NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT KHÁNG HUYẾT THANH CHẨN ĐOÁN LỴ TRỰC KHUẨN

Lỵ trực khuẩn (Shigella) là vi khuẩn chính gây ra các bệnh tiêu chảy và kiết lỵ trong cộng đồng, là bệnh nhiễm trùng cấp tính gây nên ở ruột già và đoạn cuối ruột non



ĐOÀN HUỲNH QUỐC VIỆT

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT KHÁNG HUYẾT THANH CHẨN ĐOÁN LỴ

TRỰC KHUẨN

Chuyên ngành : SINH HỌC THỰC NGHIỆM

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS PHAN BỔN

Đà Lạt - 2008

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Phan Bổn, Trưởng phòng Kháng huyết thanh chẩn đoán – Công ty Vắc xin Pasteur Đà Lạt Thầy đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn đến:

Ban giám hiệu và Quý thầy cô khoa Đào tạo Sau đại học trường Đại học Đà lạt đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường

PGS.TS Đào Xuân Vinh, Giám Đốc Công ty Vắc xin Pasteur Đà Lạt

đã động viên và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học

Anh chị em đồng nghiệp phòng Kháng huyết thanh chẩn đoán đã cùng tôi chia sẽ những khó khăn trong suốt thời gian thực hiện đề tài Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình tôi, đồng nghiệp, bạn bè, những người đã luôn khuyến khích tạo điều kiện thuận lợi và hết lòng ủng hộ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu khoa học

Xin chân thành cảm ơn tất cả !

Đà Lạt, ngày 25 tháng 11 năm 2008

Đoàn Huỳnh Quốc Việt

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả luận văn

Đoàn Huỳnh Quốc Việt

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn 1

Lời cam đoan 2

Mục lục 3

Danh mục các ký hiệu, chữ ký viết tắt 6

Danh mục các bảng 7

Danh mục các hình 8

MỞ ĐẦU 9

Chương 1 TỔNG QUAN 11

1.1 Bệnh lỵ trực khuẩn 11

1.2 Đặc điểm sinh học của Shigella 15

1.2.1 Hình thể và tính chất bắt màu 15

1.2.2 Tính chất nuôi cấy 15

1.2.3 Tính chất sinh hóa 16

1.2.4 Cấu trúc kháng nguyên của Shigella 16

1.3 Bệnh học 21

1.3.1 Sự xâm nhập của trực khuẩn Shigella vào tế bào biểu mô 21

1.3.2 Sự lan truyền của Shigella bên trong nội bào và gian bào 22

1.4 Miễn dịch 23

1.4.1 Kháng nguyên 23

1.4.2 Tá chất – chất hỗ trợ đáp ứng miễn dịch 25

1.4.3 Kháng thể 27

1.4.4 Cơ chế hình thành kháng thể miễn dịch 30

1.4.5 Miễn dịch với Shigella 33

1.5 Chẩn đoán 36

1.5.1 Chẩn đoán lâm sàng 36

1.5.2 Chẩn đoán vi sinh 37

1.5.3 Chẩn đoán huyết thanh 37

1.6 Tình hình sản xuất kháng huyết thanh chẩn đoán ở Việt Nam và trên thế giới 38 1.6.1 Sản xuất kháng huyết thanh chẩn đoán Salmonella 38

1.6.2 Sản xuất kháng huyết thanh chẩn đoán não mô cầu 39

1.6.3 Sản xuất kháng huyết thanh chẩn đoán Shigella 40

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 42

2.1 Vật liệu 42

2.1.1 Chủng giống 42

2.1.2 Kháng huyết thanh mẫu 42

2.1.3 Môi trường 42

2.1.4 Các hoá chất 44

2.1.5 Các nguyên liệu khác 45

2.1.6 Súc vật thí nghiệm 45

2.1.7 Chủng và mẫu Shigella phân lập từ thực địa 45

2.1.8 Dụng cụ và các thiết bị cần dùng 45

2.2 Phương pháp 47

2.2.1 Pha chế môi trường nuôi cấy 47

2.2.2 Pha chế môi trường kiểm tra 47

2.2.3 Phương pháp kiểm tra tính chất sinh học của Shigella 49

2.2.4 Phương pháp kiểm tra vô trùng 50

2.2.5 Phương pháp kiểm tra tính đặc hiệu kháng nguyên theo kỹ thuật ngưng kết nhanh trên lam kính 51

2.2.6 Phương pháp sản xuất kháng nguyên 51

2.2.7 Phương pháp sản xuất kháng huyết thanh Shigella 54

2.2.8 Phương pháp kiểm tra kháng huyết thanh 58

2.2.9 Phương pháp xử lý số liệu 60

Chương 3 KẾT QỦA VÀ BÀN LUẬN 61

3.1 Kết qủa khảo sát một số đặc tính sinh học của chủng Shigella 61

3.1.1 Kết quả khảo sát hình dạng khuẩn lạc và hình thái tế bào 61

3.1.2 Kết quả khảo sát tính chất sinh hóa 63

3.1.3 Tính chất huyết thanh của chủng giống 68

3.2 Nghiên cứu quy trình sản xuất kháng nguyên 71

3.2.1 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến chất lượng kháng nguyên 71

3.2.2 Ảnh hưởng của yếu tố bất hoạt đến chất lượng kháng nguyên 74

3.3 Nghiên cứu quy trình gây miễn dịch và tinh sạch huyết thanh 77

3.3.1 Ảnh hưởng của liều kháng nguyên đến đáp ứng miễn dịch 77

3.3.2 Ảnh hưởng của tá chất đến đáp ứng miễn dịch 80

3.3.3 Nghiên cứu quy trình hấp phụ kháng thể không đặc hiệu 84

3.4 Đánh giá chất lượng huyết thanh sản xuất được 90

3.4.1 Kết quả đánh giá các chỉ tiêu chất lượng của kháng huyết thanh chẩn đoán 3.4.2 Đánh giá tính ổn định của KHT bảo quản ở nhiệt độ 2 o C – 8oC 92

3.4.3 Đánh giá tính ổn định của KHT bảo quản ở nhiệt độ 37o C 94

3.4.4 Đánh giá chất lượng huyết thanh sản xuất trên các chủng Shigella 96

3.4.5 Đánh giá chất lượng huyết thanh sản xuất trên các chủng Shigella phân lập từ thực địa 97

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 99

1 Kết luận 99

1.1 Kết qủa khảo sát một số đặc tính sinh học của chủng Shigella 99

1.2 Nghiên cứu quy trình sản xuất kháng nguyên 99

1.3 Nghiên cứu quy trình gây miễn dịch và tinh sạch huyết thanh 99

1.4 Đánh giá chất lượng huyết thanh sản xuất được 100

2 Kiến nghị 100

TÀI LIỆU THAM KHẢO 101

X Geo : Trung bình nhân

WHO : World Health Organization

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang Bảng 1.1 Tình hình nhiễm và tử vong của bệnh lỵ trực khuẩn ở 29 tỉnh

thành phía bắc 13

Bảng 1.2 Sự phân chia chức năng của các gen trong Plasmid độc của Shigella flexneri 5a 20

Bảng 3.1 Kết quả hình dạng khuẩn lạc và hình thái tế bào 61

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát tính chất sinh hóa của các chủng Shigella 63

Bảng 3.3 Kết qủa phản ứng ngưng kết kháng nguyên – kháng thể 68

Bảng 3.4 Kết quả chất lượng kháng nguyên trên 2 loại môi trường khác nhau 71

Bảng 3.5 Kết quả chất lượng kháng nguyên 74

Bảng 3.6 Hiệu giá kháng thể của KHT miễn dịch theo 3 liều kháng nguyên 77

Bảng 3.7 Hiệu giá kháng thể của kháng huyết thanh khi kháng nguyên gây miễn dịch phối hợp với tá chất 80

Bảng 3.8 Kết quả tính đặc hiệu của kháng huyết thanh sau khi được hấp phụ ở các đậm độ kháng nguyên khác nhau 84

Bảng 3.9 Kết quả tính đặc hiệu của kháng huyết thanh sau khi hấp phụ kháng thể không đặc hiệu ở 2 nhiệt độ khác nhau 87

Bảng 3.10 Kết qủa chất lượng kháng huyết thanh sản xuất 90

Bảng 3.11 Kết qủa tính ổn định của KHT ở nhiệt độ 2 o C – 8oC 92

Bảng 3.12 Kết qủa tính ổn định của KHT ở nhiệt độ 37o C 94

Bảng 3.13 Kết quả đánh giá chất lượng huyết thanh sản xuất trên các chủng Shigella 96

Bảng 3.14 Kết quả đánh giá chất lượng huyết thanh sản xuất trên các chủng Shigella phân lập từ thực địa 97

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hình thái tế bào trực khuẩn Shigella 15

Hình 1.2 Cấu trúc Plasmid của Sh flexneri 5a 19

Hình 1.3 Cấu tạo của phân tử IgG 29

Hình 1.4 Quá trình tiếp cận kháng nguyên và hình thành kháng thể 31

Hình 1.5 Hoạt hóa tế bào B hình thành kháng thể 32

Hình 2.1 Quy trình sản xuất kháng nguyên 52

Hình 2.2 Quy trình sản xuất kháng huyết thanh 54

Hình 2.3 Tiêm tĩnh mạch thỏ gây miễn dịch 56

Hình 2.4 Lấy máu thỏ thu kháng huyết thanh 57

Hình 2.5 Sơ đồ phương pháp định lượng hiệu giá kháng thể 59

Hình 3.1 Hình dạng khuẩn lạc của chủng Shigella 62

Hình 3.2 Hình thái tế bào chủng Shigella 62

Hình 3.3 Tính di động trên môi trường thạch mềm mannit 63

Hình 3.4 Khả năng phân giải Urea của các chủng nghiên cứu 64

Hình 3.5 Khả năng lên men đường của chủng Shigella dysenteriae 65

Hình 3.6 Khả năng lên men đường của chủng Shigella flexneri 65

Hình 3.7 Khả năng lên men đường của chủng Shigella boydii 66

Hình 3.8 Khả năng lên men đường của chủng Shigella sonnei 66

Hình: 3.9 Phản ứng ngưng kết giữa các chủng với kháng huyết thanh đặc hiệu nhóm A, B, C và D mẫu Sanofi – Pháp 68

Hình 3.10 Hiệu giá kháng thể của kháng huyết thanh miễn dịch theo 3 liều kháng nguyên 78

Hình 3.11 Hiệu giá kháng thể của kháng huyết thanh gây miễn dịch với kháng nguyên phối hợp tá chất Freund, TiterMax và không phối hợp tá chất 81

Hình 3.12 Kháng huyết thanh chẩn đoán lỵ trực khuẩn 99

MỞ ĐẦU

Lỵ trực khuẩn (Shigella) là vi khuẩn chính gây ra các bệnh tiêu chảy và kiết lỵ

trong cộng đồng, là bệnh nhiễm trùng cấp tính gây nên ở ruột già và đoạn cuối ruột non [2,11,14,22] Bệnh thường thấy ở những nơi tập trung đông người và dễ lây trong những điều kiện vệ sinh thấp Có rất nhiều biến chứng ngoài đường ruột có thể xảy ra

sau khi mắc bệnh Shigella Thông thường nhất là hôn mê mà thường biểu hiện sốt làm

phức tạp thêm tình trạng nhiễm trùng, tăng urê máu ở trẻ em và ban xuất huyết gây

nghẽn mạch ở người lớn Hiếm hơn, Shigella có thể gây nên các nhiễm trùng thứ phát

như gây viêm màng não, viêm khớp, áp xe lách và viêm tủy xương [2,14,26]

Bệnh lưu hành trên toàn thế giới, nhất là ở những nước nghèo, những nước đang phát triển, trong đó có Việt Nam Các vụ dịch xảy ra ở nhưng nơi mà điều kiện vệ sinh thấp hay không vệ sinh, ăn ở chất hẹp, ẩm thấp và vùng lũ lụt Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới mỗi năm trên toàn cầu có khoảng 167,4 triệu người mắc bệnh, với 163,2 triệu người từ các nước đang phát triển, trong đó 1,1 triệu người tử vong, 69% trong số đó là trẻ em dưới 5 tuổi [22,26,33]

Ở Việt nam, theo thống kê của Khoa Dịch Tễ - Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương, từ năm 2006 đến quý II năm 2008 có gần 295.167 trường hợp xuất hiện hội

chứng lỵ trực khuẩn với 5 trường hợp tử vong Các chủng Shigella gây bệnh có sự thay đổi theo thời gian và khu vực nhưng chủ yếu là Shigella flexneri [6]

Trực khuẩn gây bệnh Lỵ thuộc giống Shigella họ đường ruột Enterobacteriaceae,

bộ Enbacteriales Trong Shigella có 4 nhóm là Sh dysenteriaeae, Sh flexneri, Sh sonnei, Sh boydii [2,8,26,32,38,52] Chúng mang những đặc điểm dịch tễ đáng chú ý:

- Mọi lứa tuổi đều cảm thụ bệnh nhiều nhất là trẻ em dưới 2 tuổi

- Bệnh xảy ra quanh năm, nhiều vào mùa hè thu khi thời tiết nóng ẩm

- Tỷ lệ các nhóm gây bệnh thay đổi theo thời gian ở từng quốc gia

- Chỉ cần lượng nhỏ vi khuẩn xâm nhập đã đủ gây bệnh, khoảng 101 – 102 tế bào

Shigella cũng đã gây bệnh cho người trong khi ở Salmonella phải tới 104 đến 106 tế bào

- Không có miễn dịch tự nhiên

- Đề kháng với nhiều loại kháng sinh thông thường

Với những tác hại trên, việc giám sát và chẩn đoán phân loại tác nhân gây bệnh cần được quan tâm nhiều Tổ chức Y tế Thế gới và nhiều nước khuyến cáo nên sử

dụng kháng huyết thanh chẩn đoán Shigella để xác định và phân loại tác nhân gây bệnh

[32,52,53]

Để phục vụ cho công tác giám sát dịch tễ, chẩn đoán sớm tác nhân gây bệnh, nhanh chóng dập tắt ổ dịch và có hướng điều trị kịp thời, phương pháp huyết thanh học được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm Tuy nhiên hiện nay ở nước ta chưa

có nơi nào sản xuất kháng huyết thanh Lỵ trực khuẩn đạt chất lượng phục vụ cho công tác chẩn đoán mà phải nhập từ nước ngoài với giá thành rất đắt

Để có được kháng huyết thanh sử dụng chủ động trong các phòng xét nghiệm của

cả nước với giá rẻ hơn so với nhập nội chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu quy trình sản xuất kháng huyết thanh chẩn đoán Lỵ trực khuẩn”

- Mục tiêu của đề tài: Sản xuất kháng huyết thanh chẩn đoán Lỵ trực khuẩn đạt

chất lượng

Để thực hiện được mục tiêu trên chúng tôi tiến hành các nội dung nghiên cứu:

+ Khảo sát một số đặc tính sinh học của chủng Shigella

+ Nghiên cứu quy trình sản xuất kháng nguyên

+ Nghiên cứu quy trình gây miễn dịch và tinh sạch huyết thanh

+ Đánh giá chất lượng kháng huyết thanh sản xuất được

Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Bệnh lỵ trực khuẩn

Bệnh Lỵ trực khuẩn lần đầu tiên được mô tả bởi Hyppocrat ở thế kỷ thứ 5 trước công nguyên, sau đó tác giả Araru và Biblim ở thế kỷ thứ 1 trước công nguyên cũng

mô tả căn bệnh này Tuy nhiên mãi đến năm 1897, Kiyoshi Shiga một nhà vi sinh vật học người Nhật mới phát hiện được tác nhân gây bệnh trong vụ dịch lớn tại Nhật làm hơn 20% tử vong trong số 90.000 trường hợp mắc bệnh và đặt tên là bệnh Shiga [2,8,44,53]

Cho đến năm 1950, dựa vào đặc điểm kháng nguyên thân O và các đặc điểm sinh

hóa các nhà vi sinh vật đã xác định được Shigella có 4 nhóm chính là: Shigella dysenteriae (nhóm A), Shigella flexneri (nhóm B), Shigella boydii (nhóm C) và Shigella sonnei (nhóm D) Ngày nay các nhóm này còn được phân ra thành 47 týp

huyết thanh khác nhau [8,25,26,52,56]

Lỵ trực khuẩn là bệnh lưu hành tại các nước nhiệt đới và ôn đới Bệnh tăng nhanh vào mùa hè – thu, ẩm và nóng Bệnh lỵ trực khuẩn thường xảy ra đồng loạt với nhiều người mắc bệnh trên một địa bàn hẹp và trong cùng một thời gian ngắn Bệnh rất dễ phát và lan thành dịch ở những nơi đông đúc (khu tị nạn, chung cư, ký túc xá, trường học…) đặc biệt khi môi trường vệ sinh kém, ô nhiễm hay ở những quán ăn không đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm [2,26,40,44]

Bệnh lây qua đường tiêu hóa, lây trực tiếp từ người sang người Vi khuẩn truyền

từ người bị nhiễm bệnh sang người bình thường khác thông qua con đường phân miệng Người là nguồn bệnh duy nhất và cũng lây trực tiếp cho người khác thông qua các sinh hoạt hằng ngày như thức ăn, nước uống Người đang mắc bệnh và người lành mang mầm bệnh đều có khả năng phát tán vi khuẩn ra môi trường bên ngoài Ruồi nhặng cũng là trung gian truyền bệnh chính của lỵ trực khuẩn [2,23,32]

Shigella là vi trùng có độc lực rất mạnh, chỉ cần 10 đến 100 tế bào vi khuẩn là đủ làm cho người khỏe mạnh nhiễm và phát bệnh, trong khi đó ở vi khuẩn Salmonella

phải tới 104

đến 106 tế bào [8,22]

Lỵ có thể xảy ra cho bất kỳ độ tuổi nào, tuy nhiên ở trẻ em từ 1 – 4 tuổi là đối tượng mắc bệnh thường thấy nhất [22,26,33]

Lỵ trực khuẩn có thể được điều trị khỏi bằng kháng sinh Tuy nhiên cho đến nay

Lỵ trực khuẩn kháng nhiều với kháng sinh mà trước kia được coi như là thuốc đặc trị

hàng đầu [2][3] Những loại kháng sinh thông thường mà Shigella đề kháng như

Sulfonamides, Ampicillin, tetracycline, trymethoprim… [2,24]

Nhiễm khuẩn lỵ đã đang được xem là gánh nặng toàn cầu với số người nhiễm và

tử vong rất cao Theo thống kê của WHO trong giai đoạn 1966 – 1997, mỗi năm số trường hợp nhiễm lỵ trên toàn thế giới ước tính khoảng 164,7 triệu người, trong đó 163,2 triệu người mắc ở những quốc gia đang phát triển Có đến 1,1 triệu người chết vì

lỵ ở các nước đang phát triển, trong đó 69% là trẻ em dưới 5 tuổi [22,26,33,50]

Đối tượng có tỷ lệ tử vong cao nhất khi nhiễm lỵ trực khuẩn là trẻ em suy dinh dưỡng (trọng lượng theo lứa tuổi nhỏ hơn 60 % trọng lượng trung bình cho phép) [48]

Tỷ lệ các nhóm gây bệnh trên toàn thế giới cũng khác nhau: Đối với các nước

phát triển tỷ lệ nhóm phân lập trung bình là Sh sonnei (77%), Sh flexneri (16%), Sh boydii (2%) và Sh dysenteriae (1%) Đối với các nước đang phát triển tỷ lệ loài phân lập trung bình là Sh sonnei (15%), Sh flexneri (60%), Sh boydii (6%) và Sh dysenteriae (6%) trong đó 30% ca bệnh Sh dysenteriae là týp 1 [21,22,25,33]

Theo trung tâm ngăn ngừa và kiểm soát bệnh tại Mỹ, từ năm 1989 đến 2002 có

tổng cộng 208.368 phòng thí nghiệm phát hiện lỵ trực khuẩn, trong đó 71,7% là Sh sonnei, 18,4% là Sh flexneri, 1,6% là Sh boydii và 0,7% là Sh dysenteriae Năm 1997

tỷ lệ mắc bệnh là 7,6 trường hợp trong 100.000 người, đến năm 1999 tỷ lệ mắc bệnh chỉ còn 3,7 trường hợp trong 100.000 người [28,29]

Một nghiên cứu lớn về bệnh tiêu chảy do lỵ trực khuẩn đã được tiến hành tại 6 quốc gia thuộc châu Á, tại những vùng có nguy cơ lây nhiễm cao từ năm 2000 – 2004 Qua giám sát 600.000 người ở tất cả các lứa tuổi là cư dân của Băngladet, Trung Quốc, Pakistan, Việt Nam và Thái Lan Người ta đã xác định được 2.927 (5%) trường hợp

tiêu chảy do Shigella trong số 56.958 trường hợp bị tiêu chảy Tỷ lệ mắc bệnh lỵ là 2,1

trường hợp trên 1.000 dân ở tất cả các lứa tuổi, riêng trẻ em dưới 5 tuổi là 13,2/1.000

trẻ Trong số các nhóm Shigella gây bệnh thì Sh flexneri chiếm 68% ở tất cả các vùng, ngoại trừ Thái Lan Sh sonnei chiếm đến 85% Hầu hết các chủng được phân lập đề

kháng lại với kháng sinh amoxicillin và cotrimoxazole [37,51]

Ở nước ta theo thống kê của hội Y học dự phòng, chỉ riêng 29 tỉnh thành phía bắc

đã có tỷ lệ nhiễm rất cao [6], được thống kê theo bảng:

Bảng 1.1 Tình hình nhiễm và tử vong của bệnh lỵ trực khuẩn ở 29 tỉnh

Nhiễm bệnh

Tử vong

Nhiễm bệnh

Tử vong

2008

Cấu trúc bệnh căn biến đổi theo thời gian, tùy hoàn cảnh kinh tế xã hội ở mỗi

nước, ở mỗi khu vực Ở Việt Nam, trước 1970 nổi lên Sh flexneri (60 – 82%), từ năm

1970 – 1975 Sh flexneri chỉ là 35% Từ năm 1975 đến nay, nguyên nhân gây bệnh tiếp tục biến động: Sh flexneri chiếm hàng đầu 76,6%, Sh boydii 1,9%, Sh sonnei 11,5%

Sh dysenteriae 9,9% (trong 2.575 chủng lỵ phân lập tại viện Pasteur Thành phố Hồ

Trực khuẩn lỵ từ miệng qua dạ dày vào ruột non, bị diệt một số lớn còn lại một lượng nhỏ giữ nguyên độc lực lọt vào đại tràng đủ để gây bệnh Độc tố vi khuẩn được giải phóng làm đại tràng trở nên nhạy cảm, tạo điều kiện cho trực khuẩn lỵ bám vào bề mặt niêm mạc ruột, từ đó xâm nhập vào tế bào biểu mô niêm mạc đại tràng và gây bệnh [2,5,10]

Lỵ trực khuẩn thường cấp diễn, bệnh phát ra đột ngột, không có triệu chứng báo trước với 2 hội chứng: nhiễm trùng và tiêu hóa [2]

- Hội chứng nhiễm trùng: sốt 38oC – 39oC hoặc hơn, có rét, run, nhức đầu, mệt mỏi, đau lưng, đau khớp Ở trẻ em có thể có cơn co gật, đồng thời chán ăn, khát nước, đắng miệng, buồn nôn, bạch cầu tăng cao (10.000 – 13.000/mm3

)

- Hội chứng tiêu hóa: Đau bụng, lúc đầu đau âm ỉ quanh rốn rồi lan ra toàn bụng theo khung đại tràng, cuối cùng thành cơn đau quặn bụng, khu trú ở chậu trái làm bệnh nhân muốn đại tiện…

1.2 Đặc điểm sinh học của Shigella

1.2.1 Hình thể và tính chất bắt màu

Shigella là trực khuẩn gram âm (-), hình que, nhỏ, dài 1 – 3 m, rộng 0,3 – 0,6 m,

không có lông, không có vỏ, không sinh bào tử và không di động, ái khí, có thể kỵ khí, mọc dễ dàng ở môi trường thạch lỏng 37o

C, pH 7,8 [2,13,14,32,44]

Trong trường hợp phân lập, sau 24 giờ khuẩn lạc lớn với đường kính khoảng 1,5mm, tròn, trong, bờ đều dạng S Màu sắc thay đổi theo từng loại môi trường: đỏ trong môi trường SS, xanh trong môi trường Istrati [27]

Hình 1.1 Hình thái tế bào trực khuẩn Shigella (Trích từ Dennis Kunkel Microscopy, Inc.)

1.2.2 Tính chất nuôi cấy

Shigella phát triển mạnh trên môi trường dinh dưỡng như LB, LB agar, Nutrient

agar, SS, MacConkey ENDO…Trong môi trường nuôi cấy chúng mọc dễ dàng ở nhiệt

độ 20 – 40o

C, nhiệt độ thích hợp nhất là 37o

C Chúng có thể tồn tại được trong một khoảng pH khá rộng (pH = 2 – 8), pH thích hợp nhất là 7,8 [2,14,32]

1.2.3 Tính chất sinh hóa

Trực khuẩn lỵ lên men không sinh hơi đường glucose, sinh axít, trừ một vài týp

đặc biệt như Sh flexneri 6, Sh boydii 14, không lên men hầu hết các loại đường khác, trừ một vài trường hợp như Sh sonnei lên men lactose nhưng rất chậm Hầu hết các nhóm lên men mannitol ngoại trừ Sh dysenteriae [8,13,14,52,53.54]

Shigella không có enzym urease, lysindecacboxylase, không mọc trên môi trường

citratsimmons và không có khả năng phân giải urea

Khi nghiên cứu sâu hơn về tính chất sinh hóa của từng loài trong giống Shigella

người ta đã thu được kết quả:

Nhóm A: Sh dysenteriae Không lên men đường mannitol, trừ Sh dysenteriae týp 5, xylose âm trừ Sh dysenteriae týp 8, 9 và 10, riêng Sh dysenteriae týp 1 có

catalase âm và -galactoxidase dương tính

Nhóm B: Sh flexneri Lên men đường mannitol trừ một vài nhóm có mannitol âm

tính, lên men glucose có thể sinh hơi hoặc không

Nhóm C: Sh boydii Lên men mannitol trừ týp 3, 6, 10 và 11 Indol âm tính Các

biến chủng 13, 14 gặp ở Đông Á, Châu Phi, Châu Âu thường sinh hơi

Nhóm D: Sh sonnei Lên men lactose chậm, lên men mannitol dương, galactoxidase dương

-1.2.4 Cấu trúc kháng nguyên của Shigella

Lỵ trực khuẩn có cấu trúc kháng nguyên của trực khuẩn Gram âm Kháng nguyên

của Shigella được chia thành:

1.2.4.1 Kháng nguyên chung với các vi khuẩn đường ruột khác

Shigella có một vài kháng nguyên chung với Salmonella nhưng hiệu giá ngưng

kết chéo thấp Một số kháng nguyên có liên quan tới nhóm Alkalescensdispan [13,53]

Sh dysenteriae có 3 cấu trúc kháng nguyên giống Escherichia coli 0124, Sh boydii giống Escherichia coli 053, Sh flexneri týp 5 giống Escherichia coli 0124, Sh dysenteriae 2 giống Escherichia coli 112 [13,53]

Dựa vào sự khác nhau của kháng nguyên thân mà người ta chia Shigella thành

các týp huyết thanh khác nhau:

Nhóm A gồm 13 týp huyết thanh đặc hiệu

Nhóm B gồm 15 týp huyết thanh đặc hiệu và 2 týp không hoàn toàn về phương diện kháng nguyên

Nhóm C gồm 15 týp huyết thanh đặc hiệu

Có một số điểm giống nhau giữa các cấu trúc kháng nguyên của Sh boydii 4 và

Sh sonnei phase II

Nhóm D: Căn cứ vào hình dạng khuẩn lạc và sự thay đổi cấu trúc kháng nguyên trong quá trình nuôi cấy, người ta chia nhóm D thành 2 phase

Phase I: Còn gọi là phase S, khuẩn lạc nhẵn

Phase II: Còn gọi là phase R, khuẩn lạc dẹt, bờ không đều

1.2.4.3 Kháng nguyên vỏ (KN Vi)

Chỉ có một số trường hợp có kháng nguyên vỏ (chủ yếu là ở nhóm B) Kháng

nguyên vỏ của Shigella có bản chất là prôtein và có sự tương đồng với kháng vỏ của Escherichia coli loại B

Muốn loại bỏ kháng nguyên vỏ trước khi làm phản ứng ngưng kết phải đun sôi

100oC trong 1 giờ hoặc trong qúa trình nuôi cấy ta sử dụng môi trường thạch chứa ít chất dinh dưỡng [53]

1.2.4.4 Kháng nguyên ngoại bào

Kháng nguyên ngoại bào có bản chất là protein nó có thể là ngoại độc tố hoặc các enzym được tiết vào môi trường trong quá trình trao đổi chất Trong các loại kháng

nguyên ngoại bào của Shigella, người ta đặc biệt chú ý tới ngoại độc tố

Ngoại độc tố có độc lực mạnh, dễ bị phân hủy bởi nhiệt độ Dưới tác dụng của formol, ngoại độc tố trở thành giải độc tố (mất độc lực) nhưng vẫn còn hoạt tính kháng nguyên, nên vẫn giữ được tính sinh miễn dịch

Trên động vật thí nghiệm, ngoại độc tố có tác dụng ức chế tổng hợp prôtein ở tế bào cảm thụ Nó có hoạt tính gây tiết nước và điện giải như một Enterotoxin [13]

Đối với cơ thể người, ngoại độc tố của Shigella không những là nguyên nhân gây

tiết nước và điện giải mà nó còn làm tổn thương tế bào, gây các triệu chứng nhiễm độc thần kinh thường gặp ở trẻ em

Về cấu tạo ngoại độc tố gốm 2 thành phần: Thành phần gắn dính gồm 5 tiểu đơn

vị B và thành phần hoạt hóa gồm 1 tiểu đơn vị A

Ngoại độc tố sau khi được tiết ra, phần gắn dính sẽ gắn vào tế bào cảm thụ, phần hoạt hóa sẽ chuyển vào trong tế bào và di chuyển về phía Ribosome của bào tương ngăn cản sinh tổng hợp protein ở phần 60S của Ribosome trong bào tương

Người ta còn nhận thấy các dòng Shigella sinh ngoại độc tố nhưng không có khả

năng xâm nhập vào tế bào thượng bì, cũng không gây được bệnh lý

Một dòng Shigella muốn gây được bệnh lý nặng thì ngoài khả năng tiết độc tố,

chúng còn phải có khả năng xâm nhập vào bên trong tế bào niêm mạc ruột Khả năng này được quy định bởi plasmid có trọng lượng phân tử 220kb mã hóa cho nhiều loại

kháng nguyên nhƣ: bám dính trên tế bào biểu mô, kháng nguyên xâm nhiễm (Ipa), di chuyển…[17,32]

Hình 1.2 Cấu trúc Plasmid của Sh Flexneri 5a (trích từ Todar’s Online Textbook

of Bacteriology, Shigella and Shigellosis)

Plasmid là sự kết hợp của nhiều gen và mã hóa những chức năng khác nhau [32]:

Bảng 1.2 Chức năng của các gen trong Plasmid độc của Shigella flexneri 5a

Gen Trọng lượng

phân tử Chức năng điều tiết và kích thích

virF 30 kDa Điều tiết tích cực của gen virG và ipa-mxi-spa

invA(mxiB) 38 kDa Cần thiết cho sự xâm nhiễm (định hướng sản

sinh gen ipa ở màng ngoài) mxiA 76 kDa Cần thiết cho sự xâm nhiễm

ippI 18 kDa Cần thiết cho sự xâm nhiễm

ipaB 62 kDa Cần thiết cho sự xâm nhiễm (gián tiếp)

ipaC 43 kDa Cần thiết cho sự xâm nhiễm (gián tiếp)

ipaA 38 kDa Cần thiết cho sự xâm nhiễm (gián tiếp)

ipaD 78 kDa Không cần thiết cho sự xâm nhiễm

virB 33 kDa Điều tiết tích cực của gen virG và ipa-mxi-spa virG (icsA) 120 kDa Điều khiển lan truyềnvk giữa hai tế bào kế cận

ipaH 60 kDa Giúp trốn khỏi sự thực bào

1.2.4.5 Kháng nguyên nội độc tố

Nội độc tố là một sản phẩm nội bào, không được tiết vào môi trường trong qúa trình trao đổi chất Nó chỉ được giải phóng khi tế bào bị chết và màng tế bào bị phá hủy

Nội độc tố của Shigella có bản chất là lipopolysaccharide bền vững ở 100o

C, có hoạt tính kháng nguyên yếu, sinh ít kháng thể nhưng có độc lực mạnh, tác dụng lên

thành ruột và gây tiêu chảy Ngoài ra nó còn có các hoạt tính sinh học giống như nội độc tố của các loài thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae [52]

1.3 Bệnh học

Shigella gây nên bệnh lỵ trực khuẩn với các triệu chứng như đau bụng, ỉa chảy,

sốt nôn và chảy máu với chất nhày trong phân Vi khuẩn lây truyền theo đường phân miệng và thông qua nhiễm khuẩn nguồn nước và thức ăn Một điều quan trọng là

Shigella đề kháng với axit nên có thể tồn tại và phát triển trong môi trường dạ dày rồi

di chuyển đến ruột già Hơn thế nữa, chúng còn đâm thủng tế bào biểu mô của niêm mạc ruột Sau khi xâm nhiễm chúng sinh sản nhanh trong nội bào là lan truyền sang tế bào biểu mô lân cận Kết quả là chúng phá hủy mô ruột và gây ra triệu chứng nhiễm khuẩn lỵ [2,7,14,22,32]

1.3.1 Sự xâm nhập của trực khuẩn Shigella vào tế bào biểu mô

Để xâm nhiễm vào tế bào biểu mô, trước hết trực khuẩn lỵ bám chặt vào tế bào đích nào đó của lớp niêm mạc ruột, sau đó chúng được tiếp nhận bởi cơ chế thực bào của tế bào chủ Thông thường trực khuẩn bám vào màng của tế bào và được tiếp nhận theo cơ quan nội bào rồi sau đó phân giải để mở rộng đường đi vào tế bào chất, nơi mà chúng được nhân lên

Trực khuẩn xâm nhiễm vào tế bào biểu mô dưới sự giúp đỡ của một số plasmid

và prôtein được mã hóa từ ADN của tế bào trực khuẩn Ví dụ kháng nguyên plasmid xâm nhiễm (Ipa), kháng nguyên trình diện bề mặt (Spa), prôtein bài tiết màng (Mxi), prôtein độc lực (VirF)

Khi trực khuẩn phát triển ở 37o

C, prôtein độc tính VirF kích thích sự bộc lộ của prôtein VirB VirB sau đó hoạt hóa promoter của Ipa, Mxi và Spa dẫn đến sự hoạt động của các kháng nguyên này Kết quả tạo thành kênh di chuyển Mxi-Spa, khi trực khuẩn tiếp xúc với màng tế bào biểu mô kênh này hoạt hóa và tiết ra chất tiền tổng hợp

prôtein Ipa IpaA, IpaB và IpaC kết hợp với nhau để tạo thành phức hợp tương tác với màng tế bào biểu mô của vật chủ và truyền tín hiệu để trực khuẩn được xâm nhiễm theo cơ quan nội bào [22,32,36]

1.3.2 Sự lan truyền của Shigella bên trong nội bào và gian bào

Ở bên ngoài tế bào Shigella không di động, tuy nhiên trong nội bào trực khuẩn di

chuyển và chiếm toàn bộ tế bào chất của tế bào đã xâm nhiễm và chúng có thể lan truyền giữa các tế bào với nhau Sự lan truyền của trực khuẩn trong nội bào và gian bào dưới sự điều khiển của gen virG (icsA) và icsB

Trực khuẩn xâm nhiễm vào tế bào, trực khuẩn di chuyển trong nội bào nếu có sự biểu hiện của hiện tượng Olm (di chuyển như hạt cơ quan) và hiện tượng Ics Sự biểu hiện của hiện tượng Olm cho phép trực khuẩn đi qua lớp actin để vào trong tế bào chủ, trong khi biểu hiện của hiện tượng Ics là cho phép trực khuẩn lan truyền và gây nhiễm

tế bào kế cận [22,32]

Sự di chuyển của Shigella giữa hai tế bào kế cận được thực hiện gián tiếp nhờ sản

phẩm của gen virG (icsA) Gen icsA tạo ra polymerase actin tại cực dương của trực khuẩn và cho phép trực khuẩn thâm nhập trực tiếp vào tế bào kế cận mà không đi ra ngoại bào (nơi mà trực khuẩn không thể di chuyển)

Gen mxiG được tiêt ra từ prôtein Ipa cũng cần thiết cho sự xâm nhiễm Gen này

và một số gen khác tạo kênh di chuyển của trực khuẩn trong gian bào

Trực khuẩn xâm nhiễm và lan truyền bên trong tế bào biểu mô ruột kết của vật chủ là sự thoái hóa của biểu mô ruột và chứng viêm nhiễm của màng nhày Kết quả là

sự tróc ra và tạo nên các ổ loét nông trên nền lớp niêm mạc, viêm lan tỏa chứa nhiều chất nhày và bạch cầu đa nhân Giai đoạn này bệnh nhân đào thải nhiều trực trùng theo phân ra ngoài [22,32]

1.4 Miễn dịch

1.4.1 Kháng nguyên

Một kháng nguyên điển hình bao giờ cũng có hai tính chất đặc trƣng đó là tính đặc hiệu của kháng nguyên và tính sinh miễn dịch

1.4.1.1 Tính đặc hiệu của kháng nguyên

Tính đặc hiệu của kháng nguyên không phải do toàn bộ cấu trúc của cả phân tử kháng nguyên quyết định mà do một hoặc nhiều đoạn nhỏ nằm trong phân tử kháng nguyên quyết định Những đoạn này đƣợc gọi là quyết định kháng nguyên Quyết định kháng nguyên quyết định tính đặc hiệu của một đáp ứng miễn dịch chống lại kháng nguyên đó, ngoài ra nó còn là vị trí để kháng thể hoặc lympho bào T mẫn cảm có thể gắn với kháng nguyên một cách đặc hiệu [1,19]

Tính đặc hiệu của kháng nguyên do các quyết định kháng nguyên quyết định và đƣợc nhận dạng một cách có chọn lọc bởi thụ thể của các tế bào có thẩm quyền miễn dịch Mỗi một quyết định kháng nguyên chỉ kết hợp đặc hiệu với mỗi kháng thể do nó kích thích cơ thể sinh ra Tính đặc hiệu của kháng nguyên là rất cao, nhƣng trong thực

tế hai kháng nguyên khác nhau có thể phản ứng chéo với nhau [1,19]

1.4.1.2 Tính sinh miễn dịch

Tính sinh miễn dịch của một kháng nguyên mạnh hay yếu phụ thuộc vào các yếu

tố sau:

- Tính “lạ” của kháng nguyên:

Một điều kiện quan trọng đảm bảo cho một kháng nguyên có tính miễn dịch cao

là sự khác biệt chủng loại giữa cơ thể chủ và kháng nguyên Nhìn chung đối với đáp ứng miễn dịch dịch thể, kháng nguyên càng “lạ” với cơ thể chủ bao nhiêu khả năng kích thích tạo kháng thể càng mạnh bấy nhiêu Đối với đáp ứng miễn dịch qua trung

gian tế bào thì các prôtein khác biệt giữa các cá thể cùng loài có tính sinh miễn dịch cao

- Cấu trúc và bản chất của phân tử kháng nguyên:

Một chất có trọng lượng phân tử càng lớn, cấu trúc hóa học và cấu hình không gian càng phức tạp thì hoạt tính sinh miễn dịch càng cao Do đó, trong quá trình điều chế kháng nguyên để sản xuất kháng huyết thanh phải đảm bảo không làm tổn thương cấu trúc kháng nguyên Các nhà sản xuất còn nghiên cứu tạo cho được một dạng kháng nguyên phù hợp để kích thích được các tế bào có thẩm quyền miễn dịch, chẳng hạn như phối hợp kháng nguyên với các tá chất bổ trợ Các phân tử đạt kích thước từ 10.000 dalton trở lên thì mới thể hiện tính sinh miễn dịch mạnh Những chất có phân tử lượng dưới 6.000 dalton thường không có hoặc có tính sinh miễn dịch yếu trừ trường hợp ngoại lệ của glucagon với phân tử lượng chỉ có 3.800 đơn vị và insulin có 6.000 dalton nhưng vẫn có tính sinh miễn dịch mạnh [1,7,19]

Khả năng tích điện của các phân tử kháng nguyên cũng có ảnh hưởng đến tính sinh miễn dịch, vì chúng có vai trò trong việc chọn lọc các tế bào lympho có thụ thể đặc hiệu tương ứng

- Cách gây miễn dịch và liều lượng kháng nguyên:

Đường đưa kháng nguyên vào cơ thể túc chủ, liều kháng nguyên, khoảng cách giữa các lần tiêm và việc dùng phối hợp các tá chất đều có ảnh hưởng tới tính sinh miễn dịch

Người ta có thể chủ động tiêm kháng nguyên vào trong da, dưới da, trong bắp thịt hay tĩnh mạch, giúp kháng nguyên nhanh chóng tiếp cận với hệ thống miễn dịch Khi tiêm bắp và dưới da sẽ kích thích hạch lympho ngoại vi, còn tiêm tĩnh mạch, phúc mạc

sẽ kích thích hệ miễn dịch trung gian, lách và tủy xương

Liều tiêm cũng quyết định lớn đến đáp ứng miễn dịch, khi đưa liều quá ít sẽ không đủ kích thích đáp ứng miễn dịch, còn quá nhiều có thể dẫn đến trạng thái tê liệt

miễn dịch Khi đưa lượng nhỏ kháng nguyên vào cơ thể sẽ kích thích mạnh tế bào T tạo trí nhớ miễn dịch và dẫn đến đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào nhiều hơn là đáp ứng miễn dịch dịch thể Nhưng nếu tiêm nhắc lại thì đáp ứng miễn dịch dịch thể sẽ tăng lên, tạo khả năng miễn dịch cao, bền vững là nhờ các tế bào có trí nhớ miễn dịch Phương thức này được áp dụng cho phát đồ gây miễn dịch trong quy trình sản xuất kháng huyết thanh nhằm tạo được lượng kháng thể cao trong huyết thanh miễn dịch

- Sự di truyền khả năng đáp ứng của túc chủ:

Cùng một kháng nguyên nhưng các cơ thể túc chủ khác nhau có đáp ứng miễn dịch ở mức độ khác nhau Điều này phụ thuộc vào hai hệ thống di truyền kiểm soát các hiện tượng miễn dịch là hệ thống gen cấu trúc dành cho các chuỗi globulin miễn dịch gọi tắt là các gen miễn dịch và hệ thống gen này kiểm soát đáp ứng miễn dịch nằm trong hệ phù hợp tổ chức chính Cho đến nay trên thế giới có nhiều loại túc chủ được nghiên cứu, thỏ được sử dụng rộng rãi trong sản xuất kháng thể dùng cho chẩn đoán vì chúng nhạy cảm với kháng nguyên và phù hợp với quy mô sản xuất

1.4.2 Tá chất – chất hỗ trợ đáp ứng miễn dịch

Tá chất là những chất phụ gia khi trộn với kháng nguyên sẽ tăng cường đáp ứng miễn dịch Khi gắn với tá chất kháng nguyên sẽ được tăng kích thước và cấu trúc đa dạng hơn, kháng nguyên cũng bị phân giải chậm hơn, phóng thích dần dần trong cơ thể

tương tự như khi tiêm kháng nguyên liều nhỏ nhiều lần Tá chất tăng cường đáp ứng miễn dịch bằng cách kích thích đại thực bào làm nhiệm vụ thực bào hoặc kích thích tế bào T và B Tá chất là chất trơ khó phân giải như dầu, paraffin, hydroxyt nhôm…Tá chất cũng có thể là các vi khuẩn đã bị giết chết (Boderela pertusis, Mycrobacterium…) các sản phẩm của vi khuẩn (nội độc tố) [7,19,38,41,42,49,55]

Tá chất đã được sử dụng để tăng cường đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên hơn

70 năm qua, kể từ khi Ramon chứng minh đáp ứng miễn dịch đã tăng sau khi tiêm giải độc tố uốn ván kết hợp với chất khác như agar, saponin, tinh bột…[8]

Ngày nay tá chất được quan tâm nhiều hơn khi chúng ta đi đến nghiên cứu và sản xuất kháng huyết thanh ở quy mô công nghiệp, hiệu quả kháng thể thu được quyết định giá thành sản phẩm

Các loại tá chất được quan tâm nhiều trong sản xuất kháng huyết thanh hiện nay như: Tá chất Freund toàn phần (FCA), tá chất Ribi, tá chất TiterMax…

+ Tá chất Ribi

Ribi là tá chất ở dạng nhũ dầu trong nước có sự phối hợp của Tween 80 Tá chất này gần giống với FCA, tuy nhiên nó ít độc và gây đáp ứng miễn dịch thấp hơn [30,38,49]

+ Tá chất TiterMax

Đây là tá chất đại diện cho thế hệ tá chất mới, ít gây độc và không chứa vật chất được chuyển hóa về mặt sinh học Nó dựa trên sự phối hợp của chất có hoạt tính bề mặt, tạo cụm hay chuỗi ninionic copolymers polyoxypropylene (POP) và polyoxyethylene (POE) Tá chất có độc lực thấp và có sức thuyết phục lớn, dạng hạt nhỏ, nhũ dầu trong nước với copolymer Copolymer được gắn với hạt silica, cho phép kết hợp với một lượng lớn kháng nguyên khác nhau TiterMax cần có lượng kháng nguyên lớn để gây đáp ứng miễn dịch, thường hiệu giá kháng thể bằng hoặc cao hơn so với tá chất Freund [30,38,46,49]

Không có một tá chất nào có thể hỗ trợ đáp ứng miễn dịch với tất cả các loại kháng nguyên, nhiều loài động vật Mỗi loại tá chất có những lợi thế khác nhau với những kháng nguyên khác nhau để tạo được kết quả tốt nhất Edelman đã đưa ra các tiêu chuẩn để đảm bảo tá chất an toàn khi gây miễn dịch[30] Tuy nhiên không có một

tá chất nào đạt tất cả các tiêu chuẩn trên Do đó việc chọn lựa tá chất phục vụ sản xuất kháng huyết thanh cần phải nghiên cứu chọn lựa thích hợp

1.4.3 Kháng thể

Kháng thể là các globulin có trong huyết thanh được hình thành trong quá trình đáp ứng dịch thể do quần thể lympho B sản xuất chống lại chính kháng nguyên kích thích sinh ra nó[1,7,19]

Kháng thể có bản chất là globulin nên các tác nhân hóa, lý như nhiệt độ, axít, kiềm có thể làm biến tính prôtein Hoạt tính của kháng thể phụ thuộc vào pH môi trường và nhiều yếu tố khác Amôn sulfat, natri sulfat, cồn ở 5oC có thể làm kết tủa

kháng thể nhưng không làm mất tính chất của chúng, người ta dựa vào tính chất này để tinh khiết kháng thể

Kháng thể được gọi là globulin miễn dịch (viết tắt là Ig) Các globulin miễn dịch được chia thành 5 lớp: IgG, IgM, IgA, IgD và IgE Các lớp này có một số đặc điểm cấu trúc giống nhau: Mỗi phân tử Ig đều có chuỗi polypeptit nặng (chuỗi H) và chuỗi nhẹ (chuỗi L) Các chuỗi polypeptit này được liên kết với nhau bởi liên kết cộng hóa trị và một số các liên kết khác Các chuỗi polypeptit nặng và nhẹ luôn xếp thành từng cặp và

có cấu trúc giống nhau tạo thành các cặp chuỗi

Tất cả các Ig đều có các chuỗi nhẹ thuộc về týp kappa và lambda, trong khi đó chuỗi nặng của các lớp Ig khác nhau thì khác nhau

Chuỗi nhẹ có trọng lượng phân tử khoảng 25.000, chứa khoảng 211 – 221 axit amin Ở tất cả các lớp globulin miễn dịch đều có hai loại chuỗi nhẹ kappa hoặc chuỗi nhẹ lambda Mỗi Ig chỉ chứa hoặc hai chuỗi nhẹ lambda hoặc hai chuỗi nhẹ kappa mà không bao giờ chứa cả hai loại Tất cả các chuỗi nhẹ đều có một vùng thay đổi và một vùng ổn định

Chuỗi nặng của các lớp kháng thể có trọng lượng phân tử nằm trong khoảng 50.000 – 77.000, chứa khoảng 450 axit amin Chuỗi nặng có vùng thay đổi và vùng ổn định Có 5 loại chuỗi nặng ứng với 5 lớp kháng thể

Tại các vùng thay đổi và vùng ổn định của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ có các cầu disulfur (S-S) nối các axit amin có vị trí cách xa nhau nhưng cùng nằm trên một chuỗi

và đã tạo ra một cấu trúc hình cầu

Vùng thay đổi chuỗi nặng và chuỗi nhẹ tham gia vào sự hình thành vị trí kết hợp kháng nguyên của phân tử kháng thể đặc hiệu cho từng quyết định kháng nguyên Chính vì sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể có tính đặc hiệu nên người ta ứng dụng phản ứng này để phát hiện kháng nguyên khi đã có kháng thể đặc hiệu, hoặc ngược lại, để phát hiện kháng thể khi đã có kháng nguyên tương ứng

Hai lớp Ig có vai trò quan trọng để phát hiện các kháng nguyên đặc hiệu là:

- Lớp IgG: là lớp chủ yếu trong đáp ứng miễn dịch chiếm khoảng 85% tổng số các Ig của huyết tương Số lượng lớn kháng thể lưu động đều thuộc lớp IgG, trọng lượng phân tử của IgG là 160.000, hằng số lắng là 7S, chứa 2,5% hydracacbon IgG là globulin miễn dịch quan trọng nhất ở người IgG là globulin miễn dịch duy nhất được truyền từ mẹ sang con qua nhau thai Trong 4-5 tháng đầu của thời kỳ thai nghén IgG

chỉ qua nhau thai được rất ít chỉ từ sau tuần thứ 20 mới qua được nhiều hơn Ba, bốn

tháng sau khi sinh, trẻ bắt đầu tự tổng hợp IgG Sau khi sinh, IgG kế thừa của mẹ sẽ bị

đào thải dần

Hình 1.3 Cấu tạo của phân tử IgG (trích từ http://vi.wikipedia.org/wiki/)

+ IgG được chia thành 4 lớp phụ: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, tất cả các cơ thể đều chứa 4 lớp phụ này và lớp phụ IgG1 chiếm tỷ lệ cao nhất và thấp nhất là IgG4 Chức năng của mỗi lớp phụ có thể khác nhau nhưng tất cả 4 lớp đều làm nhiệm vụ bảo vệ cơ

thể chống lại tác nhân gây bệnh

+ Gây ngưng kết tế bào vi khuẩn và trung hòa vi rút cũng là đặc điểm quan trọng của IgG Chúng gắn trên thụ thể của bề mặt vi khuẩn và vi rút làm cho vi khuẩn kết lại thành đám và làm cho vi rút không bám được vào thụ thể tế bào để nhân lên

- Lớp IgM: Chiếm 5 – 10% tổng globulin trong huyết thanh, là globulin miễn dịch lớn nhất, có trọng lượng phân tử 900.000 và hằng số lắng là 19S IgM được cấu tạo bởi 5 tiểu đơn vị với hằng số lắng là 7S, có cấu trúc gần giống như một hình sao 5 cánh, do đó, IgM có khả năng kết hợp kháng nguyên rất thuận lợi IgM là kháng thể thường xuất hiện đầu tiên sau khi cơ thể bị kháng nguyên kích thích IgG xuất hiện muộn hơn để thay thế cho IgM

T và B Sau khi nhận mặt, tế bào T tiết ra các chất kích thích để tế bào B tổng hợp kháng thể Mặc dù mối tương tác ban đầu giữa các kháng nguyên và APC có thể không đặc hiệu, nhưng ở các bước sau của quá trình tổng hợp kháng thể, tính đặc hiệu lại rất cao Các phân tử thụ thể trên bề mặt cả tế bào T (TCR) và tế bào B (kháng thể) sẽ bảo

đảm chắc chắn một kháng thể được tạo thành sẽ đặc hiệu với kháng nguyên kích thích sản sinh ra nó [19]

1.4.4.1 Tiếp cận kháng nguyên

Kháng nguyên được đưa tới mọi nơi trong cơ thể nhờ hệ máu và bạch huyết Nơi kháng nguyên đến khu trú là hạch lympho, lách và gan Kháng thể được tạo thành ở cả lách và hạch lympho nhưng không được tạo thành ở gan Nếu ta tiêm kháng nguyên vào tĩnh mạch thì lách sẽ là nơi tạo nhiều kháng thể nhất, ngược lại nếu tiêm dưới da, trong da hay màng bụng thì kháng thể được hình thành nhiều trong hạch lympho [1,19]

Sau khi có sự xâm nhập của kháng nguyên là thời kỳ tiềm ẩn, sau đó nồng độ kháng thể tăng dần rồi lại giảm xuống Phản ứng với mũi tiêm lần một gọi là đáp ứng kháng thể nguyên phát Khi tiêm kháng nguyên lần thứ hai sau vài ngày hay vài tuần, nồng độ kháng thể sẽ tăng lên nhanh chóng, 10 – 100 lần nhiều hơn nồng độ tiêm lần thứ nhất Sự tăng nhanh chóng nồng độ kháng thể này sẽ được gọi là đáp ứng kháng thể thứ phát Đáp ứng thứ phát là cơ sở để xây dựng quy trình sản xuất kháng huyết thanh [1,19]

Đáp ứng miễn dịch thứ phát

Tiêm kháng nguyên lần 2

Hình 1.4 Quá trình tiếp cận kháng nguyên và hình thành kháng thể

1.4.4.2 Sự hình thành kháng thể

Hình 1.5 Hoạt hóa tế bào B hình thành kháng thể

Các tế bào APC, B, T hợp tác với nhau trong quá trình hình thành kháng thể Tế bào B thông qua thụ thể là các globulin miễn dịch có khả năng nhận diện đặc hiệu kháng nguyên Kháng nguyên được đưa vào tế bào rồi được chuyển hóa Các peptit tạo thành được đưa ra trở lại ra bề mặt gắn với phức hợp kháng nguyên – MHC lớp II [1,7,19]

Bước tiếp theo là tế bào APC trình diện phức hệ kháng nguyên – MHC cho tế bào

T thông qua thụ thể của nó là tế bào TCR Phân tử MHC lớp II trên bề mặt APC sẽ tương tác với phân tử CD4 trên bề mặt tế bào TH Do được tiếp xúc thông qua kháng nguyên làm trung gian, tế bào TH kích thích tế bào B sản sinh ra yếu tố hoạt hóa Chất này lại kích thích tế bào B phân chia Kết quả là dòng tế bào B được hình thành Sau

đó lại xảy ra sự biệt hóa tiếp theo của dòng tế bào B đã hoạt hóa dẫn đến sự tạo thành một lượng lớn các tế bào plasma sản xuất kháng thể và dòng tế bào B nhớ Tế bào plasma có đời sống ngắn dưới một tuần nhưng lại tiết ra một lượng lớn kháng thể Ngược lại tế bào B nhớ có đời sống dài và khi có dịp gặp kháng nguyên đã kích thích lần đầu, chúng sẽ nhanh chóng thành tế bào plasma để sản xuất kháng thể Trí nhớ miễn dịch cũng là đáp ứng thứ phát dẫn đến việc sản xuất kháng thể một cách nhanh chóng, kịp thời và với số lượng lớn khi có sự kích thích lặp lại của kháng nguyên [19]

1.4.4.3 Kháng thể đơn dòng

Theo thuyết chọn dòng của Burnett thì mỗi lympho bào chỉ có khả năng nhận diện một quyết định kháng nguyên và sẽ chỉ tạo thành một dòng kháng thể đặc hiệu chống lại kháng nguyên đó Tuy nhiên hầu như các kháng nguyên đều có nhiều nhóm quyết định (kháng nguyên đa giá) nên sẽ tạo thành một phức hợp kháng thể Muốn nhận được chỉ một loại kháng thể trong phức hợp ấy phải tách tinh khiết, đây là một việc làm khó khăn Năm 1975 Milstein và Kohler đã đưa ra kỹ thuật sản xuất kháng thể đơn dòng ngoài cơ thể dựa trên nguyên tắc lai tế bào u tủy (myeloma) với tế bào lympho B đã hoạt hóa [7,8,19,38]

Ưu điểm của tế bào u tủy là có khả năng phân chia rất nhanh nhưng không tạo thành kháng thể Ngược lại tế bào lympho B có khả năng tổng hợp kháng thể nhưng không có khả năng phân chia vì chúng là các tế bào tận cùng của sự biệt hóa, do đó không nuôi cấy in vitro được và chúng sẽ bị chết sau một thời gian nuôi cấy Để có thể tạo được tế bào lai một mặt chọn trong số tế bào ung thư tủy loại tế bào đặc biệt chỉ có thể tổng hợp ADN với các axit amin đơn giản, glutamine và urenucleozit monophosphate Một mặt họ nuôi các tế bào này trong môi trường nhân tạo HAT (chứa hypoxantin – aminoprotein – timedin)

Tế bào lai có ưu điểm của hai tế bào nêu trên: vừa phân chia rất nhanh, vừa có khả năng tổng hợp kháng thể

Tiến hành pha loãng liên tục trong giếng của phiến nhựa vi lượng cho đến khi mỗi giếng chỉ có một tế bào Từ một tế bào đơn sẽ chỉ sản xuất một dòng kháng thể thuần khiết Do vậy kháng thể đơn dòng là kháng thể do một dòng tế bào B sinh ra để chống lại một quyết định kháng nguyên

1.4.5 Miễn dịch với Shigella

1.4.5.1 Miễn dịch tự nhiên

Chứng viêm nghiêm trọng gây ra bởi lỵ trực khuẩn có thể tồn tại trong ruột một vài tháng, cùng lúc đó là sự điều tiết của nhiều loại cytokine ( IL-1, TNF- , IL-6, IFN-, TNF- , IL10, TGF- và IL-8 ) giúp hình thành kháng thể chống lại trực khuẩn lỵ [43] Triệu chứng lâm sàng khi nhiễm lỵ trực khuẩn đã chứng minh có sự điều khiển trực tiếp của cytokine, chúng tồn tại nhằm kiểm soát và kiềm chế quá trình gây nhiễm của trực khuẩn lỵ [22]

Sự tồn tại của đại thực bào và sự thâm nhập của bạch cầu đa nhân không thể tiêu

diệt đƣợc Shigella bằng sự thực bào và giết chết tế bào của chúng [36,22] IL-18 có thể

đƣợc sinh ra từ những tế bào đích NK và lympho T qua quá trình tiêu diệt trực khuẩn của đại thực bào, cuối cùng sản sinh ra IFN- Tế bào nguyên sợi và đại thực bào hoạt hóa IFN- giúp xúc tiến quá trình tiêu diệt và kiềm chế sự nhân lên của trực khuẩn bên trong tế bào biểu mô [22,31,36]

Kết quả quan trọng nhất của đáp ứng miễn dịch bẩm sinh từ tế bào chủ là sự xuất hiện của cytokine dẫn đến sự di trú của những tế bào PMN

Cơ chế sao chép NF-k B hoạt hóa những tế bào biểu mô bị nhiễm Shigella làm

(cơ chế phụ thuộc LPS) sản sinh và bài tiết IL-8 IL-8 là chất hấp dẫn có hiệu lực đối với tế bào PMN

Shigella không thể trốn thoát hốc nhỏ thực bào của những tế bào PMN và chúng

bị tiêu diệt bên trong bởi quá trình thực bào Những nghiên cứu gần đây đã phát hiện ra enzyme phân giải của bạch cầu nhƣ là prôtein phòng vệ của tế bào chủ, có khả năng

làm tiêu hủy những prôtein độc tính của Shigella trong vòng 10 phút khi nhiễm vào

bạch cầu Cuối cùng những tế bào PMN đóng vai trò quyết định kiểm soát quá trình

gây nhiễm của Shigella, giam giữ tế bào vi khuẩn bên ngoài tế bào niêm mạc, ngăn

chặn sự xâm nhiễm sâu hơn vào mô và lan truyền bên trong cơ thể [22,43]

Gần đây người ta đã phát hiện cơ chế phòng chống trực tiếp khác của tế bào chủ

với Shigella: Sự bài tiết glycoprotein, lactoferrin trong ruột kết, sữa mẹ và tế bào thực bào có thể làm suy giảm khả năng xâm nhiễm của Shigella vào tế bào HeLa, bộc lộ

phức hệ IpaB-IpaC làm giảm enzyme phân giải protein thường gây tổn thương bề mặt

tế bào [22,36,43]

1.4.5.2 Miễn dịch tế bào

Cho đến nay, có rất ít tài liệu nói vế đáp ứng miễn dịch tế bào của vật chủ đối với

Shigella, đặc biệt khi so sánh với những vi khuẩn nội bào khác Những nghiên cứu đã

cho thấy rằng sự gia tăng hoạt động của tế bào T đối với những bệnh nhân nhiễm lỵ trực khuẩn, tế bào T đơn dòng sinh ra nhiều khi đáp ứng chống lại kháng nguyên

Shigella, chúng đã được phân lập [22] Những nghiên cứu cho thấy Cytokin đã sinh ra khi gây miễn dịch kháng nguyên Shigella flexneri, tạo ra đáp ứng của lympho Th1 và

Th2 Thêm vào đó, sư gia tăng tính nhạy cảm của bệnh nhân AIDS (thiếu hụt tế bào T

và CD4+) với nhiễm lỵ trực khuẩn có thể cho thấy rằng đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào đóng vai trò bảo vệ khi nhiễm lỵ [22,34,35,47]

Hơn thế nữa, những nghiên cứu với vắc xin Shigella dự tuyển cho thấy sự đóng

góp của tế bào Lympho T đối với đáp ứng miễn dịch bảo vệ tế bào chủ, chuột đã được

bảo vệ sau khi tái gây nhiễm chuột đã được chủng vắc xin với chủng Shigella hoang

dại có độc lực cao

1.4.5.3 Miễn dịch dịch thể

Thông tin về đáp ứng miễn dịch dịch thể của vật chủ đối với nhiễm Shigella đã

được đánh giá từ nhiều nghiên cứu huyết thanh học trên người bị nhiễm bệnh và những thử nghiệm được thực hiện trên động vật mẫu Những tài liệu nghiên cứu chứng minh đáp ứng miễn dịch dịch thể đóng vai trò chính trong hệ thống miễn dịch chống lỵ trực khuẩn, đáp ứng của tế bào niêm mạc và cơ thể nói chung chống lại LPS và một vài plasmid độc mã hóa các protein, bao gồm cả Ipa prôtein Cấu trúc huyết thanh đặc

trưng của LPS thì không giống với đích chính của của đáp ứng miễn dịch vật chủ Có rất ít sự bảo vệ chéo giữa các týp huyết thanh, miễn dịch mang tính chất đặc hiệu (ở Chi lê có đến 76% trường hợp có hiệu quả bảo vệ chống lại sự tái nhiễm với cùng týp huyết thanh

Đáp ứng miễn dịch chống lại Shigella phụ thuộc cả cơ thể và niêm mạc, bài tiết ra

IgM, IgG và IgA

Mặt dù, lỵ trực khuẩn thông thường nhiễm cục bộ tại niêm mạc nhưng kháng thể IgG và IgM chống lại LPS và kháng nguyên plasmid độc được phát hiện trong máu của người nhiễm bệnh tự nhiên IgG và có thể IgM trực tiếp chống lại LPS đã cho thấy chúng đóng vai trò bảo vệ trong nghiên cứu đáp ứng miễn dịch bảo vệ chống lại

Shigella trên chuột Chuột đã được gây miễn dịch mà thiếu hụt IgA vẫn được bảo vệ để chống lại chủng Shigella thử thách, điều này chứng minh hệ thống miễn dịch đã sinh ra

IgG và IgM để bảo vệ vật chủ

1.5 Chẩn đoán

Việc phát hiện sớm và chẩn đoán kịp thời có ý nghĩa quan trọng trong phòng chống và điều trị nhằm hạn chế tử vong, lan truyền dịch bệnh

1.5.1 Chẩn đoán lâm sàng

- Dựa vào các hội chứng bệnh lý của thời kỳ khởi phát và thời kỳ toàn phát

- Dựa vào công thức máu: Bạch cầu thường tăng trong khoảng 5.000 – 15.000/mm3 với tỷ lệ đa nhân trung tính chiếm ưu thế Có thể có phản ứng tủy xương với bạch cầu tăng đến 30.000/mm3

máu [2,11,14,15]

- Xét nghiệm phân: soi phân tươi, xem đại thể trường hợp nặng thấy phân lỏng có nhiều nhầy mủ và máu Lấy một giọt phân (phần đàm máu) trộn với hai giọt methylen đem soi kính hiển vi sẽ thấy có rất nhiều hồng cầu, bạch cầu đa nhân Hồng cầu và bạch cầu dày đặc thường gặp ở 89% trường hợp, bạch cầu âm tính gặp ở những trường

hợp phân lỏng Ở trẻ em, phân có nhầy máu chỉ gặp 61,3%, phân không máu chiếm 17% và phân lỏng đơn thuần chiếm 19,7% [15,57]

Soi trực tràng: thấy hình ảnh viêm lan tỏa cấp tính niêm mạc, có nhiều vết loét cạn 5 – 7 mm, có thể có xuất huyết và cần lấy chất nhầy tại chỗ loét để tìm vi trùng

1.5.2 Chẩn đoán vi sinh

Phân lập vi khuẩn qua cấy phân, có thể đạt tỷ lệ dương tính trên 20% thậm chí trên 70% nếu bệnh phẩm lấy tốt (nhầy, máu) Cấy tại dường bệnh khi chưa dùng kháng sinh và cấy nhắc lại 3 lần trong 3 ngày đầu Cấy vào trong môi trường thạch Leifson hay Mac Conkey

1.5.3 Chẩn đoán huyết thanh

Sự hiểu biết đầy đủ về huyết thanh học tích lũy được qua nhiều thập kỷ cùng với việc ứng dụng các phương pháp huyết thanh đã đem lại những lợi ích to lớn trong việc chẩn đoán các tác nhân gây bệnh Phản ứng thường được sử dụng trong chẩn đoán nhận dạng phân biệt là phản ứng kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể bằng kỹ thuật ngưng kết nhanh trên lam kính có thể quan sát được bằng mắt thường [1,5,17,24] Khi cho một kháng nguyên hữu hình (các tế bào vi khuẩn (tbvk), hồng cầu…) gặp kháng thể tương ứng đặc hiệu sẽ hình thành một đám ngưng kết các kháng nguyên, hỗn dịch xung quanh trở nên trong, đó là hiện tượng ngưng kết Trên cơ sở này có thể đọc được kết quả một cách dễ dàng

Ngoài ra, còn có các phương pháp kỹ thuật miễn dịch học khác như việc dùng kháng thể đặc hiệu gắn lên latex hoặc điện di miễn dịch đối lưu cũng được sử dụng để

phát hiện kháng nguyên hòa tan của Shigella trong mẫu phân tươi hay dịch nhầy

Kháng huyết thanh chẩn đoán còn có tác dụng trong chẩn đoán hồi cứu nhằm xác định nguồn gốc lỵ trực khuẩn đối với trường hợp mãn tính cấy phân không đem lại kết quả

1.6 Tình hình sản xuất kháng huyết thanh chẩn đoán ở Việt Nam và trên thế giới

- Kháng huyết thanh miễn dịch có giá trị thương mại và thường có giá thành cao Chúng được sử dụng để kiểm tra chất lượng vắc xin hay để nhận dạng chủng phân lập

từ bệnh phẩm Mỗi nhà nghiên cứu phải tự mình xây dựng một quy trình sản xuất thích hợp tùy thuộc vào điều kiện và mục đích sử dụng kháng huyết thanh

- Có nhiều quy trình đã được sử dụng sản xuất thành công kháng huyết thanh có hiệu giá kháng thể cao, đặc hiệu Tuy nhiên không thể áp dụng các quy trình này cho mọi trường hợp mà mỗi loại kháng huyết thanh cần được xây dựng mình một quy trình thích hợp riêng [30]

1.6.1 Sản xuất kháng huyết thanh chẩn đoán Salmonella

- Kháng huyết thanh Salmonella là loại kháng huyết thanh được nhiều nơi sản

xuất nhằm sử dụng để phục vụ cho công tác chẩn đoán để nhận dạng chủng phân lập từ bệnh phẩm, kiểm tra tính đặc hiệu của chủng giống trong sản xuất vắc xin

- Trên thế giới đã có nhiều nhà sản xuất cung cấp kháng huyết thanh Salmonella:

Sanofi của Pháp, Difco của Mỹ, Bio Rad, Thụy Điển,…

- Ở nước ta kháng huyết thanh Salmonella đã được sản xuất tại Viện Pasteur

Thành phố Hồ Chí Minh và Công ty Vắc xin Pasteur Đà Lạt với số lượng sản xuất đã cung ứng đủ nhu cầu kháng huyết thanh phục vụ công tác chẩn đoán huyết thanh học cho các bệnh viện và trung tâm y tế [18]

- Quy trình sản xuất kháng huyết thanh Salmonella [18]

+ Sản xuất kháng nguyên theo phương pháp nuôi cấy bề mặt trên môi trường thạch dinh dưỡng Huyền dịch vi khuẩn thu được được bất hoạt bằng nhiệt (ở 100o

C/2 giờ) hay formol 0,5% Kháng nguyên được tinh sạch bằng cồn tuyệt đối và aceton Sấy

nhẹ ở nhiệt độ 37oC/24 giờ, thu kháng nguyên ở dạng bột Kháng nguyên pha để gây miễn dịch có đậm độ 2 – 4.109

tbvk/ml

+ Gây miễn dịch trên thỏ theo đường tiêm là tĩnh mạch tai Pháp đồ gây miễn dịch là 5 mũi tiêm và mỗi mũi tiêm cách nhau 5 ngày: 0,5 ml, 1,0 ml, 2,0 ml, 3,0 ml, 4,0 ml Sau 7 ngày của mũi cuối cùng, thu kháng huyết thanh Phương pháp này thu được kháng huyết thanh có hiệu giá cao ≥ 1/5000

+ Kháng huyết thanh được tách chiết từ máu sau đó chúng được tinh chế nếu là kháng huyết thanh đơn giá Sau khi xác định hiệu giá kháng thể, kháng huyết thanh được đóng ống kiểm tra chất lượng [18]

1.6.2 Sản xuất kháng huyết thanh chẩn đoán não mô cầu

- Trên thế giới Sanofi Pasteur- Pháp và Difco- Mỹ là hai nhà sản xuất lớn đã cung cấp kháng huyết thanh não mô cầu đa giá và kháng huyết thanh nhóm A, B, C, W135 cho nhiều phòng thí nghiệm khác nhau của nhiều nơi trên thế giới Các kháng huyết thanh này đảm bảo tính đặc hiệu và độ nhạy trong vòng vài phút là có thể nhận dạng được các tác nhân gây bệnh viêm màng não

- Tại Việt Nam, Công ty vắc xin Pasteur Đà Lạt là nơi nghiên cứu sản xuất kháng huyết thanh chẩn đoán não mô cầu đầu tiên trong cả nước vào năm 2006 Kháng huyết thanh sản xuất được có hiệu giá kháng thể cao tương đương so với kháng huyết thanh của Sanofi bán trên thị trường và giá thành cũng thấp hơn nhiều [16]

- Quy trình sản xuất kháng huyết thanh não mô cầu

+ Chủng giống sau khi được chọn lựa thì tiến hành nuôi cấy để thu kháng nguyên trên môi trường thạch dinh dưỡng bổ sung máu 5% ở 37oC/48 giờ Bất hoạt huyền dịch