Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi rút gây hoại tử thần kinh và tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắcxin phòng bệnh cho cá mú (Epinephelus spp (Luận án tiến sĩ)

Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi rút gây hoại tử thần kinh và tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắcxin phòng bệnh cho cá mú (Epinephelus spp.Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi rút gây hoại tử thần kinh và tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắcxin phòng bệnh cho cá mú (Epinephelus spp.Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi rút gây hoại tử thần kinh và tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắcxin phòng bệnh cho cá mú (Epinephelus spp.Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi rút gây hoại tử thần kinh và tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắcxin phòng bệnh cho cá mú (Epinephelus spp.Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi rút gây hoại tử thần kinh và tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắcxin phòng bệnh cho cá mú (Epinephelus spp.Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi rút gây hoại tử thần kinh và tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắcxin phòng bệnh cho cá mú (Epinephelus spp.Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi rút gây hoại tử thần kinh và tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắcxin phòng bệnh cho cá mú (Epinephelus spp.Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi rút gây hoại tử thần kinh và tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắcxin phòng bệnh cho cá mú (Epinephelus spp.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM  - NGUYỄN THỊ THANH NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI RÚT GÂY HOẠI TỬ THẦN KINH VÀ TẠO KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT VẮC- XIN PHÒNG BỆNH CHO CÁ MÚ (Epinephelus spp.) LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Hà Nội, năm 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM  - NGUYỄN THỊ THANH NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI RÚT GÂY HOẠI TỬ THẦN KINH VÀ TẠO KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT VẮC-XIN PHÒNG BỆNH CHO CÁ MÚ (Epinephelus spp.) Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Phạm Công Hoạt PGS.TS Lê Văn Năm Hà Nội, năm 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi thực Toàn số liệu kết nghiên cứu luận án trung thực chưa sử dụng để cơng bố cơng trình nghiên cứu để nhận học vị, thơng tin trích dẫn luận án rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng 10 năm 2018 Tác giả luận án Nguyễn Thị Thanh i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài luận án nhận nhiều giúp đỡ từ tổ chức cá nhân Trước hết tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Phạm Công Hoạt (Bộ Khoa học Công nghệ), PGS TS Lê Văn Năm (Hội đồng chức danh giáo sư nhà nước), PGS.TS Phạm Thị Tâm (Phòng Khoa học Hợp tác quốc tế, Viện Đại học Mở Hà Nội) định hướng, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành cơng trình nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới hỗ trợ tài chính, sở vật chất, trang thiết bị từ đề tài cấp Nhà nước mã số KC04.03/11- 15 Tôi xin cảm ơn tập thể cán bộ, kỹ thuật viên, học viên Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội nơi thực nội dung đề tài luận án, hỗ trợ mặt để tơi hồn thành luận án Để hoàn thành luận án này, tơi cịn nhận động viên, khuyến khích giúp đỡ bạn bè, đồng nghiệp gia đình Tất giúp đỡ tình cảm quý báu nguồn động lực lớn giúp tơi hồn thành cơng trình nghiên cứu Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng 10 năm 2018 Tác giả luận án Nguyễn Thị Thanh ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vii Danh mục bảng ix Danh mục hình x MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Một số đặc điểm sinh học cá mú 1.1.1 Hệ thống phân loại cá mú 1.1.2 Đặc điểm phân bố 1.1.3 Đặc điểm sinh trưởng 1.1.4 Đặc điểm sinh sản 1.1.5 Đặc điểm hệ miễn dịch cá mú 1.2 Ýnghĩa kinh tế tình hình ni cá mú 1.3 Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh cá mú giới Việt Nam10 1.3.1 Đặc điểm bệnh hoại tử thần kinh cá biển 10 1.3.2 Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh cá mú giới 12 1.3.3 Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh cá mú Việt Nam 15 1.3.4 Các phương pháp chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh cá 17 1.4 Tổng quan vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh 21 1.5 Một số biện pháp phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú 25 1.6 Kháng nguyên tái tổ hợp tình hình sử dụng vắc-xin phịng bệnh cho cá27 1.6.1 Kháng nguyên tái tổ hợp tác nhân gây bệnh 27 1.6.2 Tình hình sử dụng vắc-xin phòng bệnh cho cá giới 30 1.6.3 Tình hình sử dụng vắc-xin phịng bệnh cho cá Việt Nam 34 CHƯƠNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37 2.1 Đối tượng vật liệu nghiên cứu 37 iii 2.2 Nội dung nghiên cứu .38 2.3 Phương pháp nghiên cứu 38 2.3.1 Nhóm phương pháp cho nội dung xác định vi rút gây hoại tử thần kinh cá mú 38 2.3.1.1 Phương pháp thu xử lý mẫu 38 2.3.1.2 Phương pháp mô bệnh học 38 2.3.1.3 Phương pháp phân lập vi rút kỹ thuật nuôi cấy tế bào 39 2.3.1.4 Phương pháp tách chiết RNA tổng số 40 2.3.1.5 Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) 41 2.3.1.6 Điện di axit nucleic gel agarose 41 2.3.1.7 Phương pháp tách dòng gen: 41 2.3.2 Phương pháp xác định đặc tính sinh học vi rút gây hoại tử thần kinh (NNV) 45 2.3.2.1 Phương pháp xác định độc lực vi rút tế bào GS1 45 2.3.2.2 Phương pháp xác định độc lực vi rút cá mú 46 2.3.2.3 Thí nghiệm ảnh hưởng nhiệt độ đến khả gây nhiễm vi rút tế bào GS1 47 2.3.2.4 Thí nghiệm ảnh hưởng nhiệt độ đến khả gây nhiễm vi rút cá mú 48 2.3.3 Nhóm phương pháp biểu gen mã hóa kháng nguyên đánh giá khả tạo kháng thể kháng nguyên tái tổ hợp 48 2.3.3.1 Chuẩn bị vector pET32a+ để thực phản ứng nối gen 48 2.3.3.2 Nối gen T4 vào vector pET32a+ 49 2.3.3.3 Chuyển gen vào E coliJM109 49 2.3.3.4 Tách chiết plasmid từ khuẩn lạc sau biến nạp chuẩn bị cho kiểm tra PCR enzyme giới hạn 50 2.3.3.5 Nuôi cấy E coli BL21 mang plasmid tái tổ hợp pET32a+-T4 51 2.3.3.6 Phương pháp điện di SDS-PAGE 51 2.3.3.7 Phương pháp Western blot 52 iv 2.3.3.8 Phương pháp đánh giá khả tạo kháng thể trung hòa kháng nguyên tái tổ hợp 53 2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu 56 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 57 3.1 Xác định vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh cá mú Việt Nam 57 3.1.1 Sàng lọc mẫu nhiễm vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh phương pháp mô bệnh học 57 3.1.2 Xác định mẫu cá nhiễm vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh phương pháp RT-PCR 59 3.1.3 Xác định vi rút gây bệnh tế bào 62 3.1.4 Giải trình tự gen mã hóa kháng nguyên T4 NNV 67 3.2 Nghiên cứu số đặc tính sinh học vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh cá mú 72 3.2.1 Đặc tính gây bệnh vi rút gây hoại tử thần kinh tế bào mẫn cảm72 3.2.2 Đặc tính gây bệnh vi rút gây hoại tử thần kinh cá mú 73 3.2.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả gây bệnh vi rút gây hoại tử thần kinh tế bào GS1 75 3.2.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả gây bệnh vi rút gây hoại tử thần kinh cá mú 77 3.3 Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú 80 3.3.1 Thiết kế vector tái tổ hợp pET32a+- T4 80 3.3.2 Biểu gen mã hóa kháng nguyên T4 vi rút gây hoại tử thần kinh85 3.3.2.1 Tạo chủng vi khuẩn E.coliBL21(DE3) mang gen mã hóa kháng nguyên NNV 85 3.3.2.2 Biểu gen T4 tế bào vi khuẩn tái tổ hợp 87 3.3.2.3 Đánh giá điều kiện biểu gen mã hóa kháng nguyên T4 vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh 92 3.3.3 Tinh kháng nguyên tái tổ hợp 95 v 3.3.4 Đánh giá khả tạo kháng thể kháng nguyên tái tổ hợp 97 3.3.4.1 Đánh giá khả tạo kháng thể kháng nguyên tái tổ hợp thỏ 97 3.3.4.2 Đánh giá khả sinh đáp ứng miễn dịch kháng nguyên tái tổ hợp cá mú 100 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 104 DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN TIẾN SĨ DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Giải thích aa Amino axit BFNNV Barfin flounder nervous necrosis virus (vi rút gây hoại tử thần kinh cá bơn) bp Base pair (cặp bazơ) BSA Bovine Serum Albumin (Albumin huyết bò) cDNA Complementary Deoxyribonucleic acid (Chuỗi Axit Deoxyribonucleic acid bổ sung) CPE Cytopathogenic effect (Hiệu ứng bệnh tích tế bào) CNS Central nervous system (Hệ thần kinh trung ương) cs Cộng Da Dalton DAB Diamino bezidine (kit làm màu) DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethyllene diamine tetra acetic acid ELISA Enzyme linked immunosorbent assay (phản ứng miễn dịch liên kết enzyme) EtBr Ethidium Bromide FCS fetal calf serum (Huyết bào thai bê) HRP Horseradish peroxidase (Enzyme Horseradish Peroxidase) kb kilobase KDa Kilodalton GAA Global Aquaculture Alliance (Liên minh nuôi trồng thủy sản toàn cầu) GS Grouper spleen (tế bào lách cá mú) IPTG isopropyl β-D- thiogalactoside Ig Immunoglobulin (kháng thể) vii LB Leibovitz’s (môi trường nuôi tế bào) LD50 Lethal Dose 50% (liều gây chết 50% động vật thí nghiệm) NCR Non coding region ND Not done (không đánh giá) NNV Nervous Necrosis Virus (vi rút gây hoại tử thần kinh) nt nucleotid OD Optical Density (mật độ quang) ORF Open Reading Frame (Khung đọc mở) PAGE Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Điện di gel polyacrylamide) PCR Polemerase Chain Reaction (chuỗi phản ứng polime) PVDF Polyvinylidene Fluoride RGNNV Red - spotted grouper nervous necrosis virus (vi rút gây hoại tử thần kinh cá mú chấm đỏ) RNA Ribonucleic acid RT-PCR Reverse Transcription PCR (PCR phiên mã ngược) SDS Sodium dodecyl sulphase SJNNV Striped jack nervous necrosis virus (vi rút gây hoại tử thần kinh cá măng sọc) TAE Tris - acetate - EDTA TBS Tris Buffer Saline TBST TBS - Tween TCID50 Tissue culture infective dose 50% (liều gây chết 50% tế bào) TPNNV Tiger puffer nervous necrosis virus (vi rút gây hoại tử thần kinh cá hổ) UV Ultraviolet light VLPs Virus-like particles (Tạo hạt giả vi rút) VNN Viral Nervous Necrosis (Bệnh hoại tử thần kinh) viii ... độ đến khả gây bệnh vi rút gây hoại tử thần kinh cá mú 77 3.3 Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú ... Đặc tính gây bệnh vi rút gây hoại tử thần kinh tế bào mẫn cảm72 3.2.2 Đặc tính gây bệnh vi rút gây hoại tử thần kinh cá mú 73 3.2.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả gây bệnh vi rút gây hoại tử thần kinh. .. đoán bệnh hoại tử thần kinh cá 17 1.4 Tổng quan vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh 21 1.5 Một số biện pháp phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú 25 1.6 Kháng nguyên tái tổ hợp tình hình