Nghiên cứu quy trình sản xuất mẫu huyết thanh đặc hiệu Toxocara canis để sử dụng ngoại kiểm

Sản xuất thử nghiệm mẫu huyết thanh đặc hiệu Toxocara canis theo phương pháp đông khô và đông lạnh. Đánh giá tính đồng nhất và độ ổn định của mẫu huyết thanh sản xuất theo phương pháp đông khô và đông lạnh.

Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT MẪU HUYẾT THANH ĐẶC HIỆU TOXOCARA CANIS ĐỂ SỬ DỤNG NGOẠI KIỂM Vũ Quang Huy*,**, Nguyễn Nhật Giang*** TÓM TẮT Mục tiêu: Sản xuất thử nghiệm mẫu huyết đặc hiệu Toxocara canis theo phương pháp đơng khơ đơng lạnh Đánh giá tính đồng độ ổn định mẫu huyết sản xuất theo phương pháp đông khô đông lạnh Phương pháp: Sàng lọc mẫu huyết có kháng thể kháng Toxocara canis kỹ thuật ELISA; khẳng định độ đặc hiệu kháng thể kháng Toxocara canis kỹ thuật Western blot Sản xuất mẫu thử nghiệm phương pháp đông khô đông lạnh Đánh giá đồng phép phân tích phương sai yếu tố độ ổn định phép kiểm định t – test Kết quả: 11 mẫu huyết có kháng thể kháng Toxocara canis nồng độ cao: từ 31,517 NTU đến 56,581 NTU sàng lọc ELISA Khẳng định độ đặc hiệu kháng thể kháng Toxocara canis Western blot: 01 mẫu âm tính 10 mẫu dương tính Mẫu huyết đặc hiệu Toxocara canis đưa vào sản xuất lô mẫu: lô mẫu đông khô nồng độ 31,012 NTU; lô mẫu đông lạnh nồng độ 27,184 NTU Sản xuất phương pháp đông khô đông lạnh đạt độ đồng có ý nghĩa thống kê Fisher Mẫu huyết sản xuất phương pháp đông khô đạt độ ổn định tháng bảo quản nhiệt độ ­80°C với p > 0,05 Mẫu huyết sản xuất phương pháp đông lạnh đạt độ ổn định tháng bảo quản nhiệt độ­80°C với p > 0,05 Mẫu huyết sản xuất phương pháp đông khô đông lạnh đạt độ ổn định nhiệt độ 30°C thời gian ngày với p > 0,05 Kết luận: Sản xuất mẫu huyết đặc hiệu Toxocara canis theo phương pháp đông khô đông lạnh để sử dụng ngoại kiểm Mẫu sản xuất theo phương pháp đông khô đông lạnh đạt tính đồng độ ổn định: mẫu đơng khô ổn định tháng, mẫu đông lạnh ổn định tháng nhiệt độ bảo quản ­80°C; mẫu ổn định ngày nhiệt độ 30°C Từ khoá: Toxocara canis, ngoại kiểm, ELISA, Western blot ABSTRACT RESEARCH PROCESS OF PILOT PRODUCTION SERUM HAS TOXOCARA CANIS SPECIFIC ANTIBODIES USING FOR EXTERNALQUALITY ASSESSMENT Vu Quang Huy, Nguyen Nhat Giang * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol 22 - No 5- 2018: 213 – 218 Objectives: To produce pilot batches of anti­Toxocara canis specific antibodies serum by freeze­drying and freezing methods To evaluate homogeneity and stability of serum samples produced by freeze­drying and freezing methods Methods: Serum samples were screened for anti­Toxocara canis antibodies by ELISA, then the presence of anti­Toxocara canis specific antibodies was confirmed by Western blot Samples were produced in pilot production by using freeze­drying and freezing methods Homogeneity and stability of final samples were Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 213 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 evaluated by F test and t­test, respectively Results: 11 serum samples containing high concentrations of anti­Toxocara canis antibodies ranging from 31.517 NTU to 56.581 NTU were screened; and the specificity of anti­Toxocara canis antibodies was confirmed by Western blot: 01 negative sample, 10 positive samples Two anti­Toxocara canis specific antibodies serum sample plots were produced: by freeze­drying method with the concentration of 31.012 NTU; and by freezing method with concentration of 27.184 NTU Serum samples produced by freeze­drying and freezing were homogeneity with F test Serum samples produced by freeze­drying were stable for month when stored at ­80°C with p > 0.05 Serum samples produced by freezing were stable for months when stored at ­80°C with p > 0.05 Samples produced by either method were stable for days at 30°C with p > 0.05 Conclusions: Production of anti­Toxocara canis specific antibodies serum samples by freeze­drying and freezing method using for external quality assessment is feasible Samples produced by freeze­drying and freezing were homogeneous and stable: freeze­dried samples were stable for month, frozen samples were stable for months at ­80°C; Samples were stable for days at 30°C Keywords: EQA, Toxocara canis, ELISA, Western blot đơng lạnh ĐẶT VẤN ĐỀ Phòng xét nghiệm hệ thống phức tạp liên quan đến nhiều người bao gồm nhiều hoạt động sản phẩm kết xét nghiệm Nếu kết xét nghiệm khơng xác gây hậu nghiêm trọng Theo khuyến cáo CLSI, CDC, WHO(9): để đảm bảo chất lượng kết xét nghiệm cần tiến hành nội kiểm tra ngoại kiểm tra chất lượng Đánh giá tính đồng độ ổn định mẫu huyết sản xuất theo phương pháp đông khô đông lạnh Ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm triển khai rộng rãi lĩnh vực xét nghiệm: hoá sinh, huyết học, vi sinh… Tuy nhiên, ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm ký sinh trùng, đặc biệt huyết chẩn đoán ký trùng có huyết chẩn đốn Toxocara canis (ELISA) nhiều hạn chế: nay, chưa có cơng trình cơng bố mẫu ngoại kiểm ký sinh trùng nước.Vì vậy, tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu quy trình sản xuất mẫu huyết đặc hiệuToxocara canis để sử dụng ngoại kiểm” nhằm sản xuất mẫu huyết đạt tiêu chuẩn theo ISO/IEC 17043:2011(3,8): độ đặc hiệu, tính đồng nhất, độ ổn định để sử dụng chương trình ngoại kiểm huyết học chẩn đốn ký sinh trùng Toxocara canis Mẫu huyết có kháng thể kháng Toxocara canis Mục tiêu nghiên cứu Sản xuất thử nghiệm mẫu huyết đặc hiệu Toxocara canis theo phương pháp đông khô 214 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu thực nghiệm Đối tượng nghiên cứu Tiêu chuẩn chọn mẫu Mẫu huyết lấy phương pháp đảm bảo vơ khuẩn, mẫu dương tính với Toxocaracanis, sàng lọc kháng nguyên HBsAg, anti-HCV anti-HIV 1/2 Mẫu huyết khơng có chất chống đơng, khơng bị tán huyết không đục màu Mẫu huyết lấy không 48 bảo quản tủ lạnh – 8°C kể từ lấy mẫu thu thập mẫu Phương pháp tiến hành Thu thập mẫu, lưu trữ -80°C Loại trừ tác nhân nhiễm trùng Sàng lọc mẫu có kháng thể kháng Toxocara canis kỹ thuật ELISA (Toxocara IgG ELISA – NOVATEC Immundiagnostica GMBH – REF: TOCG0450; LOT: TOCG-061) Khẳng định độ đặc hiệu kháng thể kháng Toxocaracanis có nguyên liệu sản Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 xuất kỹ thuật Western blot(1) (Toxocara IgG Western blot – LDBIO Diagnostics, FRACE – SN: KTX12-00239; LOT: P01003-12T-016) Phân phối mẫu vào eppendorf, mẫu 100µl Tiến hành đơng khơ/ đơng lạnh mẫu: đông khô điều kiện nhiệt độ -40°C, áp suất 0,129 mBar 18 giờ; đông lạnh nhiệt độ -80°C 24 Nghiên cứu Y học tương ứng với mẫu chứng dương,đặc hiệu Toxocara canis Bảng Kết đánh giá độ đặc hiệu kháng thể kháng Toxocara canis ELISA Stt Mã số mẫu Cut off Chứng dương OD NTU Kết luận TXA01 0,547 2,178 39,817 TXA02 0,547 3,038 55,539 + Độ ổn định dài hạn: bảo quản tủ lạnh – 8°C tủ đông -80°Cđể đánh giá độ ổn định sau tháng, tháng TXA03 0,547 2,609 47,697 TXA04 0,547 2,864 52,358 + Độ ổn định ngắn hạn: để đánh giá tác động yếu tố nhiệt độ thời gian vận chuyển mẫu đến đơn vị, giả định nhiệt độ trình vận chuyển 30°C, đánh giá mẫu sau ngày, ngày TXA05 0,547 3,095 56,581 TXA06 0,547 3,039 55,558 TXA07 0,547 2,988 54,625 TXA08 0,547 1,724 31,517 10 TXA09 0,547 2,341 42,797 11 TXA10 0,547 1,909 34,899 12 TXA11 0,547 2,559 46,782 Đánh giá tính đồng nhất, độ ổn định: số liệu từ kết Toxocara IgG ELISA Thu thập xử lý số liệu Số liệu xử lý phần mềm Microsoft Excel 2010 SPSS 20.0 Sử dụng phân tích one way ANOVA để đánh giá tính đồng t-test để đánh giá độ ổn định mẫu huyết sản xuất WESTERN BLOT Dương tính Dương tính Dương tính Dương tính Dương tính Dương tính Dương tính Dương tính Dương tính Dương tính Dương tính Dương tính Âm tính Dương tính Dương tính Dương tính Dương tính Dương tính Dương tính Dương tính Dương tính Dương tính Dương tính KẾT QUẢ Sản xuất thử nghiệm mẫu huyết đặc hiệu Toxocara canis theo phương pháp đông khô đơng lạnh 11 mẫu huyết có kháng thể khángToxocara canisxác định kỹ thuật ELISA có nồng độ cao sàng lọc: thấp mẫu TXA08 với 31,517 đơn vị NTU; cao mẫu TXA05 với 56,581 đơn vị NTU Khẳng định kháng thể đặc hiệu kháng Toxocara canis kỹ thuật Western blot(1): mẫuTXA01 (bảng 1, hình 1) xuất băng nhóm 100 – 200 kDa, băng nhóm 70 – 90 kDa, không đặc hiệu Toxocara canis;mẫu TXA02, TXA03, TXA04, TXA05, TXA06, TXA07, TXA08, TXA09, TXA10, TXA11 (bảng 1, hình 1) xuất băng nhóm băng có trọng lượng phân tử thấp 24 – 35 kDa, Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học Hình Kết xét nghiệm Western blot Toxocara sp Mẫu huyết chứa kháng thể đặc hiệu kháng Toxocara canis phân phối vào eppendorf xử lý đông khô/ đông lạnh Kết quả, sản xuất lô mẫu huyết đặc hiệu Toxocara canis: Mẫu đông khô: 100 mẫu, mẫu tích trước đơng khơ 100µl huyết thanh, nồng độ ban đầu 31,012 NTU Mẫu đông lạnh: 100 mẫu, mẫu 215 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 tích 100µl huyết thanh, nồng độ ban đầu 27,184 NTU Kết đánh giá độ đồng Bảng Đánh giá độ đồng mẫu sản xuất phương pháp đông khô đơng lạnh Chỉ số Trung bình (NTU) SD CV (%) F thực nghiệm F lý thuyết Mẫu đông khô Mẫu đông lạnh 31,012 27,184 1,140 0,994 3,68 3,66 2,517 0,591 Với k1 = 9, k2 = 10, α = 0,05 ta có F = 3,02 Lơ mẫu sản xuất phương pháp đơng khơ có giá trịF thực nghiệm = 2,517 < F lý thuyết = 3,02; lô mẫu sản xuất phương pháp đơng lạnh có giá trị F thực nghiệm = 0,591 < F lý thuyết = 3,02 Mẫu sản xuất phương pháp đông khô đông lạnh đạt tính đồng Mẫu sản xuất theo phương pháp đơng lạnh có độ lệch chuẩn = 0,994 hệ số biến thiên = 3,66% thấp so với mẫu sản xuất phương pháp đơng khơ có độ lệch chuẩn = 1,140 hệ số biến thiên = 3,68% Kết đánh giá độ ổn định Bảng Độ ổn định mẫu đông khô đông lạnh theo thời gian nhiệt độ Thời Chỉ điểm số Mẫu đông khô -80°C - 8°C Mẫu đông lạnh -80°C - 8°C Trung 28,853 27,301 26,078 bình 31,865 (NTU) SD 1,411 1,173 0,320 0,900 tháng CV 4,43 4,07 1,17 3,50 (%) P 0,140>0,050,0000,05 0,023 0,05 0,251 > 0,05 ngày Trung bình 25,501 26,312 (NTU) SD 0,660 1,045 CV (%) 2,59 3,97 P 0,860 > 0,05 0,305 > 0,05 Ở điều kiện vận chuyển giả định có nhiệt độ 30°C, mẫu sản xuất theo phương pháp đông khô đông lạnh đạt độ ổn định ngày BÀN LUẬN Sản xuất thử nghiệm mẫu huyết đặc hiệu Toxocara canis theo phương pháp đông khơ đơng lạnh Quy trình sản xuất mẫu huyết có kháng thể kháng Toxocara canis thu thập nguyên liệu sản xuất Đề tài nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện sản xuất bảo quản khác lên mẫu huyết lấy từ bệnh nhân, không thêm chất bảo quản Nguyên liệu huyết người lựa chọn tốt lại khuyến cáo sử dụng trường hợp huyết động vật khơng thích hợp có độ nhiễu cao để đảm bảo vấn đề y đức Đáp ứng miễn dịch Toxocara sp lồi động vật: chó, mèo, thỏ vật chủ người hoàn toàn khác nhau(4,5,7) Nghiên cứu này, sử dụng huyết người, lấy từ bệnh nhân Nguyên liệu sản xuất huyết Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 có màu vàng trong, khơng lẫn máu, khơng đục, không tiêu huyết Những mẫu huyết với nồng độ 10 mg/ml hemoglobin, mg/ml triglycerid 0,2 mg/ml bilirubin gây nhiễu cho kết ELISA Mẫu sản xuất có kết sàng lọc HbsAg, anti – HCV anti – HIV 1/2 âm tính, nhiên cần xử lý giống mẫu nhiễm Nghiên cứu đánh giá độ đặc hiệukháng thể kháng Toxocara canis 11 mẫu có kết xét nghiệm ELISA dương tính cao Kết cho thấy 11 mẫu xuất băng 15 – 200 kilodaltons (kDa) tương ứng với kháng thể kháng kháng nguyên ngoại tiết TES Toxocara canis Trong 11 mẫu nghiên cứu, có mẫu xuất băng nhóm băng có trọng lượng phân tử cao 100 – 200 kDa 70 – 90 kDa, băng khơng đặc hiệu cho bệnh giun đũa chó mèo, có phản ứng chéo với nhiễm loại giun, sán khác Do đó, việc khẳng định độ đặc hiệu kháng thể kháng Toxocara canis nguyên liệu sản xuất mẫu ngoại kiểm cần thiết, để loại trừ trường hợp dương tính giả 10 mẫu xuất băng nhóm băng có trọng lượng phân tử thấp 24 – 35 kDa, băng đặc hiệu Toxocara canis, phù hợp với nghiên cứu đối tượng này(1,10) Các giai đoạn thực theo ISO/IEC 17043:2011(3,8) việc đánh giá phù hợp – Yêu cầu chung thử nghiệm thành thạo Và chúng tơi đánh giá tính đồng độ ổn định mẫu sản xuất theo ISO 13528:2015(2) Độ đồng ổn định lô mẫu sản xuất theo phương pháp: đông khô đông lạnh Đây hai phương pháp sử dụng phổ biến trình sản xuất mẫu ngoại kiểm giới phương pháp cho kết lô mẫu sản xuất đạt tính đồng Mẫu sản xuất phương pháp đơng lạnh có tính đồng cao so với mẫu sản xuất phương pháp đông khô Điều hợp lý nguyên liệu sản xuất mẫu huyết lấy Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học Nghiên cứu Y học từ người, khơng thêm chất bảo quản, giữ nguyên chất đảm bảo tính đồng Mẫu sản xuất theo phương pháp đơng khơ có tính đồng thấp ảnh hưởng q trình xử lý đơng khơ mẫu kỹ thuật hoàn nguyên mẫu Về độ ổn định dài hạn, lơ mẫu sản xuất theo phương pháp đơng lạnh có độ ổn định cao lô mẫu sản xuất theo phương pháp đông khô: liên kết hydro nước góp phần đáng kể vào ổn định cấu trúc protein Trong trường hợp này, phương pháp đông khô, với loại trừ nước thường gây bất ổn định mặt vật lý protein Hơn nữa, sau đông khô thành công, cấu trúc protein trải qua loạt bất ổn định bao gồm: tổng hợp, oxy hóa, phản ứng Maillard thủy phân; đó, độ ổn định dài hạn phương pháp đơng khơ hạn chế, đặc biệt nhiệt độ lưu trữ cao Những vấn đề bất ổn trình đơng khơ lưu trữ giảm thiểu cách lựa chọn pH, hàm lượng ẩm lại, quan trọng chất ổn định giúp ngăn chặn đóng băng mơ phá huỷ tế bào trình làm lạnh(6) KẾT LUẬN Đã xuất lô mẫu huyết đặc hiệu Toxocara canis theo phương pháp đông khô đông lạnh để sử dụng ngoại kiểm: lô - mẫu đông khô, nồng độ ban đầu 31,012 NTU; lô mẫu đông lạnh, nồng độ ban đầu 27,184NTU Mẫu sản xuất theo phương pháp đông khô đông lạnh đạt tính đồng độ ổn định.Mẫu sản xuất phương pháp đơng lạnh có tính đồng độ ổn định cao mẫu sản xuất phương pháp đông khô: nhiệt độ -80°C, mẫu sản xuất phương pháp đông khô ổn định tháng, mẫu sản xuất phương pháp đông lạnh ổn định tháng Ở nhiệt độ 30°C, mẫu sản xuất theo phương pháp ổn định ngày TÀI LIỆU THAM KHẢO Fillaux J, Magnaval JF (2013) Laboratory diagnosis of human toxocariasis, Vet Parasitol, vol 193, no 4, 327-336 217 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 ISO 13528 (2015), “Statistical methods for use in proficiency testing by interlaboratory comparisons”, International Organization for Standardization, First edition ISO/IEC 17043:2011(2011), “Conformity assessment General requirements for proficiency testing”, International Organization for Standardization, First edition Nguyen HH, Vo DT, Thai TT, Le TT, Le TD, Hoang NS (2017) "The 33.1 kDa Excretory/secretory Protein Produced by Toxocara canis Larvae Serves as a Potential Common Biomarker for Serodiagnosis of Toxocariasis in Paratenic Animals and Human" Iran J Parasitol, 12 (1), 69-82 Roldan WH, Espinoza YA (2009) "Evaluation of an enzymelinked immunoelectrotransfer blot test for the confirmatory serodiagnosis of human toxocariasis" Mem Inst Oswaldo Cruz, 104 (3), 411-8 Song JG, Lee SH, Han HK (2016) "Biophysical evaluation of aminoclay as an effective protectant for protein stabilization during freeze-drying and storage" Int J Nanomedicine, 11, 6609-6619 218 Sudhakar NR, Samanta S, Sahu S, Raina OK, Gupta SC, Goswami TK, et al (2014) "Characterization of excretorysecretory antigens of adult Toxocara canis by western blotting" J Parasit Dis, 38 (2), 166-9 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN ISO/IEC 17043:2011(2011), Đánh giá phù hợp – Yêu cầu chung thử nghiệm thành thạo, Nhà xuất Hà Nội, - 11 Who (2011) Laboratory quality management system: handbook 10 Zibaei M, Firoozeh F, Bahrami P, Sadjjadi SM (2013), Investigation of Anti-Toxocara Antibodies in Epileptic Patients and Comparison of Two Methods: ELISA and Western Blotting, Epilepsy Res Treat, vol 2013, p 1-5 Ngày nhận báo: 31/07/2018 Ngày phản biện nhận xét báo: 31/08/2018 Ngày báo đăng: 20/10/2018 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học ... trình cơng bố mẫu ngoại kiểm ký sinh trùng nước.Vì vậy, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài Nghiên cứu quy trình sản xuất mẫu huyết đặc hiệuToxocara canis để sử dụng ngoại kiểm nhằm sản xuất. .. kháng thể kháng Toxocara canis Mục tiêu nghiên cứu Sản xuất thử nghiệm mẫu huyết đặc hiệu Toxocara canis theo phương pháp đông khô 214 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu thực nghiệm... Western blot Toxocara sp Mẫu huyết chứa kháng thể đặc hiệu kháng Toxocara canis phân phối vào eppendorf xử lý đông khô/ đông lạnh Kết quả, sản xuất lô mẫu huyết đặc hiệu Toxocara canis: Mẫu đơng