quy trình phòng thí nghiệm vật liệu sinh học để tạo giá thể dùng để mang tế bào gốc thu nhận từ tủy xương thỏ Tế bào gốc chuyển lên giá thể san hơ có kích thước 0,5 x 0,5 x 0,5 cm với mật độ tế bào x 105 tế bào/ml Tế bào chuyển lên giá thể san hô dựa vào phương pháp ly tâm Mảnh san hô sau quay ly tâm đặt vào chai nuôi, bổ sung môi trường DMEM/F12, 10%FBS, kháng sinh ủ 370C, 5% CO2 Sau ngày nuôi tiến hành thay môi trường nuôi môi trường cảm ứng tạo xương Tiếp theo thay môi trường nuôi ngày Đánh giá phát triển biệt hóa tế bào giá thể san hơ ðể đánh giá khả phát triển, tăng trưởng biệt hóa tế bào gốc thành nguyên bào xương giá thể san hô Tiến hành nhuộm mô học H&E, chụp SEM để khảo sát phát triển, bám dính tế bào vùng bề mặt khối san hô ðể đánh giá khả biệt Từ kết nghiên cứu in vitro, tiến hành lấy tủy xương thỏ, ni cấy biệt hóa tế bào gốc tủy xương thành nguyên bào xương giá thể san hơ Sau đó, tiến hành phẫu thuật ghép tự thân mẫu san hô trở lại cho thỏ Thí nghiệm chia làm hai nhóm: Nhóm 1: ghép tự thân nguyên bào xương thỏ giá thể san hơ Nhóm 2: ghép san hơ thỏ Thỏ theo dõi thời điểm 1, tháng Tại mốc thời gian này, thỏ đánh giá hình ảnh học (chụp X-Quang) thu nhận mẫu mơ để làm mơ học H&E Thí nghiệm lặp lại lần KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Kết nuôi cấy tế bào gốc tủy xương thỏ Kết cho thấy, tế bào bám dính, có hình dạng giống với ngun bào sợi, tế bào có hình dạng thon dài, hình thoi, bầu dục (Hình 1) Khả biệt hóa in vitro tế bào gốc tủy xương thành nguyên bào xương Các tế bào gốc từ tủy xương thỏ biệt hóa thành nguyên bào xương Sau khoảng thời gian nuôi cấy từ 14-21 ngày, đánh giá tế bào sau biệt hóa nguyên bào xương phương pháp nhuộm mô học Alirazin Red, Von kossa đánh giá biểu enzyme alkaline phosphatase(10,13,15,16) Từ kết nhuộm cho thấy biệt hóa thành nguyên bào xương in vitro Khả biệt hóa, bám dính phát triển tế bào giá thể san hô Kết nhuộm Giemsa H&E Mẫu san hô mang nguyên bào xương xử 11 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số * 2013 Nghiên cứu Y học lý dung dịch cố định (Neutral Buffer Formalin 10%-NBF 10%) nhuộm với thuốc nhuộm Giemsa H&E (Hình 2) B A C Hình 1: Kết ni cấy tế bào gốc thu nhận từ tủy xương thỏ (A) Sau ngày nuôi(10X) (B) Sau tuần nuôi cấy(10X) (C) Tế bào nhuộm Giemsa sau tuần nuôi cấy A B Hình 2: Nhuộm Giemsa H&E cho tế bào gốc tủy xương nuôi khối san hô (A) Hình chụp khối san hơ nhuộm H&E (B) Hình chụp khối san hô nhuộm Giemsa hồng, hoạt động enzyme alkaline phosphatase (Hình 3) Kết đánh giá biểu enzyme alkaline phosphatase Nhuộm khối san hô với thuốc nhuộm Fast Red violet LB salt (sigma), tế bào gốc trung mơ (MSC) biệt hóa thành nguyên bào xương tế bào phản ứng lại với thuốc nhuộm bào tương xuất màu Các tế bào hoàn tồn biệt hóa thành ngun bào xương sau thời gian ni cấy kích thích biệt hóa thành ngun bào xương với mơi trường biệt hóa phù hợp A B Hình 3: Mảnh san hơ mang ngun bào xương nhuộm Fast Red Violet LB salt (A) Tế bào gốc tủy xương thỏ biệt hóa thành nguyên bào xương khối san hô nhuộm alkaline phosphatase (4X) (B) Nguyên bào xương bắt màu hồng đậm hoạt tính enzyme alkaline phosphatase phản ứng với thuốc nhuộm Fast Red Violet LB salt (10X) 12 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số * 2013 ðánh giá dựa vào hình ảnh học (X-Quang) Nhóm 1: Thỏ ghép san hơ có mang ngun bào xương tự thân Kết ghép san hơ có mang ngun bào xương tự thân theo thời gian 1, tháng đánh giá hình ảnh học (X-Quang) mơ học H&E Nghiên cứu Y học Kết ghép san hô theo thời gian 1, tháng đánh giá hình ảnh học (XQuang) mơ học H&E Dựa vào kết chụp X-Quang cho thấy, tuần sau ghép chưa có cal xương Sau tuần ghép, kết X-Quang cho thấy, bắt đầu có cal xương Kết chụp X-Quang cho thấy, tuần sau ghép chưa thấy cal xương vào mảnh ghép Sau tuần ghép, trình lành xương diễn tốt, san hô bị thay dần Sau tuần ghép, kết X-Quang cho thấy bắt đầu có cal xương Sau 12 tuần, nơi khối san hô ghép thay dần xương chủ Sau tuần ghép, trình lành xương diễn có cal xương Sau 18 tuần ghép, thay chưa hoàn toàn kết thúc Sau 12 tuần, nơi khối san hô ghép bắt đầu diễn trình thay xương chủ gần hồn tồn Sau 24 tuần ghép Mảnh san hơ ghép thay dần thành màng xương mô xương chủ Sau 18 tuần ghép, thấy san hơ Sau 24 tuần ghép Vị trí nơi ghép hồn tồn thay mơ xương chủ Nhóm 2: Thỏ ghép san hô (mẫu đối chứng) ðánh giá dựa vào cấu trúc mơ học Nhóm 1: Thỏ ghép san hơ có mang ngun bào xương tự thân Kết ghép san hơ có mang ngun bào xương tự thân theo thời gian 1, tháng đánh giá nhuộm mơ học H&E (Hình 4) A B C D Hình 4: Kết đánh giá hình ảnh nhuộm H&E thỏ ghép san hơ có mang nguyên bào xương tự thân (A) Kết ghép sau tháng (B) Kết ghép sau tháng (C) Kết ghép sau tháng (D) Kết ghép sau tháng tạo xương khối san hô diễn khắp Một tháng sau ghép mẫu san hơ có mang khối san hơ (xảy hai đầu xương nơi tiếp giáp nguyên bào xương thỏ tự thân, mạch máu xâm với mảnh ghép san hô khối san hô) nhập vào bên khối san hơ, q trình hủy 13 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số * 2013 Nghiên cứu Y học Ba tháng sau ghép, bắt đầu xuất bè xương nơi khối san hô ghép với xâm nhập mạch máu tân tạo Các bè xương tạo khối san hơ ghép Năm tháng sau ghép, bè xương ngày tạo nhiều hơn, bè xương to trình lắng đọng tích tụ chất xương Các bè xương thay gần hoàn toàn mảnh ghép san hô Sáu tháng sau ghép, mảnh san hô thay hoàn toàn thành xương tự thân, bè xương to, có tế bào xương nằm bên bè xương nguyên bào xương bám bề mặt bè xương Các bè xương có khuynh hướng kết tụ vào để tạo màng xương thân xương đùi (do trình điều chỉnh xương) Nhóm 2: Thỏ ghép san hơ đối chứng Kết ghép san hô đối chứng theo thời gian 1, tháng đánh giá nhuộm mơ học H&E (Hình 5) A B C D Hình 5: Kết đánh giá hình ảnh nhuộm H&E thỏ ghép san hô đối chứng (A) Kết ghép sau tháng (B) Kết ghép sau tháng (C) Kết ghép sau tháng (D) Kết ghép sau tháng nhập mạch máu tân tạo Các bè xương Một tháng sau ghép mẫu san hơ đối tạo khối san hơ ghép Tuy nhiên, chứng, mạch máu bắt đầu xâm nhập vào bên khơng có nhiều bè xương thay khối san hô, nhiên, nhận khối san hơ Q trình hủy tạo xương thấy có mạch máu tân tạo xuất bên diễn tốt nơi tiếp xúc khối san khối san hô Cấu trúc chất hơ phần đầu xương khống mẫu san hơ còn, q trình hủy tạo xương diễn khối san hô tốt hai bên đầu xương, nơi tiếp xúc khối san hô phần thân xương ghép Ba tháng sau ghép, bắt đầu xuất bè xương nơi khối san hô ghép với xâm 14 Năm tháng sau ghép, bè xương ngày tạo nhiều hơn, mạch máu bắt đầu xâm nhập vào khối san hô nhiều Các bè xương thay dần khối san hô, bè xương ngày to Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số * 2013 Sáu tháng sau ghép, mảnh san hô thay gần hoàn toàn thành xương tự thân, bè xương to, có tế bào xương nằm bên bè xương nguyên bào xương bám bề mặt bè xương Tuy nhiên, bè xương chưa kết dính lắng đọng chất xương với để tạo thành màng xương hoàn chỉnh thân xương Nghiên cứu Y học KẾTLUẬN Kết ghép mẫu san hơ có mang tế bào thời gian liền xương chất lượng lành xương tốt nhanh so với nhóm chứng (chỉ ghép san hơ) ðối với mẫu san hơ có mang tế bào, sau ghép mạch máu nhanh chóng xâm nhập vào bên khối san hơ q trình hủy san hơ thay xương diễn theo nhiều hướng, khắp bề mặt bên khối san hô Trong đó, mẫu san hơ đối chứng có mạch máu xâm nhập vào khối san hô trình thay xương diễn nhanh phần hai đầu mép san hơ so với phần lại khối san hô TÀILIỆUTHAMKHẢO Chen F et al (2002), Bone graft in the shape of human mandibular condyle reconstruction via seeding marrowderived osteoblast into porous coral in a nude mice model, Journal of Oral and Maxillofacial Surgery, 60: 1155-1159 Chen F et al (2004), Marrow derived osteoblasts seeded into porous natural coral to prefabricate a vascularized bone graft in the shape of human mandibular ramus: experimental study in rabbits, Journal of Oral and Maxillofacial Surgery, 42: 532537 Chen F et al (2007), Segmental bone tissue engineering by seeding osteoblast precursor cells into titaniummesh-coral composites scaffolds, Journal of Oral and Maxillofacial Surgery, 36: 822-827 Chun Y et al (2009), A comparative study of the physical and mechanical properties of three natural corals based on the criteria for bone-tissue engineering scaffold, J Mater Sci Mater Med, 20: 1273-1280 Deans R (2009), Bringing mesenchymal stem cells into the clinic, Emerging technology platforms for stem cells, John Wiley & Sons, Canada, 25: 463-483 10 11 12 13 14 15 16 17 Deepak M Gupta, Nicholas J Panetta, and Michael T Longaker (2011), Osteogenic differentiation of human multipotent mesenchymal stromal cells, Mesenchymal Stem Cell Assays and Applications, Humana Press, UK, 16: 201-215 Gregory CA (2008), Mesenchymal stem cells: from culture to clinic, Stem Cell Repair and Regeneration, Imperial College Press, Singapore, 2: 21-45 Guigui P, Plais PY, Flautre B, Viguier E, Blary MC, Chopin D, Lavaste F, Hardouin P (1994), Experimental model of posteriolateral spinal arthrodesis in sheep Application of the model: evaluation of vertebral fasion obtained with coral (porities) or with biphasic ceramic (friosite), Spine, 19(24): 2793-2803 Holmes RE (1979), Bone regenaration within a coralline hydroxyapatite implant, Plastic and Reconstructive Surgery, 63:626-633 Major AK, Boehm CA, Nitto H, Midura RJ, Muschler GF (1997), Characterization of human bone marrow stromal cells with respect to osteoblastic differentiation, J Orthop Research, 15(4): 546-577 Marchac D, Sandor G (1994), Use of coral granules in the craniofacial skeleton, Journal of Craniofacial Surgery, 5(4): 213217 Nguyễn Trí Dũng, Trịnh ðình Vũ Linh (2004), Khảo sát diễn biến lành xương vết thương thực nghiệm nhỏ xương hàm có dung san hơ Porites lutea Tạp chí Y học TP.HCM, 8(1): 28-32 Rickard DJ, Kassem M, Hefferan T.E, Srkan G, Spelsbergm TC, Riggs BL (1996), Isolation and characterization of osteoblast precursor cells from human bone marrow, Journal Bone and Mineral Research, 11(3):312-24 Trần Công Toại, Cao Thỉ (2009), Cấy tủy xương để đánh giá số lương tế bào gốc trung mô thông qua đơn vị tạo khúm nguyên bào sợi (CFU-FS), Y học Tp HCM, 13(1): 488-490 Tran Cong Toai, Ciro Gargiulo, Huynh Duy Thao, Tran Thi Thanh Thuy, Huynh Minh Tuan, and Luis Filgueira, et al (2011), Culture and differentiation of osteoblasts on coral scaffold from human bone marrow mesenchymal stem cells, Cell and Tissue Banking, 12(4): 247-261 Tran Cong Toai, Huynh Duy Thao, Nguyen Phuong Thao, Ciro Gargiulo and Phan Kim Ngoc, et al (2010), In vitro culture and differentiation of osteoblasts from human umbilical cord blood, Cell and Tissue Banking, 11 (3): 269-280 Trần Cơng Toại, Trương ðình Kiệt (2003), Nghiên cứu sử dụng san hô vùng biển Việt Nam làm vật liệu sinh học thay xương y học, Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu Khoa học Công nghệ, Sở Khoa học-Công nghệ TP.HCM Ngày nhận bài: 15/1/2013 Ngày phản biện đánh giá báo: 20/1/2013 Ngày báo đăng: 31/01/2013 15 ... sử dụng san hô Porites lutea để sử dụng làm giá thể ghép có mang nguyên bào xương thu từ tế bào gốc tủy xương tạo mơ hình thực nghiệm ghép xương sử dụng giá thể san hô mang nguyên bào xương tự... tháng tạo xương khối san hô diễn khắp Một tháng sau ghép mẫu san hô có mang khối san hơ (xảy hai đầu xương nơi tiếp giáp nguyên bào xương thỏ tự thân, mạch máu xâm với mảnh ghép san hô khối san hô) ... xương chủ Nhóm 2: Thỏ ghép san hô (mẫu đối chứng) ðánh giá dựa vào cấu trúc mơ học Nhóm 1: Thỏ ghép san hơ có mang nguyên bào xương tự thân Kết ghép san hơ có mang ngun bào xương tự thân theo