Các yếu tố chính cần quan tâm trong sản xuất kháng huyết thanh Lỵ trực khuẩn [3,4,7,30,53]:
- Chủng giống: chủng giống sử dụng trong sản xuất phải đảm bảo thuần khiết, có tính ổn định cao, đảm bảo các đặc tính sinh học cơ bản và có đầy đủ kháng nguyên đặc hiệu cho từng nhóm. Phải kiểm tra kháng nguyên đặc hiệu trƣớc khi đƣa kháng nguyên vào sản xuất kháng huyết thanh.
- Môi trường: Đây là vi khuẩn có thể phát triển dễ dàng trên nhiều loại môi trƣờng, tuy nhiên cần phải đánh giá và chọn lựa môi trƣờng thích hợp để thu đƣợc kháng nguyên tốt nhất. Môi trƣờng phải đặc hiệu, dễ pha chế và giá thành thấp.
+ Súc vật thí nghiệm: Chất lƣợng súc vật trƣớc tiên là xác định chế độ ăn uống và điều kiện chăm sóc thích hợp, nhằm tránh đƣợc nguồn lây nhiễm các mầm bệnh làm ảnh hƣởng đến đáp ứng miễn dịch và có thể tạo ra các kháng thể không thích hợp hoặc gây phản ứng chéo. Vì thế trƣớc khi bắt đầu quy trình gây miễn dịch nên kiểm tra sự hiện diện của các kháng thể này. Sản xuất kháng huyết thanh chẩn đoán gây miễn dịch trên thỏ là thích hợp nhất.
- Xác định phát đồ gây miễn dịch thích hợp nhất: liều kháng nguyên, đƣờng tiêm, thời điểm lấy máu thu huyết thanh.
- Chất lượng kháng huyết thanh sản xuất được: đạt yêu cầu vật lý, vô trùng có hiệu giá kháng thể cao (độ nhạy cao), đặc hiệu và có tính ổn định nhiệt theo thời gian.
Để phục vụ cho nhu cầu giám sát tác nhân gây bệnh và các mục đích khác, nhiều nƣớc trên thế giới đã nghiên cứu sản xuất kháng huyết thanh Lỵ trực khuẩn.
Sanofi Pasteur- Pháp và Difco- Mỹ là hai nhà sản xuất lớn đã cung cấp kháng huyết Lỵ trực khuẩn đơn giá và đa giá cho nhiều phòng thí nghiệm khác nhau ở nhiều quốc gia trên thế giới. Các kháng huyết thanh này đảm bảo tính đặc hiệu và độ nhạy trong vòng vài phút là có thể nhận dạng đƣợc các tác nhân gây Lỵ trực khuẩn.
Ở Việt Nam đã có một số tác giả nghiên cứu kháng huyết thanh chẩn đoán
Shigella, tuy nhiên vẫn chƣa cho hiệu quả cao nhƣ mong muốn để có thể bán trên thị trƣờng [3,4]. Cho đến nay, kháng huyết thanh chẩn đoán Shigella dùng trong các phòng xét nghiệm vi sinh phải nhập nội và không chủ động, giá mua đắt.
Xuất phát từ nhu cầu thực tế của sản phẩm chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu và sản xuất kháng huyết thanh chẩn đoán lỵ trực khuẩn nhằm phục vụ cho công tác chẩn đoán sớm và giám sát tác nhân gây bệnh Lỵ trong cộng đồng.
Chƣơng 2:
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu
2.1.1. Chủng giống
Chủng giống sử dụng để gây miễn dịch sản xuất kháng huyết thanh có nguồn gốc từ viện Pasteur Paris Pháp ở dạng đông khô gồm:
- Chủng Shigella dysenteriae SG - Chủng Shigella flexneri HN1 - Chủng Shigella boydii 116 - Chủng Shigella sonnei 285
2.1.2. Kháng huyết thanh mẫu
- Kháng huyết thanh đơn giá Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii, Shigella sonnei Sanofi – Pháp: Loạt 8D122R và 8F140Y
2.1.3. Môi trƣờng
2.1.3.1. Môi trường thạch dinh dưỡng (Nutrient agar) Merck – Đức
- Pepton thịt : 5g
- Cao thịt : 3g
- Thạch : 12g
- Nƣớc cất vừa đủ : 1000ml
- pH : 7,2 ± 0,2
2.1.3.2. Môi trường thạch LB (Luria Broth Agar)
- Yeast extract : 5g
- NaCl : 10g
- Thạch : 15g
- Nƣớc cất vừa đủ : 1000ml
- pH : 7,2 ± 0,2
2.1.3.3. Môi trường canh thang 7,2
- Nƣớc thịt : 1000ml - Pepton : 5g - NaCl : 5g - Nƣớc cất vừa đủ : 1000ml - pH : 7,2 ± 0,2 2.1.3.4. Môi trường thạch 7,2 - Nƣớc thịt 1/2 : 500 ml
- Nƣớc bao tử thủy phân : 500 ml
- NaCl : 5 g
- Agar : 25 g
- pH : 7,2 ± 0,2
2.1.3.5. Môi trường Mannit – di động
- Pepton Pepsine : 20g - Mannitol : 10g - Rouge phenol 1% : 2,5ml - Agar : 5g - Nƣớc cất : 1000ml - pH : 8,2 ± 0,2
- L. Cystine : 0.5g - NaCl : 2.5g - Dextrose : 5.5g - Thạch : 0.5g - Cao nấm men : 5.0g - Casein hydrolysate : 15g - Resazurin : 1.0mg - Sodium thioglycolate : 0.5g - Nƣớc cất vừa đủ : 1000ml - pH : 7,1 ± 0,2
2.1.3.7. Môi trường Urea, EMD – Đức
- Pepton : 1,0g - D-Glucose : 1,0g - NaCl : 5,0g - KH2PO4 : 2,0g - Phenol đỏ : 0,012g - Agar : 12g - Nƣớc cất vừa đủ : 1000ml - pH : 6,8 ± 0,2 2.1.4. Các hoá chất - NaCl, Merck - Đức.
- Formaldehyt (Formol) 98%, Merck - Đức. - Thiomersal, Merck - Đức.
- Acetone, tinh khiết- Trung Quốc. - Cồn tuyệt đối Merck - Đức. - Cồn 90%, Việt Nam.
- Iot tinh, Trung Quốc.
- Xanh Bromothymol, Merck - Đức. - Rouge phenol, Merck - Đức.
- Tá chất Freund toàn phần, Sigma – Mỹ - Tá chất TiterMax, Sigma – Mỹ
- Các dung dịch đƣờng 30%: glucose, lactose, maltose, saccharose. - Thuốc nhuộm Gram Fuchsin kiềm, tím gentian, lugol, Merck – Đức
2.1.5. Các nguyên liệu khác
- Nƣớc muối sinh lý 8,5‰, nƣớc thịt ½, nƣớc bao tử thủy phân, Công ty Vắc xin Pasteur Đà Lạt sản xuất
- Lọ thủy tinh 2ml, nút cao su và nắp nhôm. - Hộp đóng gói, hƣớng dẫn sử dụng, đầu nhỏ giọt
2.1.6. Súc vật thí nghiệm
Thỏ khỏe mạnh trọng lƣợng từ 2,5kg - 3,5kg.
2.1.7. Chủng và mẫu Shigella phân lập từ thực địa
- Chủng Shigella: Shigella dysenteriae 88; Shigella flexneri HN2; Shigella boydii 116; Shigella sonnei HN.
- Mẫu Shigella phân lập từ thực địa: Shigella flexneri 83; Shigella flexneri 60; Shigella flexneri 101; Shigella flexneri 73; Shigella sonnei
2.1.8. Dụng cụ và các thiết bị cần dùng
2.1.8.1. Dụng cụ thí nghiệm cần thiết
- Đĩa petri, các loại ống nghiệm có đƣờng kính 12mm, 18mm, 22mm - Pipette các loại 1ml, 2ml, 5ml, 10ml.
- Lam kính, đèn cồn, que cấy, kẹp inox, găng tay cao su, giấy thấm, gòn không thấm nƣớc, gòn thấm nƣớc.
- Kim tiêm, bơm tiêm và ống cao su - Hộp Roux.
2.1.8.2. Trang thiết bị chuyên dùng
- Máy li tâm Herlm 6000 vòng/phút - Đức. - Máy đo pH, WTW- Đức.
- Tủ lạnh (-80oC) Nuaire – Mỹ. - Lò hấp ƣớt Hirayama - Nhật. - Lò sấy khô Memmert - Đức. - Tủ ấm nuôi cấy Memmert - Đức. - Tủ lạnh Sanyo, Nhật.
- Bộ so độ đục - Viện Tarasevich Liên Xô (cũ). - Buồng cấy vô trùng Class B Nuaire - Hoa Kỳ. - Cân Prolabo - Pháp.
- Kính hiển vi Olympus - Nhật. - Nồi chƣng cách thủy Joan - Pháp.
2.2. Phƣơng pháp
2.2.1. Pha chế môi trƣờng nuôi cấy
2.2.1.1. Pha chế môi trường thạch dinh dưỡng (Nutrient agar)
- Theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất: cho 20g môi trƣờng hòa tan hoàn toàn trong 1 lít nƣớc cất, đun sôi, phân môi trƣờng vào các ống nghiệm mỗi ống 20ml, mỗi hộp Roux 150ml và bình tam giác. Hấp khử trùng ở 121oC/20phút.
- Đợi nhiệt độ hạ xuống 55 - 60oC, lấy thạch ra nghiêng ống nghiệm và hộp Roux đặt ngữa trên mặt bàn phẳng để môi trƣờng thạch đông. Thạch trong bình tam giác đƣợc phân vào đĩa Petri đã tiệt trùng, độ dày của thạch khoảng 3 – 4mm.
2.2.1.2. Pha chế môi trường thạch LB
- Cho 5g Yeast extract, 10g Trypton, 10g NaCl và 15g thạch vào bình tam giác. Cho vừa đủ 1 lít nƣớc cất vào, đun sôi để làm tan hoàn toàn môi trƣờng. Phân môi trƣờng vào các ống nghiệm mỗi ống 20ml và mỗi hộp Roux chứa 150ml.
- Hấp khử trùng ở 121oC/20phút.
- Đợi nhiệt độ hạ xuống 55 - 60oC, lấy thạch ra và nghiêng ống nghiệm và hộp Roux đặt ngữa trên mặt bàn phẳng để môi trƣờng thạch đông.
2.2.2. Pha chế môi trƣờng kiểm tra
2.2.2.1. Pha chế môi trường canh thang 7.2
- Thêm 5g NaCl và 5g Pepton vào nƣớc thịt ½ khuấy đều cho tan hết. Dùng NaOH 40% để chỉnh pH = 7,2 ± 0,2. Lọc canh thang đã chỉnh pH qua giấy lọc, phân đều 10 ml vào mỗi ống nghiệm.
- Hấp khử trùng ở 121oC/20 phút. - Nhiệt độ hạ xuống 55 - 60oC
- Thêm 0.2 ml các loại đƣờng glucose (30%), mannitol (30%), saccharose (30%) và lactose (30%) vào từng dãy các ống nghiệm môi trƣờng canh thang. Ủ 37o
C trong 24 giờ, kiểm tra các ống môi trƣờng trong, không vẩn đục.
2.2.2.2. Pha chế môi trường thạch 7.2
- Đong vừa đủ 500ml nƣớc thịt ½, 500ml nƣớc bao tử thủy phân cho vào bình chứa, thêm 5g NaCl và 25g thạch vào. Đun sôi để làm tan hoàn toàn hóa chất. Phân 10ml môi trƣờng vào các ống nghiệm 18mm và 150ml vào mỗi hộp Roux.
- Hấp khử trùng ở 121oC/20 phút, khi nhiệt độ hạ xuống 55 - 60oC, lấy thạch ra nghiêng ống nghiệm và đặt ngữa hộp Roux trên bàn phẳng.
2.2.2.3. Pha chế môi trường thạch mềm Mannit
- Cân Mannitol và agar cho vào nồi, thêm 500ml nƣớc cất. Khuấy đều hoặc nung nhẹ cho hóa chất tan hết. Sau đó thêm Pepton pepsine và rouge phenol 1%, cho nƣớc cất vào vừa đủ 1000ml và khuấy đều. Dùng NaOH 40% để chỉnh pH = 8,2 ± 0,2. Phân đều 10ml môi trƣờng vào các ống nghiệm. Hấp khử trùng ở 121o
C/20phút.
2.2.2.4. Pha môi trường thioglycolate
- Đầu tiên hòa tan L. Cystein trong ít nƣớc cất có pha 5 - 6ml NaOH 10% rồi đổ vào hỗn hợp các chất casein, cao nấm men, NaCl, thạch trong 1 lít nƣớc cất, đun nóng và khuấy thạch trong 5 – 10 phút để thạch tan hoàn toàn. Sau đó, bù nƣớc cho đủ thể tích ban đầu, hạ nhiệt độ xuống 30oC rồi cho glucose và Na thioglycolate vào.
- Lọc qua 2 lần giấy lọc hoặc vải, chỉnh pH = 7,2 - 7,3, thêm Resaruzin vào. Phân vào ống nghiệm 18mm, hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121oC/20 phút, lấy ra và làm nguội nhanh ở 25oC. Môi trƣờng có màu hồng ở phần trên.
2.2.2.5. Pha môi trường Urea
- Pha chế theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất: 21g môi trƣờng hòa tan hoàn toàn trong 1 lít nƣớc cất. Hấp khử trùng ở 121o
- Đợi nhiệt độ hạ xuống 45 – 55oC, thêm 50ml dung dịch Urea 40% đã tiệt trùng qua lọc tiệt trùng. Phân đều 10ml môi trƣờng vào các ống nghiệm 18mm và đặt nghiêng ống thạch để tạo bề mặt nuôi cấy.
2.2.3. Phƣơng pháp kiểm tra tính chất sinh học của Shigella2.2.3.1. Kiểm tra độ thuần khiết 2.2.3.1. Kiểm tra độ thuần khiết
- Làm tiêu bản: Dùng que cấy đã đốt khử trùng để nguội lấy một vòng canh khuẩn dàn đều và mỏng trên lam kính sạch và hơ thoáng qua trên ngọn lửa đèn cồn. Khi tiêu bản đã khô, nhỏ vài giọt cồn 90% lên tiêu bản và hơ qua đèn cồn để làm khô tiêu bản.
- Nhuộm tiêu bản: Đổ thuốc nhuộm tím gentian phủ kín lên tiêu bản và nhỏ thêm 2 – 3 giọt dung dịch lugol để vi khuẩn bắt màu tốt hơn, đợi 1 phút nghiêng lam kính đổ thuốc nhuộm đi. Sau đó dùng cồn - acetone để tẩy màu tới khi tiêu bản sạch, rửa lại qua nƣớc cất. Cho vài giọt thuốc nhuộm fuchsin phủ lên tiêu bản, đợi trong 1 phút rồi đổ đi, cuối cùng rửa lại qua nƣớc cất, làm khô tiêu bản bằng cách thấm vào giấy lọc.
- Quan sát: Nhỏ lên lam kính 1 giọt dầu quan sát bằng kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 1000 lần và đọc kết qủa.
2.2.3.2. Thử phản ứng lên men đường
- Chọn khuẩn lạc điển hình của từng nhóm Shigella trên môi trƣờng thạch dinh dƣỡng cấy chuyền vào các ống môi trƣờng canh thang 7,2 và ủ 37oC trong 18 giờ.
- Từ canh khuẩn của từng nhóm Shigella, lấy 0,5ml canh khuẩn cho vào môi trƣờng canh thang 7,2 đã bổ sung các loại đƣờng, hai ống trên mỗi loại đƣờng và để hai ống đối chứng (không cho canh khuẩn vào). Ủ ở nhiệt độ 37o
C.
- Đọc kết quả: Nhỏ 3 giọt thuốc thử xanh Bromothymol vào các dãy môi trƣờng canh thang và quan sát sự chuyển đổi màu môi trƣờng sau 24 giờ và 48 giờ.
+ Dƣơng tính: Môi trƣờng từ xanh chuyển sang vàng + Âm tính: Môi trƣờng vẫn giữ màu xanh
2.2.3.3. Thử tính di động của Shigella trên môi trường Mannit.
- Chọn khuẩn lạc điển hình của từng nhóm Shigella trên môi trƣờng thạch dinh dƣỡng. Dùng que cấy thẳng chấm nhẹ vào giữa khuẩn lạc và cấy thẳng đứng vào ống thạch mềm mannit (1,5 – 2,5 cm chiều sâu), ủ 37oC trong 24 giờ.
- Đọc kết quả:
+ Âm tính: Vi khuẩn mọc thẳng theo đƣờng cấy
+ Dƣơng tính: Vi khuẩn mọc theo đƣờng xoắn ốc, không thẳng
2.2.3.4. Kiểm tra khả năng phân giải Urea
- Từ canh khuẩn của từng nhóm Shigella trên canh thang, lấy 0,5ml canh khuẩn cho vào ống môi trƣờng Urea, láng đều bề mặt thạch. Ủ 37oC trong 24 giờ.
- Đọc kết quả:
+ Âm tính: Môi trƣờng vẫn giữ nguyên màu vàng
+ Dƣơng tính: Môi trƣờng chuyển từ màu vàng sang màu hồng – đỏ.
2.2.4. Phƣơng pháp kiểm tra vô trùng
- Dùng pippet lấy 2ml dung dịch cần kiểm tra vô trùng cấy vào 2 ống môi trƣờng thạch 7,2 và 2 ống môi trƣờng thioglycolate. Ủ các ống môi trƣờng thạch kiểm tra ở nhiệt độ 35o
C - 37oC để phát hiện vi khuẩn hiếu khí và vi khuẩn kỵ khí, hai ống môi trƣờng thioglycolate ủ ở nhiệt độ 22o
C - 25oC để phát hiện nấm mốc. Theo dõi trong vòng 14 ngày ở cả hai nhiệt độ trên.
- Đọc kết quả:
+ Đối với dung dịch kiểm tra là vi khuẩn sống: Trên môi trƣờng thạch 7,2 vi khuẩn mọc đều, không phát hiện có sinh vật lạ mọc và trên môi trƣờng thioglycolate môi trƣờng đục đều, không phát hiện thấy nấm hay vi sinh vật lạ thì đạt vô trùng.
+ Đối với dung dịch kiểm tra là dịch vô khuẩn: Trên môi trƣờng thạch 7,2 không phát hiện có sinh vật mọc và trên môi trƣờng thioglycolate không bị vẩn đục hoặc đổi màu thì đạt vô trùng. Nếu bị nhiễm dù chỉ một ống, tiến hành kiểm tra lại lần 2.
2.2.5. Phƣơng pháp kiểm tra tính đặc hiệu kháng nguyên theo kỹ thuật ngƣng kết nhanh trên lam kính ngƣng kết nhanh trên lam kính
- Cấy các chủng Shigella vào đĩa thạch dinh dƣỡng, ủ ở 37o
C/18 giờ. Lấy khuẩn lạc điển hình làm ngƣng kết trên phiến kính với các kháng huyết thanh mẫu.
+ Chuẩn bị 2 lam kính sạch cho mỗi mẫu Shigella
+ Nhỏ lần lƣợt một giọt: Nƣớc muối sinh lý, kháng huyết thanh mẫu Sh. dysenteriae, Sh. flexneri, Sh. boydii, Sh. sonnei vào 2 lam kính.
+ Dùng que cấy đã khử trùng chọn vài khuẩn lạc điển hình của từng loại vi khuẩn, tán đều vào giọt nƣớc muối sinh lý. Sau đó khử trùng que cấy lại trên ngọn lửa đèn cồn và lấy một vài vi khuẩn này tán đều vào kháng huyết thanh mẫu Sh. dysenteriae, Sh. flexneri, Sh. boydii, Sh. sonnei.
+ Lắc nhẹ lam kính để ngƣng kết xảy ra và hoàn tất trong vòng 1 phút. + Xem kết quả trên nền đen hoặc gƣơng lõm.
- Đọc kết quả:
+ Nƣớc muối sinh lý không tạo ngƣng kết với vi khuẩn, chỉ tạo thành một hỗn dịch màu trắng đục.
+ Kháng huyết thanh mẫu chỉ tạo ngƣng kết thành hạt với các ngƣng kết nguyên đặc hiệu tƣơng ứng, còn lại chỉ tạo thành một hỗn dịch màu trắng đục.
2.2.6. Phƣơng pháp sản xuất kháng nguyên
Quá trình sản xuất kháng nguyên theo phƣơng pháp nuôi cấy trên bề mặt môi trƣờng thạch rắn ở hộp Roux, đƣợc tiến hành theo quy trình sau: