TÓM tắt nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi rút gây hoại tử thần kinh và tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắc xin phòng bệnh cho cá mú (e

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM  - NGUYỄN THỊ THANH NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI RÚT GÂY HOẠI TỬ THẦN KINH VÀ TẠO KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT VẮC-XIN PHÒNG BỆNH CHO CÁ MÚ (Epinephelus spp) TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NƠNG NGHIỆP Hà Nội, năm 2018 Cơng trình hồn thành tại: VIỆN KHOA HỌC NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Phạm Công Hoạt PGS.TS Lê Văn Năm Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện Họp Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi ngày tháng năm 2018 Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư Viện Quốc gia Thư Viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Thư Viện Viện Di truyền Nông nghiệp MỞ ĐẦU Ngành thủy sản năm gần phát triển nhanh chóng trở thành ngành kinh tế mũi nhọn Việt Nam Nghề nuôi cá biển đánh giá nghề mang lại hiệu kinh tế cao cá mú xem số đối tượng chủ lực Cá mú (Epinephelus spp.) có giá trị kinh tế cao giàu hàm lượng dinh dưỡng, thịt cá thơm ngon cá mú thị trường nước ưa chuộng Tuy nhiên, nghề nuôi cá mú phát triển người ni gặp khơng khó khăn dịch bệnh gây cá Các nghiên cứu tác nhân gây bệnh chủ yếu cá mú thường vi rút, nấm vi khuẩn nguy hiểm bệnh hoại tử thần kinh (Viral Nervous Necrocis - VNN) hay bệnh não võng mạc (Viral Encephalopathy and Retinopathy - VER) Betanodavirus gây Vi rút cơng gây bệnh cá mú tất giai đoạn phát triển cá từ ấu trùng, cá giống đến cá thương phẩm Khi bị bệnh cá có biểu rối loạn thần kinh bơi thăng bằng, bơi xoay tròn, đầu chúc xuống treo mặt nước hay nằm đáy bể, đáy lồng Cá bệnh chết sau 3-5 ngày với tỷ lệ chết cao từ 80100% (Đỗ Thị Hoà cs, 2004) [2] Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh cá mú ngày gia tăng đòi hỏi cần có biện pháp phịng bệnh hiệu Cá mú có khả sinh đáp ứng miễn dịch tốt tiếp xúc với kháng nguyên, việc nghiên cứu tạo nguyên liệu để sản xuất vắc-xin phòng bệnh cho cá ngày trở nên cấp thiết Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu số đặc tính sinh học vi rút gây hoại tử thần kinh tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin phòng bệnh cho cá mú (Epinephelus spp.)” Mục tiêu đề tài luận án: - Xác định vi rút gây hoại tử thần kinh cá mú Việt Nam số đặc tính sinh học vi rút gây bệnh - Tạo kháng nguyên tái tổ hợp đánh giá khả sinh kích thích miễn dịch kháng nguyên để làm nguyên liệu phục vụ sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú Ý nghĩa khoa học thực tiễn: - Tính khoa học: Luận án xác định vi rút gây bệnh số đặc tính sinh học chúng Đồng thời luận án sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp protein T4 vi rút gây bệnh, đánh giá tính sinh đáp ứng miễn dịch để làm sở cho việc sản xuất vắc-xin phòng bệnh cho cá mú Dữ liệu khoa học luận án cung cấp thêm tư liệu giảng dạy nghiên cứu bệnh định hướng sản xuất vắc- xin phịng bệnh cho cá mú ni - Tính thực tiễn: Đề tài tạo kháng nguyên tái tổ hợp protein T4 đánh giá khả kích thích sinh đáp ứng miễn dịch kháng nguyên tái tổ hợp làm nguồn nguyên liệu sản xuất vắc- xin phòng bệnh cho cá mú góp phần hạn chế dịch bệnh, tăng sản lượng cá nuôi phát triển bền vững nghề nuôi cá mú Đóng góp đề tài luận án: - Lần Việt Nam nghiên cứu cách toàn diện vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh cá mú, xác định 26 chủng vi rút số đặc tính sinh học vi rút gây bệnh - Luận án cơng trình Việt Nam tạo kháng nguyên protein T4 tái tổ hợp, kháng nguyên có khả sinh đáp ứng miễn dịch bảo hộ cho cá mú kéo dài ngày thứ 90 sau tiêm Đây sở khoa học để sử dụng kháng nguyên protein T4 tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú Cấu trúc luận án: Luận án gồm 105 trang với 16 bảng số liệu 32 hình Luận án gồm phần: Mở đầu (3 trang); tổng quan tài liệu (34 trang); phương pháp nghiên cứu (19 trang); kết thảo luận (47 trang); kết luận kiến nghị (2 trang) Luận án tham khảo 71 tài liệu 15 tài liệu tiếng Việt, 56 tài liệu tiếng Anh CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Một số đặc điểm sinh học cá mú Cá mú thuộc họ Serranidae, giống Epinephelus Theo Viện Hải dương học Nha Trang, vùng biển nước ta có khoảng 30 loài cá mú (Lê Anh Tuấn, 2004) [11] Cá mú sống vùng nước ấm, nhiệt độ thích hợp cho cá mú phát triển từ 22-32ºC, thích hợp 25-30ºC Cá chịu độ mặn từ 11- 41‰ Hình 1.1 Hình thái ngồi cá mú chấm nâu (Epinephelus coioides) Ở cá mú có hàng rào học dịch nhờn, da mang bảo vệ giúp thể cá chống lại xâm nhập tác nhân gây bệnh (Kim Văn Vạn Lê Thanh Hịa, 2009) [12] Cá mú có hệ thống miễn dịch đặc hiệu kháng nguyên xâm nhập vào thể, chúng có khả sản sinh kháng thể đặc hiệu để chống lại kháng nguyên, bảo vệ cá tránh tác hại tác nhân gây bệnh 1.2 Ý nghĩa kinh tế tình hình ni cá mú Cá mú có giá trị kinh tế cao, cá mú đen cá mú chấm nâu có khối lượng từ 800 đến 1000g 200.000 - 300.000 đồng/kg Cá mú chấm đỏ giá dao động 400.000-500.000 đồng/kg [73][74] Nghề nuôi cá mú nước ta tập trung phát triển vùng biển Quảng Ninh, Hải Phòng, Nghệ An, Nha Trang, Ninh Thuận, Bình Thuận, Vũng Tàu Kiên Giang (Lê Anh Tuấn, 2004 [11], Võ Văn Quang cs, 2013 [5]) Trong năm qua nước có 500 vùng biển ven bờ xây dựng thành ao đìa ni cá mú Sản lượng cá mú hàng năm cung cấp 3000 sản phẩm Tuy nhiên cá mú thường hay bị số bệnh đốm đỏ, bệnh hoại cơ, bệnh đường ruột vi khuẩn gây nên, đặc biệt bệnh hoại tử thần kinh vi rút gây Hiện nay, chưa có vắc-xin phòng ngừa loại vi rút biện pháp phòng ngừa chủ yếu đảm bảo vệ sinh cách ly nguồn lây nhiễm vi rút 1.3 Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh cá mú giới Việt Nam 1.3.1 Đặc điểm bệnh hoại tử thần kinh cá biển 1.3.2 Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh cá mú giới 1.3.3 Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh cá mú Việt Nam 1.3.4 Các phương pháp chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh cá Hiện để chẩn đoán bệnh VNN thường sử dụng phương pháp: mô bệnh học, phân lập vi rút tế bào, sinh học phân tử, sử dụng kính hiển vi điện tử chẩn đốn miễn dịch học (OIE, 2005) [15] 1.4 Tổng quan vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh Tác nhân gây bệnh hoại tử thần kinh cá Betanodavirus, nhân RNA, hình cầu, đường kính 25-30 nm Hệ gen có cấu trúc phân đoạn, RNA mạch đơn, tuyến tính hai phía có hai tiểu phần Tiểu phần lớn chứa RNA1 (3.1 kb) mã hóa cho protein có kích thước 100 kDa với chức RNA polymerase Tiểu phần nhỏ chứa RNA2 chứa hai vùng bảo tồn cao T2 (870 bp) T4 (420 bp) (Nishizawa cs, 1997) 1.5 Một số biện pháp phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú Hiện chưa có loại vắc-xin đạt hiệu phịng bệnh hoại tử thần kinh Vì biện pháp đảm bảo vệ sinh, tránh nguồn lây nhiễm coi biện pháp chủ yếu để tránh gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi cá mú 1.6 Kháng nguyên tái tổ hợp tình hình sử dụng vắc-xin phòng bệnh cho cá 1.6.1 Kháng nguyên tái tổ hợp tác nhân gây bệnh Kháng nguyên tái tổ hợp kháng nguyên (protein miễn dịch) sản xuất kỹ thuật di truyền Trên giới, việc sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp để sản xuất vắcxin kiểm soát số bệnh nguy hiểm cho cá nuôi nghiên cứu từ năm 1980 Việc ứng dụng công nghệ sinh học để sản xuất số lượng lớn kháng nguyên đường tái tổ hợp giúp tiết kiệm chi phí sản xuất, an tồn với cá ni Cơng nghệ DNA tái tổ hợp sử dụng để sản xuất kháng nguyên phòng bệnh vi rút cho cá phát triển mạnh mẽ 1.6.2 Tình hình sử dụng vắc-xin phịng bệnh cho cá giới Hiện giới có số loại vắc-xin vơ hoạt sử dụng để phòng bệnh vi rút gây hoại tử tuyến tụy (IPNV), hoại tử quan tạo máu (IHNV), nhiễm trùng xuất huyết (VHSV), vi rút đường máu cá chép vào mùa xuân (SVCV) Tuy nhiên, nuôi cấy vi rút tế bào thường chi phí cao, khả tinh khiết khó Gần đây, sử dụng cơng nghệ DNA tái tổ hợp để sản xuất vắc-xin protein từ vi rút phòng bệnh cho cá khả thi đưa lại hiệu kinh tế cao (Christie cs, 1997; Lorenzen cs, 2005) [26][43] 1.6.3 Tình hình sử dụng vắc-xin phòng bệnh cho cá Việt Nam Năm 1996 - 1998, Bùi Quang Tề cs chế tạo vắc-xin từ vi khuẩn Aeromonas hydrophila để phòng bệnh cho cá trắm cỏ, vắc-xin có tỷ lệ bảo hộ từ 90 đến 100% (Bùi Quang Tề cs, 2006) [7] Năm 2003, Vũ Dũng Tiến chế tạo vắc-xin từ kết hợp kháng nguyên ngoại bào nội bào vi khuẩn Aeromonas hydrophila để phòng bệnh cho cá trắm cỏ, vắc-xin có hiệu tốt với tỷ lệ bảo hộ đạt 100% (Vũ Dũng Tiến cs, 2003) [9] Năm 2003 - 2005 đề tài KC-06-20NN chế tạo vắc-xin phòng bệnh xuất huyết hoại tử nội tạng cho cá tra cá basa Vắc-xin đảm bảo tiêu an tồn cá thí nghiệm, tỷ lệ bảo hộ đạt từ 90 - 100% (Bùi Quang Tề cs, 2006) [7] Năm 2006 - 2007, Viện Nghiên cứu nuôi trồng Thủy sản II triển khai đề tài nghiên cứu tạo vắc-xin phòng bệnh gan thận mủ vi khuẩn Edwardsiella ictaluri cá tra (Pangasianodon hypothalmus) nuôi công nghiệp đồng Sông Cửu Long Kết bước đầu cho thấy khả đáp ứng miễn dịch cá tra vi khuẩn E ictaluri qua hàm lượng kháng thể có máu cá đạt cao Từ năm 2011, Phạm Thị Tâm cs tiến hành nghiên cứu sản xuất vắc-xin phịng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú ni công nghiệp Sản phẩm từ đề tài vắc-xin vô hoạt formalin nồng độ 0,03% 4oC thời gian ngày; lựa chọn chất bổ trợ dầu Montanique ISA70 có khả tăng kích thích sản sinh đáp ứng miễn dịch phù hợp với cá mú điều kiện thí nghiệm Vắc-xin có tác dụng phòng bệnh cho cá mú, hiệu lực bảo vệ 83% cá giống, an tồn 100%, có độ vơ trùng tuyệt đối (Phạm Thị Tâm cs, 2015) [6] CHƯƠNG VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng vật liệu nghiên cứu 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu - Vi rút gây hoại tử thần kinh (NNV) - Kháng nguyên protein T4 tái tổ hợp 2.1.2 Vật liệu nghiên cứu - Tế bào GS1 (lách cá mú) hãng Sigma (Đức) - Vector pGEM-T vector pET32a+ hãng Novagen (Mỹ) - Chủng E coliJM109 E coliBL21(DE3) hãng HV Biotek - Enzyme EcoRI (Invitrogen) - Kít RT-PCR one step (Quiagen Mỹ), kít tinh DNA Qick Gel Extraction (Invitrogen), thang DNA protein (Invitrogen) - Cột Nikel chelating Resin (Invitrogen) - Cá mú chấm nâu (Epinephelus coioides), cá mú cọp (Epinephelus fuscoguttatus) mú chuột (Cromileptes altivelis) kích cỡ khác nhau; - Cá mú chấm nâu (Epinephelus coioides) giai đoạn cá bột, cá (chiều dài từ 1,5 – cm) - Các loại môi trường, dụng cụ nuôi cấy tế bào: Leibovit, MEM, HANK's, FCS, kháng sinh, kháng nấm,… - Các loại hóa chất tinh khiết cho xét nghiệm mơ bệnh học; hóa chất sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử hãng: Sigma, Bio-Basic, Invitrogen, Biological bao gồm: IPTG, ampicilin, X-gal, agarose, EDTA, SDS, cao nấm men, peptone, NaCl, Ethidium Bromide, Ethanol, Isopropanol, Sodium acetate, acid acetic, glycine, methanol, TBST, BSA, TBS, Tris HCl, EDTA, TAE, NaOH, T4 ligase… 2.2 Nội dung nghiên cứu - Xác định vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh cá mú Việt Nam - Xác định số đặc tính sinh học vi rút gây hoại tử thần kinh cá mú - Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Nhóm phương pháp xác định vi rút gây hoại tử thần kinh cá mú - Phương pháp thu xử lý mẫu 51 mẫu cá mú nghi mắc bệnh hoại tử thần kinh vùng biển Quảng Ninh (QN1QN8), Hải Phịng (HP1- HP11), Nam Định (NĐ1-NĐ11), Khánh Hịa (KH1-KH9), Bình Thuận (BT1-BT12) thu bảo quản lạnh Mẫu bệnh phẩm thu não mắt - Phương pháp mô bệnh học: theo OIE, FAO (2005) - Xác định vi rút nuôi cấy tế bào theo phương pháp Q.W.Qin cs (2006) - Phương pháp tách chiết RNA tổng số từ mẫu tế bào gây nhiễm VNN Kit RNeasy Qiagen hãng Qiagen - Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) - Điện di gel agarose: theo phương pháp Sambrook cs, 2001 - Phương pháp tách dòng gen: theo Sambrook cs, 2001 - Phương pháp tạo plasmid tái tổ hợp mang gen T4 + Phân cắt plasmid pGEM-T enzyme giới hạn EcoRI, ủ 37oC vòng 2,5- 3h Điện di gel agarose 1% để kiểm tra kết + Ghép nối gen T4 vào pGEM-T: - Phương pháp chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến: với tế bào chủ E.coli JM109, biến nạp phương pháp sốc nhiệt - Phương pháp tách plasmid từ vi khuẩn E coli: - Phương pháp kiểm tra plasmid tái tổ hợp: - Phương pháp tinh DNA gel agarose: theo PureLink® Quick Gel Extraction Kit có TOPO® TA Cloning Kit hãng Invitrogen - Giải trình tự gen T4 máy tự động ABI 3100 (Applied Biosystems) Dùng phần mềm Blast xác định mức tương đồng trình tự gen T4 với GenBank 2.3.2 Phương pháp xác định đặc tính sinh học vi rút gây hoại tử thần kinh - Xác định độc lực vi rút tế bào: dịch vi rút pha loãng từ 10-1 đến 10-9 với môi trường Leibovitz’s 15 (10% FCS) Giữ khay cấy 28oC để vi rút hấp phụ lên tế bào Độc lực vi rút đánh giá qua số TCID50 - Phương pháp xác định độc lực vi rút cá mú: dịch vi rút pha loãng từ 10-1 đến 10-9, độ pha loãng tiêm 30 cá mú (1,5-2 cm), liều 0,1 ml/con Quan sát biểu lâm sàng, tỷ lệ chết gen mã hóa kháng nguyên T4 sau ngày Khả gây bệnh vi rút đánh giá số LD50 - Thí nghiệm ảnh hưởng nhiệt độ đến khả gây nhiễm vi rút tế bào GS1: chọn chủng QN4 có TCID50 cao (10-6,8) để gây nhiễm tế bào Mỗi chủng NNV nuôi cấy ngưỡng nhiệt độ: 17, 22, 27 32oC, liều gây nhiễm liều TCID50 = 10-6,8 Theo dõi đánh giá CPE sau ngày thí nghiệm - Thí nghiệm ảnh hưởng nhiệt độ đến khả gây nhiễm vi rút cá mú: Chủng QN4 có liều LD50 cao (10-7,5) gây nhiễm vào cá mú Lô đối chứng cá tiêm môi trường Leibovit”z 15 Cá nuôi 280C (cả ngày) 280 (ban ngày)/240C (ban đêm) Sau 15 ngày đánh giá tỷ lệ chết xác định gen T4 2.3.3 Nhóm phương pháp biểu gen mã hóa kháng nguyên đánh giá khả tạo kháng thể kháng nguyên tái tổ hợp - Chuẩn bị vector pET32a+ để thực phản ứng nối gen T4 (pET32a+-T4) Dùng phương pháp sốc nhiệt để đưa vector pET32a+-T4 vào tế bào E coliBL21 - Tách chiết plasmid từ khuẩn lạc sau biến nạp - Kiểm tra PCR enzyme giới hạn để xác định có mặt gen T4 plasmid - Nuôi cấy E coli BL21 mang plasmid tái tổ hợp pET32a+-T4 - Phương pháp điện di SDS-PAGE - Phương pháp Western blot: nhằm nhận biết protein tái tổ hợp T4 thể tính đặc hiệu với vi rút gây hoại tử thần kinh - Phương pháp đánh giá khả tạo kháng thể kháng nguyên tái tổ hợp + Đánh giá khả tạo kháng thể trung hoà kháng nguyên tái tổ hợp thỏ: Đối chứng dương: huyết thỏ khỏe, khơng có kháng thể đặc hiệu ủ với chủng QN2 (liều 104 TCID50) hấp phụ vào tế bào GS1 gây nhiễm vào cá mú nhỏ (≤ g) phương pháp tiêm (liều 0,05 ml dịch NNV cường độc QN2 hiệu giá 103 LD50) Đối chứng âm: huyết thỏ khỏe, gây miễn dịch với E.coliBL21pET32a+-T4 protein T4 tái tổ hợp pha loãng theo hệ số 10 hấp phụ vào tế bào GS1 gây nhiễm vào cá mú (≤ g) phương pháp tiêm Lơ thí nghiệm: huyết thỏ gây miễn dịch với E.coliBL21-pET32a+-T4 protein T4 tái tổ hợp, pha loãng theo hệ số 10, ủ với chủng QN2 liều 104 TCID50 hấp phụ vào tế bào GS1 gây nhiễm vào cá mú (≤ g) phương pháp tiêm (liều 0,05 ml dịch vi rút QN2 hiệu giá 103 LD50) + Đánh giá khả tạo kháng thể trung hoà kháng nguyên tái tổ hợp cá mú Đối chứng dương: cá mú bột bệnh nghiền, xử lý kháng sinh, lọc pha loãng theo hệ số 10, ủ với chủng QN2 với liều 104 TCID50 gây nhiễm vào tế bào GS1 Đối chứng âm: cá mú bột bệnh gây miễn dịch với kháng nguyên E.coli BL21-pET32a+-T4 protein T4 tái tổ hợp với liều (0,2 mg/liều), liều nhắc lại sau 15 ngày Theo dõi cá 90 ngày, định kỳ 15 ngày thu mẫu, nghiền, xử lý kháng sinh, lọc, pha loãng theo hệ số 10 gây nhiễm vào tế bào GS1 Lơ thí nghiệm: cá mú bột bệnh gây miễn dịch với E coliBL21-pET32a+-T4 protein T4 tái tổ hợp với liều (0,2 mg/liều), liều nhắc lại sau 15 ngày Theo dõi cá 90 ngày, định kỳ thu mẫu, nghiền, xử lý kháng sinh, lọc, pha loãng ủ với chủng QN2 (104 TCID50) gây nhiễm vào tế bào GS1, đánh giá CPE ngày CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Xác định vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh cá mú Việt Nam 3.1.1 Sàng lọc mẫu nhiễm vi-rút gây bệnh hoại tử thần kinh phương pháp mô bệnh học Kết sàng lọc mẫu nhiễm vi-rút gây hoại tử thần kinh 51 mẫu cá mú trình bày hình 3.1 bảng 3.1 cho thấy có 26 mẫu xuất không bào mô mắt mô não Các không bào mẫu kiểm tra có dạng hình trịn hình elip, kích thước khơng bào từ 5-10µm Hình 3.1 Bệnh tích tế bào mô não mô mắt cá (a Cá mú bệnh, b Không bào não, c Không bào mắt) Bảng 3.1 Kiểm tra vi-rút phương pháp mô bệnh học Bệnh tích tế bào mơ não cá (26 mẫu) Ký hiệu mẫu Bệnh tích tế bào mơ mắt cá (17 mẫu) Tỷ lệ (%) Ký hiệu mẫu Tỷ lệ (%) QN2, QN4, QN7 37,50 QN2, QN4, QN7 37,50 HP2, HP4, HP5, HP8, HP10 45,45 27,27 NĐ1, NĐ3, NĐ4, NĐ5, NĐ7, NĐ8, NĐ10, NĐ11 KH4, KH5, KH6, KH9 72,72 HP4, HP5, HP8 NĐ1, NĐ4, NĐ5, NĐ10, NĐ11 KH4, KH5 BT2, BT4, BT9, BT12 Trung bình BT1, BT2, BT4, BT7, BT9, BT12 Trung bình 44,44 50,00 50,98 45,45 22,22 33,33 33,33 Vi rút gây bệnh có tổ chức thần kinh 26 mẫu thu thập Các mẫu cịn lại khơng thấy khơng bào xuất khơng nằm ngồi khả thời kỳ tiền nhiễm Do chúng tơi tiếp tục việc xác định vi rút phương pháp sinh học phân tử để xác định gen mã hóa kháng nguyên NNV 3.1.2 Xác định mẫu cá nhiễm vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh phương pháp RT-PCR Bảng 3.2 Xác định vi-rút gây bệnh hoại tử thần kinh phương pháp RT-PCR Số mẫu dương tính với gen T4 NNV (27 mẫu) QN2, QN4 Tỷ lệ (%) 25,00 HP2, HP4, HP6, HP7, HP8, HP10, HP11 63,63 NĐ1, NĐ3, NĐ4, NĐ5, NĐ7, NĐ8, NĐ10, NĐ11 72,72 KH4, KH5, KH9 33,33 BT2, BT3, BT4, BT7, BT9, BT10, BT12 58,33 Trung bình 52,94 Kết cho thấy có 27/51 mẫu dương tính với gen T4 chiếm tỷ lệ 52,94% Sản phẩm PCR số mẫu bệnh phẩm nghi nhiễm NNV cụ thể HP1, HP2, NĐ3, NĐ2, QN2, QN4, KH4, KH 5, BT2 BT3 thể hình 3.2 Mẫu HP2, NĐ3, QN2, QN4, KH4, KH5, BT2, BT3 xuất băng có kích thước khoảng 420 bp tương ứng với kích thước đoạn gen T4 Mẫu HP1, NĐ2 khơng xuất băng vạch Hình 3.2 Điện di đồ sản phẩm RT-PCR số mẫu bệnh phẩm nghi nhiễm NNV (Giếng 1-10: mẫu HP1, HP2, NĐ3, NĐ2, QN2, QN4, KH4, KH5, BT2, BT3, Giếng 11: marker) 3.1.3 Xác định vi rút tế bào Đề tài sử dụng dòng tế bào GS1 để đánh giá khả gây nhiễm NNV, với 27 mẫu dương tính với gen T4, chúng tơi xác định 26 chủng vi rút (hình 3.3, bảng 3.3) Mẫu HP11 khơng có biểu bệnh tích mơ não mơ mắt Hình 3.3 Bệnh tích tế bào GS1 sau gây nhiễm NNV A: Tế bào sau gây nhiễm NNV ngày, tế bào kết hạt co tròn, B: Tế bào sau gây nhiễm NNV ngày, C: Không bào tế bào GS1 gây nhiễm NNV sau ngày Hình 3.7 So sánh độ tương đồng đoạn gen giải trình tự với đoạn gen T4 Betanodavirus mã số HM017077.1 Từ kết giải trình tự gen cho phép chúng tơi kết luận chủng vi rút xác định Nervous Necrosis Virus thuộc họ Betanodavirus 3.2 Xác định số đặc tính sinh học vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh 3.2.1 Xác định đặc tính gây bệnh vi rút tế bào Bảng 3.5 Đặc tính gây bệnh vi rút gây hoại tử thần kinh tế bào GS1 Liều gây chết 50% tế bào (TCID50) STT Ký hiệu mẫu Lần Lần Lần Lần Trung bình 10-6,9 10-6,9 10-7 10-7 10-6,9 10-6,8 10-6,8 10-6,8 10-6,9 10-6,8 HP6 10-4,3 10-5 10-4,8 10-4,4 10-4,9 10-4,8 10-4,3 10-4,8 10-4,7 10-4,5 10-4,9 10-4,9 10-4,3 10-4,9 10-4,8 HP7 HP8 10-6,8 10-6 10-6,9 10-5,8 10-6,8 10-5,7 10-7 10-6,1 10-6,8 10-5,9 HP10 10-3,9 10-4 10-3,9 10-3,8 10-3,9 10 NĐ1 NĐ3 10-6,8 10-3 10-6,8 10-3,1 10-7 10-3 10-6,9 10-3 10-6,8 10-3 QN2 HP2 HP4 QN4 11 Liều gây chết 50% tế bào (TCID50) Lần Lần Lần Lần 10-4,9 10-4,9 10-4,8 10-4,9 10-5,9 10-5,8 10-6 10-5,9 STT Ký hiệu mẫu 11 12 NĐ4 13 10-4,3 10-4,3 10-4,2 10-4,3 10-4,3 14 NĐ7 NĐ8 10-4,8 10-4,9 10-4,9 10-4,9 10-4,9 15 NĐ10 10-3 10-3 10-3 10-2,9 10-3 16 17 NĐ11 10-3 10-2,7 10-3,1 10-2,8 10-3 10-2,7 10-3 10-2,6 10-3 10-2,7 10-6,8 10-3 10-6,8 10-3 10-6,8 10-3,1 10-6,9 10-3 10-6,8 10-3 10-4,8 10-4,9 10-4,9 10-5 10-4,9 10-4,8 10-5,9 10-4,8 10-5,9 10-4,7 10-5,9 10-4,8 10-5,8 10-4,8 10-5,9 10-6,8 10-3,9 10-6,9 10-4 10-6,8 10-3,9 10-6,7 10-3,9 10-6,8 10-3,9 10-2,5 10-2,7 10-2,9 10-2,8 10-2,7 NĐ5 KH4 KH5 18 19 KH9 20 BT2 BT3 21 22 BT4 23 24 BT7 BT9 BT10 25 Trung bình 10-4,9 10-5,9 10-4,8 10-4,9 10-4,9 10-4,9 10-4,9 BT12 Qua thí nghiệm cho thấy có 6/26 chủng vi rút có độc lực cao với TCID50 từ -6,8 10 đến 10-6,9; 10/26 chủng có liều TCID50 đạt 10-4,8- 10-5,9, độ pha lỗng vi rút 10-8; 10 chủng cịn lại độc lực yếu có liều TCID 50 đạt 10-2,7- 10-4,3 3.2.2 Xác định đặc tính gây bệnh vi rút gây hoại tử thần kinh cá mú Đề tài chọn chủng độc lực cao (QN2, QN4, HP7, NĐ1, KH5 BT7) chủng độc lực thấp (KH4, BT10) để gây nhiễm cá mú Theo dõi cá ngày để xác định tỷ lệ chết gen T4, kết trình bày bảng 3.6 Bảng 3.6 Đặc tính gây bệnh vi rút gây hoại tử thần kinh cá mú Liều gây chết 50% cá thí nghiệm (LD50) STT Ký hiệu mẫu Lần Lần Lần Trung bình 26 QN2 10-6,2 10-6,2 10-6,1 10-6,2 QN4 10-7,5 10-7,6 10-7,5 10-7,5 HP7 10-7,5 10-7,5 10-7,4 10-7,5 NĐ1 10-5,4 10-5,6 10-5,5 10-5,5 KH5 10-6,3 10-6,2 10-6,4 10-6,2 BT7 10-6,5 10-6,5 10-6,4 10-6,5 KH4 10-3,7 10-3,6 10-3,6 10-3,6 BT10 10-2,5 10-2,7 10-2,5 10-2,6 Đối chứng ND ND ND ND (Ghi chú: ND không đánh giá) 12 Kết cho thấy: chủng QN4 HP7 có độc lực cao cá với LD50 đạt 10-7,5, chủng có LD50 cá thấp từ 10-2,6-10-3,6 KH4, BT10 3.2.3 Xác định ảnh hưởng nhiệt độ đến khả gây bệnh vi rút tế bào Tế bào GS1 gây nhiễm NNV chủng QN4 với hiệu giá 10-6,8 TCID50/ml nuôi ngày, theo dõi mật độ tế bào sống Hình 3.8 Mật độ tế bào sống sót sau gây nhiễm NNV Kết trình bày hình 3.8 cho thấy, 220C ngưỡng nhiệt độ phù hợp cho nhân lên vi rút trình gây nhiễm vi rút tế bào GS1 3.2.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả gây bệnh vi rút cá mú Khả gây bệnh NNV nhiệt độ 28oC (cả ngày đêm) thể bảng 3.8 cho thấy: lô cá mú gây nhiễm chủng QN4 có tỷ lệ chết tích lũy 82,1% sau ngày, 100% sau ngày theo dõi Đối chứng tỷ lệ chết 10% sau 15 ngày theo dõi Qua bảng cho thấy tác nhân gây chết cá NNV chủng QN4 với xuất gen T4 Bảng 3.8 Khả gây bệnh NNV cá mú 28oC ngày đêm Tỷ lệ chết cá mú (%) Xác định gen T4 Thời gian (ngày) Lần Lần Lần TB Đối chứng 0 0 0 - - 86,6 83,3 76,6 82,1 3,3 + - 100 100 100 100 6,6 + - Lơ thí Đối chứng nghiệm 6,6 - 12 10,0 - 15 10,0 - Ghi chú: +: có gen T4 -: khơng có gen T4 13 Khả gây bệnh NNV cá mú điều kiện nhiệt độ nước nuôi cá 28 C vào ban ngày 24oC vào ban đêm thể Bảng 3.9 o Bảng 3.9 Khả gây bệnh NNV cá mú 28oC ban ngày 24oC ban đêm Thời gian (ngày) Tỷ lệ chết cá mú (%) Xác định gen T4 Lần Lần Lần TB Đối chứng Lô đối chứng Đối chứng 0 0 0 - - 80,0 86,6 90,0 85,5 + - 100 100 100 100 3,3 + - 6,6 - 12 10,0 - 15 10,0 - Ghi chú: +: có gen T4 -: khơng có gen T4 Ở nhiệt độ 28oC (ban ngày) 24oC (ban đêm), tỷ lệ chết cá sau ngày 85,5% sau ngày cá chết hồn tồn Lơ đối chứng sau 15 ngày tỷ lệ chết 10% Tác nhân gây bệnh có gen T4, NNV chủng QN4 gây nhiễm 3.3 Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú 3.3.1 Thiết kế vector tái tổ hợp pET32a+- T4 Đề tài sử dụng pET 32a+ làm vector biểu gen T4, chủng E coli JM109 kiểm tra vector tái tổ hợp, chủng E coli BL21(DE3) để biểu gen T4 Quy trình tạo vector tái tổ hợp mang gen T4 (pET32a+T4) thể hình 3.9 Phản ứng cắt plasmid vector pGEM-T-T4 + plasmid pET32a thực 370C giờ, sản phẩm cắt điện di gel agarose 1% Hình 3.9 Sơ đồ quy trình tạo vector tái tổ hợp pET32a+- T4 Kết phản ứng cắt vector pGEMT-T4 vector pET32a+ thể Hình 3.10 14 Hình 3.10 Cắt vector pGEM-T-T4 (A) vector pET32a+ (B) enzyme EcoRI Giếng 1,2,3,4 (A): sản phẩm cắt plasmid pGEMT-T4; Giếng 1,2,3 (B): sản phẩm cắt plasmid pET32a+; Giếng M: Marker 1kb plus Kết Hình 3.10 (A): giếng số 1, 2, xuất hai băng, băng có kích thước khoảng 420bp (kích thước gen T4) băng có kích thước khoảng 3015bp (kích thước vector pGEM-T Easy) Hình 3.10 (B) cho thấy giếng số 1, 2, xuất băng vạch có kích thước tương đương vector pET 32a + khoảng 5900bp Như chứng tỏ cắt thành công plasmid tái tổ hợp pGEMT-T4 plasmid pET32a+ tạo vị trí tương thích để gắn gen T4 vào vector pET32a+ Băng vạch có vùng gen T4 kích thước 420bp băng vạch có vector pET32a+ kích thước 5900bp cắt để tinh Các sản phẩm cắt plasmid pGEMT-T4 vector pET32a+ điện di gel agarose 1%, kết thể Hình 3.11 Hình 3.11 Tinh sản phẩm cắt plasmid pGEM-T-T4 vector pET32a+ Giếng 1: gen T4 sau tinh sạch, Giếng 2: plasmid pET32a+ sau tinh M: 1kb Plus Ladder 15 Phản ứng nối gen thực 40C, ủ từ 14 đến 16h Để kiểm tra tạo thành vector tái tổ hợp pET32a+-T4, sản phẩm nối gen biến nạp vào tế bào E coli JM 109 Sàng lọc chủng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp mơi trường LB có bổ sung kháng sinh Ampicillin (100µg/ml), ni 37oC 16h, kết thể hình 3.12 Sau 16 tiến hành chọn sáu khuẩn lạc sang nuôi cấy 3ml mơi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh Ampicillin (100µg/ml), ni lắc với tốc độ 150 vịng/phút 370C 16h Sau tách plasmid, điện di gel agarose 1%, kết hình 3.13 Hình 3.12 Đĩa khuẩn lạc sau chuyển gen pET32a+-T4 vào E coli JM109 Tiến hành PCR với cặp mồi P1 R3 để kiểm tra sáu mẫu plasmid mang vector tái tổ hợp pET32a+- T4 mẫu vector pET32a+ (đối chứng) Kết thể hình 3.14 cho thấy sáu dịng vi khuẩn lựa chọn có mang gen T4, mẫu đối chứng khơng mang gen Như khẳng định vector tái tổ hợp pET32a+T4 thiết kế thành cơng Hình 3.13 Kiểm tra tạo thành vector pET32a+-T4 vi khuẩn E coli JM109 (Giếng 1-6: Plasmid dòng từ đến 6; Giếng M: 1kb plus ladder) Hình 3.14 Điện di sản phẩm PCR kiểm tra có mặt gen T4 vector tái tổ hợp Giếng 1-6: sản phẩm PCR plasmid pET32a+-T4 dòng đánh số từ đến 6, Giếng M: 1kb Plus ladder; Giếng ĐC: sản phẩm PCR plasmid pET32a+ 16 3.3.2 Biểu gen mã hóa kháng nguyên T4 vi rút gây hoại tử thần kinh 3.3.2.1 Tạo chủng vi khuẩn E.coli BL21 (DE3) mang gen mã hóa kháng nguyên NNV Sau tạo vector tái tổ hợp pET32a+-T4 đề tài lựa chọn bốn sáu dòng vi khuẩn để biến nạp vào chủng vi khuẩn biểu E coli BL21 (DE3) Vi khuẩn biến nạp nuôi cấy môi trường LB thạch (bổ sung kháng sinh Ampicillin 100µg/ml), ni 37oC từ 12 đến 16h, kết thể hình 3.15 Hình 3.15 Đĩa khuẩn lạc sau biến nạp pET32a+-T4 vào E.coli BL21 Để kiểm tra khả biến nạp plasmid pET32a+-T4 vào tế bào E coli BL21(DE3), tiến hành sàng lọc cách tách plasmid kiểm tra PCR Sản phẩm tách plasmid điện di gel agarose 1%, kết thể hình 3.16 Hình 3.16 Điện di đồ plasmid tái tổ hợp tách từ chủng E coli BL21(DE3) mang vector pET32a+-T4 Hình 3.17 Kiểm tra khả biến nạp vector tái tổ hợp pET32a+ -T4 vào chủng E coli BL21(DE3) Giếng 1-4: Plasmid dòng từ đến 4; Giếng 1-4: Sản phẩm PCR plasmid dòng từ Giếng M:GeneRulerTM 1kb DNA Ladder đến 4, Giếng M: GeneRulerTM 1kb DNA Ladder Thực phản ứng PCR kiểm tra mẫu plasmid mang vector pET32a+-T4 Kết điện di gel agarose 1% thể hình 3.17 cho thấy giếng từ đến xuất vạch có kích thước tương đương với kích thước gen T4 420 bp Do kết luận chủng E coli BL21(DE3) mang gen T4 NNV tạo thành công 17 3.3.2.2 Biểu gen T4 tế bào vi khuẩn tái tổ hợp Nuôi tăng sinh bậc bốn khuẩn lạc thuộc bốn dòng lựa chọn Nuôi lắc đến OD600nm dịch nuôi đạt từ 0,5 - 0,6 bổ sung chất cảm ứng IPTG Lấy canh khuẩn vi khuẩn tái tổ hợp thời điểm chưa bổ sung IPTG, sau bổ sung IPTG 2h, 4h, 6h để phân tích biểu gen mã hóa kháng nguyên điện di SDS-PAGE, kết thể hình 3.18 hình 3.19 Hình 3.18 Điện di SDS-PAGE gel polyacrylamide 15% dịng số Hình 3.19 Điện di SDS-PAGE gel polyacrylamide 15% dòng số 3, Giếng1,5: protein dòng 1,2 chưa cảm ứng IPTG; Giếng 2,3,4: protein dòng cảm ứng IPTG 2h, 4h, 6h; Giếng 6,7,8: protein dòng cảm ứng IPTG 2h, 4h, 6h Giếng M: Broad-way Multi prestained protein Marker Giếng1,5: protein dòng 3,4 chưa cảm ứng IPTG; Giếng 2,3,4: protein dòng cảm ứng IPTG 2h, 4h 6h; giếng 6,7,8: protein dòng cảm ứng IPTG 2h, 4h 6h Giếng M: Broad-way Multi prestained protein Marker Kết hình 3.18: Giếng không xuất vạch protein lạ Giếng 2,3,4 xuất băng vạch protein đậm có kích thước khoảng 17 kDa Giếng số 6,7,8 xuất băng vạch protein đậm có kích thước khoảng 25 kDa tương ứng với kích thước lý thuyết protein T4 Như dịng số biểu thành cơng gen T4 Kết hình 3.19 cho thấy: Giếng số 1,5 không xuất vạch protein lạ Các giếng 2,3,4,6,7,8 xuất băng vạch protein đậm có kích thước 25 kDa tương ứng với kích thước lý thuyết kháng nguyên protein T4 Từ kết cho thấy biểu thành công gen T4 vi khuẩn E coli BL21(DE3) dòng vi khuẩn BL21- pET32a+-T4 số 2, 3, 4; protein tái tổ hợp có kích thước 25 kDa tương ứng với kích thước lý thuyết kháng nguyên protein T4 NNV 18 Sự biểu protein gen T4 khẳng định lại phương pháp lai Western blot với kháng thể đặc hiệu kháng NNV Kết cho thấy vị trí phản ứng protein tái tổ hợp T4 với kháng thể đặc hiệu chuẩn tương ứng vạch điện di có kích thước khoảng 25 kDa (hình 2.20) Vì kết luận kháng ngun protein T4 NNV biểu thành công tế bào E coli BL21(DE3) Hình 2.20 Kết Western blot protein T4 tái tổ hợp (M: thang chuẩn; giếng 1: protein tái tổ hợp T4; giếng 2: protein T4 chuẩn Mỹ) 3.3.2.3 Đánh giá điều kiện biểu gen mã hóa kháng nguyên T4 vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh Xác định thời gian thu mẫu Tế bào E coli mang plasmid tái tổ hợp nuôi cấy, thu mẫu thời điểm sau cảm ứng 3, 12h Kết (hình 3.21) cho thấy, thu mẫu sau 3h 12h cho lượng protein hơn, mẫu thu sau 4h cho lượng protein nhiều Hình 3.21 Lượng protein tái tổ hợp T4 tổng hợp theo thời gian (M: thang protein chuẩn; Giếng 1, 2, 3: lượng protein tái tổ hợp thời điểm 3, 4, 12h) 19 Xác định nhiệt độ nuôi cấy Chủng E coli BL21-pET32a+- T4 28oC, 30oC 37oC, thu mẫu sau 4h cảm ứng Kết thể hình 3.22 cho thấy 28oC 30oC khơng xuất băng protein kích thước 25 kDa, nhiệt độ ni 37oC biểu protein tái tổ hợp T4 Hình 3.22 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả biểu protein tái tổ hợp T4 (giếng 1, 2, 3: lượng protein nuôi 28oC, 30oC 37oC, M: thang protein chuẩn) Xác định nồng độ chất cảm ứng IPTG IPTG bổ sung vào môi trường với nồng độ từ 1- mM Kết hình 3.23 cho thấy, sau cảm ứng IPTG, dòng tái tổ hợp tổng hợp lượng lớn protein có kích thước khoảng 25 kDa (kích thước lý thuyết protein T4 tái tổ hợp) Trong nồng độ IPTG khảo sát cho thấy gen T4 biểu Hình 3.23 Ảnh hưởng nồng độ IPTG đến mức độ biểu protein T4 tái tổ hợp tốt chủng cảm ứng IPTG nồng độ M: thang chuẩn, giếng - 6: nồng độ IPTG tương ứng từ 1 mM mM đến mM 20 3.3.3 Tinh kháng nguyên tái tổ hợp Kết Hình 3.24 cho thấy, tất phân đoạn dịch tinh xuất băng protein kích thước 25 kDa chứng tỏ protein T4 tinh thành công Đề tài sử dụng kháng nguyên protein T4 để thử nghiệm đánh giá khả tạo kháng thể trung hoà nhằm tạo nguyên liệu sản xuất vắc-xin phịng bệnh cho cá mú Hình 3.24 Điện di protein T4 tinh gel SDSPAGE (M: Thang protein chuẩn, giếng 1-5: kháng nguyên T4 thu pha 1, 2, 3, 4, 5) 3.3.4 Đánh giá khả tạo kháng thể kháng nguyên tái tổ hợp 3.3.4.1 Đánh giá khả tạo kháng thể kháng nguyên tái tổ hợp thỏ Khả kích thích tạo kháng thể trung hòa kháng nguyên E.coliBL21- pET32a+-T4 protein tái tổ hợp T4 thỏ trình bày Bảng 3.10 bảng 3.11 Bảng 3.10 Hiệu giá kháng thể trung hòa vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh mơ hình in vitro Thời gian thu Độ pha loãng huyết thỏ Đối huyết Đối chứng âm (CPE %) gây miễn dịch để trung hòa liều gây chứng thỏ sau nhiễm 104 TCID50 dương gây miễn dịch (CPE E.coli BL21- Protein tái tổ E.coli BL21Protein tái tổ hợp (ngày) %) pET32a+-T4* pET32a+-T4* hợp T4* T4* 98 0 ND ND 15 98 0 1: ND 25 98 0 1: 200 1: 50 35 98 0 1: 800 1: 200 45 98 0 1: 800 1: 200 60 98 0 1: 400 1:100 * (Ghi chú: Độ pha lỗng cao cho phản ứng trung hịa (khơng có hiệu ứng bệnh tích tế bào); ND: huyết khơng trung hịa vi rút cường độc) Bảng 3.10 cho thấy: Các mẫu đối chứng âm không gây hiệu ứng bệnh tích tế bào Các mẫu đối chứng dương, huyết thỏ bình thường khơng có khả trung hịa chủng QN2 cường độc, tất giếng ni cấy tế bào có xảy hiệu ứng bệnh tích tế bào (CPE) Ở lơ thí nghiệm vào ngày thứ 15, có lơ huyết gây miễn dịch E.coliBL21- pET32a+-T4 bắt đầu sinh kháng thể độ pha lỗng 1: Ở hai lơ thí nghiệm sinh kháng thể từ ngày thứ 25 sau gây miễn dịch Lô huyết thỏ 21 tiêm E.coliBL21-pET32a+-T4 trung hịa vi rút độ pha lỗng 1:200 cao so với lô huyết tiêm protein tái tổ hợp có hiệu giá trung hịa 1:50 Từ ngày thứ 35-45, hiệu giá trung hòa đạt giá trị cao hai lơ thí nghiệm, lô tiêm E.coli BL21- pET32a+-T4 cho kết hiệu giá trung hịa độ pha lỗng huyết 1:800, lơ tiêm protein T4 tái tổ hợp có hiệu giá trung hòa 1:200 Vào ngày cuối thí nghiệm (ngày thứ 60) hai lơ thí nghiệm hiệu giá trung hồ giảm, lơ tiêm E.coli BL21- pET32a+-T4 cho kết hiệu giá trung hồ 1:400, cịn lơ tiêm protein T4 tái tổ hợp có hiệu giá trung hịa 1:100 Kết xác định hiệu giá kháng thể trung hòa vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh mô hình in vivo trình bày Bảng 3.11 Bảng 3.11 Hiệu giá kháng thể trung hòa vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh mơ hình in vivo Đối chứng Thời gian thu dương huyết thỏ sau Nhiễm Chết gây miễn bệnh (%) dịch (ngày) (%) Đối chứng âm (tỷ lệ nhiễm bệnh %) E.coli BL21pET32a+T4 Protein T4 tái tổ hợp Huyết thỏ gây miễn dịch E.coli BL21- pET32a+-T4 Hiệu giá trung hòa Gen T4 Protein T4 tái tổ hợp Hiệu giá Gen T4 trung hòa 100 100 0 ND + ND + 15 100 100 0 ND + ND + 25 100 100 0 1: 100 - 1: 50 - 35 100 100 0 1: 100 - 1: 50 - 45 100 100 0 1: 100 - 1: 50 + 60 100 100 0 1: 50 + 1: 10 + (Ghi chú: ND: huyết khơng trung hịa vi rút cường độc; (+): có gen T4, (-): khơng có gen T4) Kết bảng 3.11 cho thấy hai lơ thí nghiệm huyết thỏ gây miễn dịch với E.coliBL21-pET32a+-T4 protein T4 tái tổ hợp thời gian 15 ngày đầu huyết chưa tạo kháng thể Vào ngày thứ 25 kéo dài đến ngày thứ 45 lô huyết thỏ gây miễn dịch với E.coliBL21-pET32a+-T4 có khả tiết kháng thể trung hòa NNV cường độc độ pha lỗng 1:100, kiểm tra gen mã hố kháng ngun T4 âm tính Ở lơ huyết gây miễn dịch protein T4 tái tổ hợp từ ngày 25 đến ngày 35 cho thấy độ pha loãng huyết đạt 1:50 không phát gen mã hoá kháng nguyên Tuy nhiên, ngày thứ 45, hiệu giá trung hòa huyết đạt 1:50, tồn cá mú khơng bị chết phát gen T4 Vào ngày thứ 60, hai lơ thí nghiệm huyết thỏ tạo kháng thể trung hoà độc lực làm cho vi rút khơng cịn khả gây bệnh, hiệu giá trung hồ hai lơ thí nghiệm đạt từ 1:10 đến 1:50 phát gen T4 cá thí nghiệm Từ kết cho thấy protein T4 tái tổ hợp có khả tạo kháng thể trung hoà vi rút gây bệnh kháng thể tạo thấp so với chủng vi khuẩn biểu gen mã hoá kháng nguyên E.coliBL21-pET32a+-T4 22 3.3.4.2 Đánh giá khả sinh đáp ứng miễn dịch kháng nguyên tái tổ hợp cá mú Các kết trình bày bảng 3.12 cho thấy mẫu đối chứng âm, cá gây miễn dịch với kháng nguyên E.coliBL21-pET32a+-T4 protein T4 tái tổ hợp có sinh kháng thể đặc hiệu với NNV không gây hiệu ứng bệnh tích tế bào Bảng 3.12 Hiệu giá sinh đáp ứng miễn dịch cá mú chống lại NNV mơ hình in vitro Độ pha lỗng dịch chiết cá gây miễn dịch để trung hòa NNV QN2 (104 TCID50) Lơ thí nghiệm 30 45 15 ngày 60 ngày 75 ngày 90 ngày Đối chứng dương + + + + + + Dịch chiết cá gây miễn dịch với E.coliBL21-pET32a+-T4 Dịch chiết cá gây miễn dịch với protein T4 tái tổ hợp Dịch chiết cá gây miễn dịch với E.coliBL21-pET32a+-T4 + 1:64 1:256 1:128 1:128 1:64 1:8 NNV cường độc Dịch chiết cá gây miễn dịch với protein T4 tái tổ hợp+ 1:16 1:128 1:128 1:64 1:64 1:8 NNV cường độc Ghi chú: +: có hiệu ứng bệnh tích tế bào -: khơng có hiệu ứng bệnh tích tế bào Các mẫu đối chứng dương, chủng NNV QN2 cường độc liều TCID50 =104 gây nhiễm vào tế bào GS1 tất tế bào có xảy hiệu ứng bệnh tích tế bào Các lơ thí nghiệm gây miễn dịch với E.coliBL21-pET32a+-T4 protein T4 tái tổ hợp sinh kháng thể từ ngày thứ 15 với hiệu giá tương ứng 1:64 1:16 Với thí nghiệm dịch chiết cá mú gây miễn dịch với E.coliBL21-pET32a+-T4 lượng kháng thể cao vào ngày thứ 30 đến 60, đạt hiệu giá 1:128 - 1:256 Đến ngày thứ 75 lượng kháng thể giảm, hiệu giá đạt 1:64 Ở thí nghiệm dịch chiết cá mú gây miễn dịch với protein tái tổ hợp T4 có tạo kháng thể cao ngày thứ 30 đến ngày thứ 45, đạt 1:128 Từ ngày thứ 60 đến 75 lượng kháng thể giảm dần đạt hiệu giá 1:64 Thời gian bảo hộ cá mú kéo dài đến 90 ngày hai lơ thí nghiệm Đây sở khoa học để ứng dụng sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú Hiện giới Việt Nam có loại vắc-xin sử dụng để phòng bệnh cho số lồi cá ni có giá trị kinh tế cao với quy mô nuôi công nghiệp cá hồi, cá vược, cá mú, cá tráp, cá chim chủ yếu vắc-xin bất hoạt Năm 2009, Nhật Bản Yamashita cs thử nghiệm dùng vắc-xin bất hoạt với formalin để phòng bệnh VNN cho cá mú vạch (khối lượng trung bình 25,4 g/con) Sau 20 ngày thử nghiệm tiêm vắc-xin kháng thể tạo cá lơ đối chứng khơng sản sinh kháng thể [69] Vắc-xin bất hoạt chủng RGNNV, Pakingking cs (2010) thử nghiệm tiêm để phòng bệnh VNN cho cá mú cọp nuôi thương phẩm Kết cá tiêm vắc-xin kháng thể trung hòa tạo từ ngày thứ 15 (hiệu giá 1: 800) kéo dài đến 190 ngày (hiệu giá 1:400)[51] 23 Tại Việt Nam, vắc-xin bất hoạt keo phèn dùng phòng bệnh VNN cho cá mú ni quy mơ cơng nghiệp có hiệu rõ rệt, vắc-xin có tỷ lệ bảo hộ cá điều kiện thí nghiệm đạt 83% cá giống Ngồi vắc-xin cịn sử dụng cho ni cá mú lồng ao giai đoạn thương phẩm để phòng bệnh VNN hiệu cao, tỷ lệ bảo hộ cho cá đạt 82% (Phạm Thị Tâm cs, 2015) [6] KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Qua nghiên cứu xác định 26 chủng vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh cá mú Việt Nam Các chủng vi rút xác định Nervous Necrosis Virus (NNV) thuộc họ Betanodavirus Vi rút có khả gây bệnh tích tế bào GS1, có chủng độc lực cao với TCID50 từ 10-6,8 đến 10-6,9; 10 chủng độc lực đạt TCID50 từ 10-4,8 đến 10-4,9; 10 chủng độc lực yếu, TCID50 đạt từ 10-2,7đến 10-4,3 Vi rút có khả gây bệnh cá mú, đề tài xác định chủng có độc lực cao với cá (LD50 = 10-7,5), chủng độc lực trung bình (LD50 từ 10-5,5 -10-6,5), chủng có độc lực thấp (LD50 từ 10-2,6-10-3,6) Vi rút thích nghi phát triển tốt ni cấy 220C Nhiệt độ có ảnh hưởng đến khả gây bệnh vi rút cá mú Tỷ lệ chết cá sau ngày nuôi 82,1 – 85,5%; sau ngày ni cá chết hồn tồn hai điều kiện thí nghiệm nhiệt độ 280C ngày nhiệt độ biến thiên 280C ban ngày, 240C ban đêm Đề tài tạo kháng nguyên protein T4 tái tổ hợp Kháng nguyên biểu thành công tế bào E coliBL21(DE3) có kích thước 25 kDa Protein T4 tái tổ hợp có khả tạo đáp ứng miễn dịch bảo hộ cho cá mú với hiệu giá kháng thể trung hoà đạt 1:128 từ ngày 30 đến ngày 45; kháng thể tạo kéo dài ngày thứ 90 thí nghiệm Đây sở khoa học để ứng dụng kháng nguyên protein T4 tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu điều kiện tối ưu để thu lượng protein T4 nhiều nhằm sản xuất lượng lớn kháng nguyên làm nguyên liệu phục vụ sản xuất vắc-xin sau Đánh giá khả sinh đáp ứng miễn dịch cá mú nuôi giai đoạn cá hương, cá giống để xác định thời gian bảo hộ kháng nguyên tái tổ hợp cá Trên sở kết nghiên cứu thu được, kiến nghị cho triển khai nghiên cứu chế tạo vắc-xin tái tổ hợp hệ để phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú Việt Nam 24 DANH MỤC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN TIỄN SĨ Phạm Thị Tâm, Phạm Công Hoạt, Nguyễn Thị Thu Hiền, Vũ Tiến Lâm, Nguyễn Thị Vui, Nguyễn Thị Thanh (2012), “Nghiên cứu khả gây bệnh gây đáp ứng miễn dịch virus gây bệnh hoại tử thần kinh (Nervous Necrosis Virus) cá mú nuôi Việt Nam”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, số 6, trang 81-88 Nguyễn Thị Thanh, Phạm Thị Tâm, Phạm Công Hoạt, Lê Văn Năm, Trần Thế Mưu, Nguyễn Quang Linh (2013), “Đánh giá khả tạo đáp ứng miễn dịch kháng nguyên virus gây bệnh hoại tử thần kinh”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, số 5, trang 30- 36 Nguyễn Thị Thanh, Phạm Thị Tâm, Mẫn Hồng Phước, Phạm Công Hoạt, Lê Văn Năm (2014), “Biểu gen mã hóa kháng nguyên vi rút gây hoại tử thần kinh (Nervous necrosis virus) cá mú”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, số 5, tập XXI, trang 26-32 ... nghiên cứu - Xác định vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh cá mú Vi? ??t Nam - Xác định số đặc tính sinh học vi rút gây hoại tử thần kinh cá mú - Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu. .. tiến hành thực đề tài: ? ?Nghiên cứu số đặc tính sinh học vi rút gây hoại tử thần kinh tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắc- xin phòng bệnh cho cá mú (Epinephelus spp.)” Mục... vi rút gây hoại tử thần kinh cá mú Vi? ??t Nam số đặc tính sinh học vi rút gây bệnh - Tạo kháng nguyên tái tổ hợp đánh giá khả sinh kích thích miễn dịch kháng nguyên để làm nguyên liệu phục vụ sản