Đang tải... (xem toàn văn)
Luận án được nghiên cứu với mục tiêu nhằm xác định được vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá mú tại Việt Nam và một số đặc tính sinh học của vi rút gây bệnh. Tạo được kháng nguyên tái tổ hợp và đánh giá khả năng kích thích sinh miễn dịch của kháng nguyên để làm nguyên liệu phục vụ sản xuất vắcxin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú.
e K., Nishizawa T., Yoshimuzu M (2000), “Selection of broodstock candidates of barfin flounder using an ELISA system with recombinant protein of barfin flounder nervous necrosis virus”, Dis Aqua Org.41, 219–223 69 Yamashita H., Mori K., Kuroda A., Nakai T (2009), “Neutralizing antibody levels for protection against betanodavirus infection in sevenband grouper, Epinephelus septemfasciatus (Thunberg), immunized with an inactivated virus vaccine”, J Fish Dis 32(9):767–75 70 Yuasa K., Koesharyani I., Roza D., Mori K., Katata M., Nakai T (2002), “Immune response of humpback grouper Cromileptes altivelis, injected with the recombinant coat protein of betanodavirus”, J Fish Dis 25: 53–56 71 Zafran HT., Yuasa K., Hatai K (2001), “Viral nervos necrosis in humpback grouper Chromileptes altivelis larvae and Juveniles”, Fish Pathol 35, 95–96 TÀI LIỆU WEBSITE 72 http://m.vasep.com.vn/Tin-Tuc/1025_49048/Nuoi-bien-Huong-di-quantrong-cho-nganh-thuy-san.htm 73 https://nongnghiep.vn/quang-ngai-nhan-rong-mo-hinh-nuoi-ca-mu-tronglong-post209956.html 74 https://baotintuc.vn/kinh-te/phat-trien-nghe-nuoi-ca-long-be-tren-bien20180221091402318.htm PHỤ LỤC Phụ lục 1: Đặc điểm mẫu bệnh phẩm STT Ký hiệu mẫu Mắt Não Biểu lâm sàng Gen T4 QN1 - - AB - QN2 ++++ +++ ABCD + QN3 - - AB - QN4 ++++ +++ ABCD + QN5 - - AB - QN6 - - AB - QN7 +++ ++ ABCD - QN8 - - AB - HP1 - - AB - 10 HP2 ++ + AB + 11 HP3 - - AB - 12 HP4 +++ +++ ABCD + 13 HP5 +++ +++ ABCD - 14 HP6 - - AB + 15 HP7 - - AB + 16 HP8 +++ +++ ABCD + 17 HP9 - - AB - 18 HP10 + - AB + 19 HP11 - - AB + 20 NĐ1 +++ +++ ABCD + 21 NĐ2 - - AB - 22 NĐ3 + - AB + 23 NĐ4 +++ +++ ABCD + 24 NĐ5 +++ +++ ABCD + 25 NĐ6 - - AB - 26 NĐ7 + - AB + 27 NĐ8 + - AB + 28 NĐ9 - - AB - 29 NĐ10 +++ +++ ABCD + 30 NĐ11 +++ +++ ABCD + 31 KH1 - - AB - 32 KH2 - - AB - 33 KH3 - - AB - 34 KH4 +++ ++ ABCD + 35 KH +++ +++ ABCD + 36 KH6 + - AB - 37 KH7 - - AB - 38 KH8 - - AB - 39 KH9 + - AB + 40 BT1 + - AB - 41 BT2 +++ +++ ABCD + 42 BT3 - - AB + 43 BT4 +++ +++ ABCD + 44 BT5 - - AB - 45 BT6 - - AB - 46 BT7 + - AB + 47 BT8 - - AB - 48 BT9 +++ +++ ABCD + 49 BT10 - - AB + 50 BT11 - - AB - 51 BT12 +++ ++ ABCD + Ghi chú: A: Bỏ ăn B: Bơi tách đàn, màu sắc thể đen tối C: Mắt lồi, bóng căng, ruột chứa dịch D: Bơi ngửa, bơi xoay tròn, có tượng chết (-): Khơng có CPE mơ não, mơ mắt; khơng có gen T4 (+): Có gen T4 (++): CPE > 50% (+++): CPE > 85% (++++): CPE > 98%, có tượng tan bào Phụ lục 2: Một số phương pháp sử dụng luận án Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) Phản ứng RT-PCR phản ứng khuếch đại đoạn khuôn mẫu RNA theo nguyên lý PCR, bao gồm giai đoạn: Giai đoạn thứ nhất: Phiên mã ngược khuôn mẫu RNA thành sợi cDNA, sau dùng sợi làm khuôn mẫu để tổng hợp sợi DNA Giai đoạn thứ hai: Dùng sợi đôi làm khuôn mẫu để thực phản ứng Đối với NNV, kĩ thuật RT-PCR bao gồm giai đoạn: giai đoạn phiên mã ngược từ mạch khuôn RNA NNV để tạo cDNA giai đoạn khuếch đại đoạn cDNA tạo nên số cần thiết Để khuếch đại trình tự T4 RNA-2 dài 421 bp E fuscogutatus E.akaara, dựa trình tự GenBank chúng tơi thiết kế cặp mồi gồm: P1 (5’-CGTGTCAGTCATGTGTCGCT-3’) P2 (3’-AGAAGTGGGCACAACTGAGC-5’) Thành phần phản ứng Thành phần phản ứng Thể tích (µl) RT-PCR buffer 10 Q- solution 10 dNTP Enzyme DNA-polymerase Mồi: P1-P2 0,6 RNA temperlate RNase- free water 19,8 Tổng 50 Chu trình nhiệt RT: 50ºC/ 30phút PCR: Biến tính 95ºC/ 15phút - 94ºC/ 30s - 60ºC/30s - 72ºC/ 1p - 72º C/ 5p 30 cycle Phương pháp điện di gel agarose Theo phương pháp Sambrook J, Russel DW (2001) + Cân 0,2 gam agarose đun nóng chảy bổ sung 1µl EtBr đổ vào khn gel lắp sẵn lược để tạo giếng nhỏ, khoảng 20-30 phút sau gel nguội hoàn toàn rút lược đặt vào bể điện di chứa sẵn đệm TAE 1X, cho đệm ngập hoàn toàn gel + Tra mẫu: lấy thể tích mẫu thích hợp (chứa khoảng 1-2μg DNA), trộn với loading (giúp tạo màu dễ quan sát giúp cho phân tử DNA lắng xuống trình điện di) sau tra vào giếng gel + Chạy điện di hiệu điện 110V, thời gian 20-30 phút + Sau lấy gel tráng qua nước quan sát chụp ảnh ánh sáng tia tử ngoại có bước sóng λ=260nm Phương pháp tinh DNA gel agarose Plasmid tái tổ hợp sau phản ứng cắt enzym giới hạn tiến hành tinh theo PureLink® Quick Gel Extraction Kit có TOPO® TA Cloning Kit hãng Invitrogen với bước sau: Cắt phần gel agarose có chứa đoạn DNA mong muốn Cân lát gel hòa tan với dịch đệm (GS1) có kit với tỉ lệ 10: 60 (mg/ µl) ống vơ trùng 5ml Ủ 50°C 15 phút, phút lại lắc để gel agarose tan chảy hết Làm tan gel với dung dịch đệm TE 65°C- 75°C Hút 400µl hỗn hợp dịch agarose vào cột lọc Bổ sung 500 µl Gel Solubilization Buffer (GS1) vào cột, trộn ủ nhiệt độ phòng , ly tâm 12.000 vòng/phút phút, loại bỏ dịch phía Bổ sung 700 µl washing buffer vào cột ủ nhiệt độ phòng phút Ly tâm 12.000 vòng/phút vòng phút, đổ bỏ dịch, chuyển cột tinh sang eppendorf 1,5 ml Bổ sung 50 µl TE buffer (65-70°C) vào cột, ủ nhiệt độ phòng phút 10 Ly tâm 12.000 vòng/phút phút, loại bỏ cột tinh sạch, thu hồi eppendorf chứa DNA tinh sạch, bảo quản -20°C Phụ lục 3: Kết so sánh mức độ đồng trình tự đoạn gen T4 với trình tự GenBank ... + Sau lấy gel tráng qua nước quan sát chụp ảnh ánh sáng tia tử ngoại có bước sóng λ=260nm Phương pháp tinh DNA gel agarose Plasmid tái tổ hợp sau phản ứng cắt enzym giới hạn tiến hành tinh theo... nóng chảy bổ sung 1µl EtBr đổ vào khn gel lắp sẵn lược để tạo giếng nhỏ, khoảng 20-30 phút sau gel nguội hồn tồn rút lược đặt vào bể điện di chứa sẵn đệm TAE 1X, cho đệm ngập hoàn toàn gel + Tra... Tra mẫu: lấy thể tích mẫu thích hợp (chứa khoảng 1-2μg DNA), trộn với loading (giúp tạo màu dễ quan sát giúp cho phân tử DNA lắng xuống q trình điện di) sau tra vào giếng gel + Chạy điện di hiệu