NGHIÊN cứu QUY TRÌNH sản XUẤT mẫu NGOẠI KIỂM DẠNG ĐÔNG KHÔ sử DỤNG TRONG xét NGHIỆM ĐỊNH LƯỢNG HBV DNA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI LÊ NGỌC THÚY NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT MẪU NGOẠI KIỂM DẠNG ĐƠNG KHƠ SỬ DỤNG TRONG XÉT NGHIỆM ĐỊNH LƯỢNG HBV DNA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA KHÓA 2013 - 2017 HÀ NỘI - 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BỘ Y TẾ LÊ NGỌC THÚY NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT MẪU NGOẠI KIỂM DẠNG ĐÔNG KHÔ SỬ DỤNG TRONG XÉT NGHIỆM ĐỊNH LƯỢNG HBV DNA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA KHÓA 2013 - 2017 Người hướng dẫn khoa học: THS NGUYỄN QUỲNH GIAO HÀ NỘI - 2017 LỜI CẢM ƠN Với tất tình cảm kính trọng, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn tới PGS.TS Đặng Thị Ngọc Dung, người dành cho quan tâm đặc biệt tạo điều kiện thuận lợi, cho lời khuyên vô q báu giúp tơi hồn thiện nghiên cứu Xin cảm ơn Ths Nguyễn Quỳnh Giao, người trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ, động viên bảo tận tình cho tơi từ bước đầu q trình nghiên cứu hồn thành khóa luận! Tôi xin gửi lời cảm ơn tới: Các anh chị khoa xét nghiệm - Bệnh viện Đại học Y, Trung tâm kiểm chuẩn chất lượng xét nghiệm - đại học Y Hà Nội giúp đỡ có điều kiện sở vật chất để thực nghiên cứu Phòng Đào tạo Đại học Trường Đại học Y Hà Nội Khoa Kỹ thuật Y học tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập, hồn thành khoa luận Xin bày tỏ lòng kính u sâu sắc đến gia đình, người thân bạn bè bên hỗ trợ, cổ vũ, động viên hồn thành khóa luận MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT HBV : Hepatits B Virus DNA : Deoxyribonucleic acid HBsAg : Hepatitis B Surface Antigen HBc : Hepatitis B Core PCR : Polymerase chain reaction EQA : External quality assessment QA : Quality assurance QC : Quality Control IQC : Internal Quality Control ISO : International Standardization WHO Organization for : World Health Organization DANH MỤC HÌNH ẢNH DANH MỤC BẢNG BIỂU ĐẶT VẤN ĐỀ Viêm gan B bệnh lý gây virus viêm gan B (HBV hepatitis B virus) Theo Tổ chức Y tế Thế giới, năm 2013 có khoảng tỉ người nhiễm HBV có tới 240 triệu người chuyển sang mạn tính, Mỗi năm giới có khoảng 650.000 người tử vong biến chứng viêm gan B mạn, chủ yếu xơ gan ung thư biểu mô tế bào gan [1] Tại Việt Nam, tỷ lệ viêm gan B quần thể tới 10-15% đặc biệt có vùng lên đến 20% [2] Với 90% bệnh nhân dương tính với HBsAg HbeAg, định lượng HBV DNA xét nghiệm đáng tin cậy chẩn đoán theo dõi tốc độ nhân lên virus để xác định thời điểm điều trị thuốc kháng virus, đánh giá đáp ứng bệnh nhân mắc viêm gan B mạn tính [3] Trong năm gần xét nghiệm định lượng HBV DNA phương pháp Realtime PCR ngày sử dụng phổ biến Việt Nam Vì vậy, việc giám sát kiểm tra chất lượng thơng qua chương trình Ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm (External quality assessment- EQA) cần thiết Tuy nhiên, việc cung cấp mẫu cho chương trình ngoại kiểm HBV DNA Việt Nam hạn chế chưa có nhiều cơng ty cung ứng, phải nhập hồn tồn từ nước ngồi nên gặp khó khăn trình vận chuyển mẫu, giá thành mẫu ngoại kiểm cao Hiện nay, có nghiên cứu nước sản xuất mẫu ngoại kiểm HBV-DNA chúng tơi tiến hành đề tài: " Nghiên cứu quy trình sản xuất mẫu ngoại kiểm dạng đơng khô sử dụng xét nghiệm định lượng HBV DNA" với mục tiêu: Hồn thiện quy trình sản xuất mẫu ngoại kiểm dạng đông khô sử dụng xét nghiệm định lượng HBV DNA Đánh giá độ đồng nhất, độ ổn định mẫu ngoại kiểm đông khô sản xuất CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Virus viêm gan B 1.1.1 Lịch sử phát virus viêm gan B Năm 1964 Baruch Blumberg mô tả loại kháng nguyên (KN) đặc trưng thổ dân châu Đại Dương gọi “KN Australia” Đến năm 1968, nhà vi rút học Alfred Prince phát thấy máu bệnh nhân viêm gan B mãn tính có tiểu thể hình cầu hình sợi, đường kính 27nm khơng chứa ADN Đó KN bề mặt HBsAg ( hepatitis B surface antigen) Hai tiểu thể khơng phải HBV hồn chỉnh thiếu genom Năm 1970, người ta phát thấy máu bệnh nhân viêm gan B hình cầu, đường kính 42nm, bên chứa ADN kép gọi tiểu thể Dane Sau xác định tiểu thể Dane HBV thực [4] 1.1.2 Hình thái virus [5] HBV virus có cấu trúc ADN sợi kép có vỏ thuộc họ Hepadnaviridae, nhân lên gan gây nên rối loạn chức gan HBsAg có bề mặt ngồi hạt virus hồn chỉnh (hạt Dane) Nhân bên virus có chứa HBcAg, HBeAg, phân tử ADN phần sợi kép ADN polymeraza phụ thuộc ADN Trong huyết người nhiễm HBV, virus tồn dạng: - Hạt Dane: virion hồn chỉnh hình cầu, đường kính 42 nm, bên ngồi có vỏ bọc cấu tạo từ kháng nguyên bề mặt (HBsAg) với loại protein S, M, L, bên capside, đường kính 34 nm, cấu tạo từ kháng nguyên lõi (HBcAg) Bên capside có chứa nhân DNA enzyme DNA polymerase, protein kinase - Các hạt HBs: có dạng hình cầu hình ống, có kích thước thay đổi Đây protein HBs tạo dư thừa bào tương tế bào gan sau phóng thích vào máu khơng chứa DNA virus khơng gây nhiễm Hình 1.1 Cấu trúc HBV 1.1.3 Cấu trúc gen HBV HBV có gen phân tử DNA dạng vòng, chiều dài khoảng 200 bases, gồm chuỗi có chiều dài khác Chuỗi dài (ký hiệu L) nằm phía ngồi, có cực âm, tạo nên vòng tròn liên tục có chiều dài cố định 3200 bases gần khép kín, mã hóa cho thơng tin di truyền virus.Chuỗi ngắn (ký hiệu S), nằm trong, có cực dương, chiều dài thay 10 đổi 50-80% chiều dài sợi âm DNA HBV không xoắn vòng DNA virus khác mà xoắn đoạn cuối cuộn lại thành hình tròn Bộ gen HBV có cấu tạo nhỏ gọn so với chiều dài gen mà chứa đựng có xếp vùng giao gen sợi DNA âm Trên sợi DNA âm, có đoạn gen tương tứng với khung đọc mở (opening reading frame) vùng mã hóa cho tổng hợp protein bề mặt (HBsAg), protein lõi (HBeAg, HBcAg), polymerase protein X Các gen gồm: - Gen S: bao gồm vùng S, Pre-S1, Pre-S2 mã hóa cho tổng hợp kháng nguyên bề mặt HBsAg Đây vùng chủ yếu mà virus gắn lên thụ thể bề mặt tế bào gan, giúp virus xâm nhập vào bên tế bào [6] - Gen C: gồm vùng C (Core) pre-C (Pre-core), mã hóa cho tổng hợp protein nucleocapsid Sự diện HBeAg phản ánh tình trạng nhân lên virus bên tế bào gan có liên quan đến tính lây nhiễm Vì kháng ngun HBcAg khơng có đoạn peptide tín hiệu nên khơng tiết ngồi tế bào gan khơng tìm thấy huyết [7] - Gen X: mã hóa cho tổng hợp protein HBx Chức đầy đủ protein HBx chưa biết rõ có vai trò chuyển hoạt hóa q trình chép virus Do đó, protein HBx có vai trò quan trọng chế sinh ung thư tế bào gan bị nhiễm - Gen P (Polymerase): gen lớn chiếm 80% chiều dài gen, mã hóa cho enzym polymerase có vai trò quan trọng trình tổng hợp ADN trình kết hợp ARN vào nhân virus [8] 30 Rã đông tự nhiên nhiệt độ 22 oC, khuấy trộn mẫu lọc phin lọc chuyên dụng đường kính 0,22 micron Chia huyết tương tương ứng với mức nồng độ vào lọ thủy tinh thể tích ml huyết tương (vô trùng, ghi dán nhãn sẵn) Đông khô lọ huyết tương: sử dụng máy Modulyod Hoa Kỳ - Đông lạnh huyết tương -80 oC 12 - Chuẩn bị máy đông khô đạt nhiệt độ -50 oC - áp suất chân khơng đạt 0,04 mbar Lắp bình đông chứa mẫu huyết tương làm lạnh sẵn Yêu cầu thao tác nhanh để tránh tan đông Nếu đông khô nhiều mẫu, sau lần lắp cần đợi cho áp suất chân không nhiệt độ đạt chuẩn (-50 oC 0,004 mbar) tiến hành lắp bình [26] - Thời gian đơng khơ: 48h Bảo quản sau đông khô nhiệt độ -20 oC Tiến hành đánh giá độ đồng độ ổn định mẫu huyết tương sau đông khô 2.5 Đánh giá chất lượng mẫu huyết tương sản xuất Tất số liệu thu thập xử lý thống kê phần mềm Microsoft Office Excel 2016 31 2.5.1 Đánh giá độ đồng - Đánh giá độ đồng thực thời điểm sau lô mẫu đông khô sản xuất Nếu không đạt độ đồng loại bỏ tồn lơ mẫu sản xuất - Chọn 10% số mẫu (4 mẫu) cách ngẫu nhiên cho mức nồng độ - Thực phân tích mẫu lặp lại lần - Sử dụng ANOVA-test T-test để kiểm tra với khoảng tin cậy 95%, giá trị p>0.05 kết luận mẫu đạt độ đồng 2.5.2 Đánh giá độ ổn định - Đánh giá độ ổn định thực sau lô mẫu ngoại kiểm đánh giá đồng - Thực chạy kiểm tra mẫu tương ứng mức nồng độ sau tháng, phân tích lặp lại lần - Sử dụng T-test để kiểm tra với khoảng tin cậy 95%, Nếu giá trị p>0.05 kết luận mẫu đạt độ ổn định thời điểm đánh giá 32 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Chất lượng mẫu ngoại kiểm HBV DNA dạng đơng khơ Hình 3.1: trước sau hồn ngun mẫu đơng khơ Nhận xét: Mẫu đơng khơ trước hồn ngun tạo thành khối đều, xốp, khơng ẩm Mẫu sau hồn ngun màu vàng nhạt, không vẩn đục 3.2 Nồng độ mẫu huyết tương ngoại kiểm HBV DNA với mức nồng độ trước đơng khơ Hình 3.2 Biểu đồ đường chuẩn Sau PCR, giếng “Standard” phải đạt yêu cầu: • 102: Có tín hiệu huỳnh quang tuyến tính bắt đầu vượt qua tín hiệu chu kì 31-34 33 • 104: Có tín hiệu huỳnh quang tuyến tính bắt đầu vượt • qua tín hiệu chu kì 24-27 106: Có tín hiệu huỳnh quang tuyến tính bắt đầu vượt • qua tín hiệu chu kì 17-20 108: Có tín hiệu huỳnh quang tuyến tính bắt đầu vượt • qua tín hiệu chu kì 10-13 Hệ số tuyến tính R2 phải nằm khoảng 0.960 - • 1.000, tốt 0.990 - 1.000 Hệ số dốc - slope phải nằm khoảng -3 đến -4, tốt -3.3 - 3.6 Nhìn vào biểu đồ đường chuẩn, ta kết luận biểu đồ lý tưởng Các mẫu thí nghiệm đo tính nồng độ từ đường chuẩn Hình 3.2 Đường biểu diễn khuếch đại mẫu thí nghiệm 3.3 Độ đồng mẫu huyết tương ngoại kiểm HBV DNA 3.3.1 Độ đồng mẫu ngoại kiểm HBV DNA nồng độ thấp Bảng 3.1 Kết nghiên cứu mẫu nồng độ thấp 34 Mẫu Giá trị P (t-test) Nhận xét: Lần 4,31E+03 4,12E+03 5,02E+03 4,06E+03 Kết Quả Lần 4,88E+03 4,57E+03 4,84E+03 5,21E+03 > 0,05 Trung bình 4,59E+03 4,33E+03 4,93E+03 4,63E+03 Giá trị P (ANOVA) >0,05 - So sánh kết nồng độ HBV DNA mẫu khơng có - khác biết (p> 0,05) So sánh kết lần chạy lặp lại khơng có khác biết (p > 0,05) 3.3.2 Độ đồng mẫu ngoại kiểm HBV DNA nồng độ cao Bảng 3.2 Kết nghiên cứu mẫu nồng độ cao Mẫu Lần 8,35E+06 2,00E+07 9,25E+06 1,12E+07 Kết Quả Lần 7,00E+06 1,46E+07 9,12E+06 6,95E+06 > 0,05 Trung bình 7,68E+06 1,73E+07 9,19E+06 9,07E+06 Giá trị P (ANOVA) >0,05 Giá trị P (t-test) Nhận xét: - So sánh kết nồng độ HBV DNA mẫu khơng có khác - biết (p> 0,05) So sánh kết lần chạy lặp lại khơng có khác biết (p > 0,05) 3.4 Độ ổn định mẫu ngoại kiểm HBV DNA 3.4.1 Độ ổn định mẫu ngoại kiểm HBV DNA nồng độ thấp Bảng 3.3: Kết nghiên cứu độ ổn định mẫu nồng độ thấp Lần chạy Thời gian Lần Kết Quả Lần Trung Giá trị P 35 Tháng I 4,12E+0 4,57E+0 3 Tháng II 4,31E+0 4,74E+0 3 Tháng 4,53E+0 3,72E+0 III 3 bình 4,34E+0 4,52E+0 4,13E+0 >0,05 >0,05 >0,05 Nhận xét: Kết đánh giá độ ổn định mẫu nồng độ thấp thể Bảng 3.5 Từ bảng số liệu với kiểm định Ttest cho ta thấy giá trị P thời điểm đánh giá lớn giá trị P tới hạn (0,05) Điều có nghĩa chất lượng mẫu đảm bảo tính ổn định tháng 3.4.2 Độ ổn định mẫu ngoại kiểm HBV DNA nồng độ cao Bảng 3.4: Kết nghiên cứu độ ổn định mẫu nồng độ cao Lần chạy Thời gian Tháng I Kết Quả Lần Lần 8,35E+0 7,00E+0 6 Tháng II 9,25E+0 9,12E+0 6 Tháng 5,30E+0 3,27E+0 III 6 Trung bình 7,68E+0 9,19E+0 4,29E+0 Giá trị P >0,05 >0,05 >0,05 Nhận xét: Kết đánh giá độ ổn định mẫu nồng độ cao thể Bảng 3.6 Từ bảng số liệu với kiểm định Ttest cho ta thấy giá trị P thời điểm đánh giá lớn giá trị P tới hạn (0,05) Điều có nghĩa chất lượng mẫu đảm bảo tính ổn định tháng 36 CHƯƠNG BÀN LUẬN 4.1 Quy trình sản xuất mẫu ngoại kiểm dạng đông khô Trong nghiên cứu này, mẫu dương tính thu gom từ mẫu huyết tương dương tính với HBV bệnh nhân đến khám điều trị khoa Xét nghiệm - bệnh viên Đại học y Hà Nội Hiện nay, số lượng bệnh nhân đến khám điều trị HBV bệnh viện lớn, nên nguồn mẫu thuận lợi cho việc sản xuất mẫu ngoại kiểm Tuy nhiên, việc bảo quản mẫu nhiều bệnh viện chưa tốt ảnh hưởng đến chất lượng mẫu Mặc dù số nghiên cứu độ ảnh hưởng chất đến xét nghiệm định lượng HBV DNA thiết bị hãng Roche mẫu huyết tương tăng nồng độ triglycerides, bilirubin, albumin tăng nồng độ hemoglobin tới 250 mg/dL không ảnh hưởng đến kết xét nghiệm định lượng HBV, nhiên để đảm bảo tính thẩm mỹ mẫu sản xuất, loại bỏ mẫu Huyết tương sau thu thập lọc qua giấy lọc phin lọc đường kính 0,22 micron để loại bỏ vi khuẩn, cặn bẩn vẩn đục; đảm bảo chất lượng mẫu huyết tương pool đạt tiêu chuẩn Mẫu huyết tương sau lọc, trộn đều, pha thành mức nồng độ chia vào lọ thủy tinh vô khuẩn ml Các lọ đem cân để đảm bảo đồng mặt khối 37 lượng, sau để -80oC 12h (qua đêm) để chuẩn bị tiến hành đông khô Giai đoạn đông khô quan trọng việc định chất lượng độ ổn định mẫu Do cần phải tn thủ nghiêm ngặt quy trình đơng khơ, cần lưu ý giai đoạn tháo lắp nhanh chóng, đảm bảo mẫu giữ nhiệt độ âm sâu, tránh tượng tràn huyết tương khỏi lọ thủy tinh thay đổi áp suất đậy nắp kín sau đông khô tránh việc lọ đông khô hút ẩm từ ngồi mơi trường Chúng tơi tn thủ theo quy trình hướng dẫn nhà sản xuất Ngoài đặc điểm mẫu nghiên cứu thu thập từ bệnh nhân dương tính với HBV DNA nên việc đảm bảo an toàn sinh học phòng xét nghiệm để tránh lây nhiễm chéo đảm bảo mẫu đạt chất lượng Các sản phẩm cuối có mơ tả hồn tồn giống với sản phẩm huyết tương tươi đông khô nghiên cứu khác trước [27] Kết phản ánh quy trình sản xuất đạt yêu cầu lô mẫu huyết tương đơng khơ hồn tồn, sẵn sàng cho bước để đánh giá độ đồng độ ổn định 4.2 Độ đồng mẫu huyết tương ngoại kiểm dạng đông khô sử dụng xét nghiệm định lượng HBV DNA Để ứng dụng vào thực tế, mẫu huyết tương chuẩn xét nghiệm định lượng HBV DNA phải đảm bảo tính đồng tính ổn định theo quy định Những mẫu ngoại kiểm khơng đảm bảo tính đồng tính ổn định bị loại bỏ Dựa theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN ISO/IEC 17043:2011, TCVN 7366 TCVN 8245, nhà sản xuất trước lô mẫu chuẩn gửi đến đơn vị tham gia phải đánh giá độ đồng thông qua việc lấy ngẫu nhiên 10% số lượng mẫu sản xuất [28-31] Trong nghiên cứu lấy 38 ngẫu nhiên lọ mẫu sản xuất mức 2, tiến hành hồn ngun mẫu với nước cất lần, sau định lượng nồng độ HBV DNA hệ thống Lightcycler 480 hãng Roche, lọ mẫu phân tích lặp lại lần để đánh giá độ đồng mẫu sản xuất được[32 ] Trong nghiên cứu chúng tôi, so sánh kết nồng độ HBV DNA hai lần chạy lặp lại mẫu với kết mẫu lần chạy lặp lại khơng có khác biệt (p > 0.05) Như vậy, kết luận mẫu đơng khơ hồn tồn đồng đủ điều kiện để đánh giá độ ổn định mẫu 4.3 Độ ổn định mẫu huyết tương ngoại kiểm dạng đông khô sử dụng xét nghiệm định lượng HBV DNA Song song với độ đồng nhất, mẫu chuẩn phải đạt yêu cầu độ ổn định Nghiên cứu độ ổn định mẫu huyết tương dựa theo quy trình đánh giá độ ổn định tiêu chuẩn Việt Nam 9596-2013 (tương đương với ISO 13528- 2003): thời điểm đánh giá độ ổn định, lựa chọn ngẫu nhiên ba mẫu lô sản xuất thực phân tích mẫu lặp lại Các kết vừa thu được so sánh thống kê với kết thu từ bước đánh giá độ đồng (được xem nồng độ ban đầu mẫu) Nếu hai dãy kết khơng có khác biệt mang ý nghĩa thống kê kết luận mẫu ổn định thời điểm đánh giá Nghiên cứu độ ổn định mẫu ngoại kiểm HBV DNA điều kiện nhiệt độ bảo quản khác khảo sát NIBSC (The National Institute for Biological Standards and Control) tiến hành sau: Các mẫu bảo quản nhiệt độ -70 oC, -20oC, oC, 20 oC, 37 oC 45 oC Vào thời điểm 11 tuần, 12 tháng, 30 tháng 60 tháng, tiến hành lẫy mẫu lô bảo quản để đánh giá Kết thu cho thấy: tháng 12, mẫu bảo quản nhiệt độ 37 oC 45 oC khơng thể hồn ngun; với 39 khoảng tin cậy 95%, mẫu bảo quản nhiệt độ -70 oC, -20oC, oC 20 oC cho thấy ổn định khơng có khác biệt điều kiện bảo quản đến 60 tháng [33] Nghiên cứu rằng, mẫu huyết tương ngoại kiểm dạng đông khô cho xét nghiệm HBV DNA có độ ổn định dài hạn điều kiện bảo quản khác Tuy nhiên nghiên cứu này, tiến hành bảo quản mẫu sản xuất -20 oC mà chưa thể tiến hành so sánh để tìm điều kiện bảo quản tối ưu Vì lí kinh phí đề tài hạn chế, hóa chất cho xét nghiệm định lượng HBV DNA tương đối đắt tiền, nên nghiên cứu chúng tôi, thời điểm cần đánh giá độ ổn định tháng, tiến hành lấy mẫu nồng độ cao thấp, mẫu hồn ngun phân tích lặp lại lần Kết thời điểm so sánh thống kê với kết mẫu đánh giá độ đồng Các giá trị p thu thời điểm đánh giá độ ổn định mức nồng độ lớn 0,05 Điều chứng tỏ mẫu ngoại kiểm sản xuất ổn định tháng Theo Trần Hữu Tâm cộng sự, nồng độ HBV DNA mẫu huyết đông khô bảo quản 4oC hoàn toàn ổn định 90 ngày kể từ ngày sản xuất Như nghiên cứu này, nồng độ HBV DNA nồng độ bảo quản -20oC ổn định tháng kết hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu Trần Hữu Tâm [34] Theo báo cáo từ Hội đồng chuyên gia tiêu chuẩn sinh học Tổ chức Y tế Thế giới tổ chức Geneva công bố năm 2011, mẫu ngoại kiểm HBV DNA sản xuất bảo quản -20 oC hoàn toàn ổn định phù hợp cho sử dụng dài hạn (60 tháng) Kết nghiên cứu gần khơng có thay đổi tháng 60 so với giá trị ban đầu Điều giải thích quy trình sản xuất phương pháp đo nhóm nghiên cứu 40 chuẩn hóa tối ưu Kết nghiên cứu cho thấy HBV DNA ổn định dài hạn mẫu huyết tương đơng khơ, nghiên cứu chúng tơi hồn toàn phù hợp với WHO [33] KẾT LUẬN Từ kết thí nghiệm phân tích đây, chúng tơi rút số kết luận sau: • Hồn thiện quy trình sản xuất mẫu ngoại kiểm dạng đông khô sử dụng xét nghiệm định lượng HBV DNA • Các mẫu sản xuất hồn tồn đảm bảo tính đồng độ ổn định TÀI LIỆU THAM KHẢO WHO, Guidelines for the prevention, care and treatment of persons with chronic hepatitis B infection, March 2015 Hà, L.Đ., Một số đặc điểm dịch tễ học lâm sàng hậu viêm gan virus B, 1999, Tạp chí thơng tin y dược Hollinger, F.L., Hepatitis B virus 2001: Philadelphia, PA: Lippincott-Raven Ty, P.V., Virut học 2005, Hà Nội: NXB giáo dục Gavilanes F, G.-R.A., Peterson D, Structure of hepatitis B surface antigen: components and characterization their association of with the the lipid viral proteins PubMed, 1982 Hatton T, Z.S., RNA- and DNA-binding activities in hepatitis B virus capsid protein: a model for their roles in viral replication 1992 Milich D, L.T., Exploring the biological basis of hepatitis B e antigen in hepatitis B virus infection PubMed, 2003 Bùi Ðại, N.V.M., Nguyễn Hoàng Tuấn, Bệnh học truyền nhiễm2005: NXB y học FJ, M., Update prevention on diagnosis, management, and of hepatitis B virus infection Clinical Microbiology Reviews, 1999( 12) 10 Ganem D, P.A., Hepatitis B virus infection- Natural History and Clinical consequences New England Journal of Medicine, 2004 11 Đại, B., Viêm gan virus B D2002: Nhà xuất Y học 12 guideline, A.p., Chronic Hepatitis B 2009 13 Hwang EW, C.R., Global Epidemiology of Hepatitis B virus (HBV) Infection North American Journal of Medicine of Science, 2011 14 Viêm gan B điều cần biết, 2016, Tổ chức y tế giới khu vực Tây Thái Bình Dương 15 Hướng dẫn chẩn đốn điều trị bệnh viêm gan vi rút B, 2014, Bộ Y Tế 16 Overview of External Quality Assessment (EQA), WHO 17 Tâm, T.H., Ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm2012: Nhà xuất Y học TP Hồ Chí Minh 18 Available from: http://freezedrying.com/freeze- dryers/general-principles-of-freeze-drying 19 Nireesha GR, D.L., Sowmya C et al Lyophilization/Freeze Drying-An Review Inter J Novel Trends in Pharm Sci, 2013 20 Fundamentals for External Quality Assessment (EQA), International Federation of Clinical Chemistry (IFCC) 21 statistical methods for use in proficiency testing by interlaboratory comparison, 2015, Iso 15328 22 Reference materials -General and statistical principles for certification, 2006, ISO Guide 35 23 Dương, H.T., Sinh học phân tử (Khái niệm, phương pháp ứng dụng)2002: Nhà xuất Giáo dục 24 Văn, T.T., PCR số kỹ thuật y sinh học phân tử2010: nhà xuất y học Hà Nội 25 Manit Arya, I.S.S., M Williamson, L Gommersall, N Aryaand Hitendra RH Patel, Basic principles of real-time quantitative PCR 2005 26 Ngơ Duy Thìn Trịnh Bình, P.T.D., Đỗ Trung Phấn, Nghiên cứu xây dựng quy trình đơng khơ huyết tương tươi dùng cho điều trị bệnh máy đông khô LY3-TTE/ DM8 Hà Lan, 2007, TCNCYH 27 Việt, L.T.T., nghiên cứu quy trình đơng khô huyết tương đánh giá số số hóa sinh đơng máu huyết tương đơng khơ., 2007: 28 WHO/CLSI/CDC, WHO Laboratory quality management system: handbook WHO Guidelines, 2011 29 Snell, J., D Brown, and L Robert, Quality Assurance: Principle and Practice in the Microbiology Laboratory Public Health Laboratory Service, 2000 46: p 77-90 30 KH&CN, B and T.I.I 17043:2011, Đánh giá phù hợpYêu cầu chung thử nghiệm thành thạo Bộ KH&CN, 2011 31 KH&CN, B and TCVN8245:2009, Mẫu chuẩn - nguyên tắc chung nguyên tắc thống kê chứng nhận Bộ KH&CN, 2009 32 TCVN8245:2009, Mẫu chuẩn: Nguyên tắc chung nguyên tắc thống kê chứng nhận TCVN, 2009 33 Jacqueline F Fryer, R.M., Thomas Dougall, Peter Rigsby, Clare L.Morris, Collaborative Study to Evaluate the Proposed WHO 4th International Standard for Hepatitis B Virus (HBV) DNA for Nucleic Acid Amplification Technique (NAT) based assays, 2016 34 Tâm, T.H., Nghiên cứu sản xuất mẫu kiểm chuẩn sử dụng cho chương trình ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm PCR HBV - HCV, 2013 ... nghiên cứu nước sản xuất mẫu ngoại kiểm HBV- DNA tiến hành đề tài: " Nghiên cứu quy trình sản xuất mẫu ngoại kiểm dạng đơng khơ sử dụng xét nghiệm định lượng HBV DNA" với mục tiêu: Hồn thiện quy. .. mục tiêu: Hồn thiện quy trình sản xuất mẫu ngoại kiểm dạng đông khô sử dụng xét nghiệm định lượng HBV DNA Đánh giá độ đồng nhất, độ ổn định mẫu ngoại kiểm đông khô sản xuất CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI... TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BỘ Y TẾ LÊ NGỌC THÚY NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT MẪU NGOẠI KIỂM DẠNG ĐÔNG KHÔ SỬ DỤNG TRONG XÉT NGHIỆM ĐỊNH LƯỢNG HBV DNA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA KHÓA 2013