Quá trình sản xuất kháng nguyên theo phƣơng pháp nuôi cấy trên bề mặt môi trƣờng thạch rắn ở hộp Roux, đƣợc tiến hành theo quy trình sau:
Sh. dysenteriae, S. flexneri, Sh. boydii, Sh. sonnei Ly tâm bỏ nƣớc nổi 5000 vòng/30 phút Thạch LB 37oC/18 giờ Hộp Roux thạch dinh dƣỡng 37oC/22 giờ Gặt hỗn dịch vi khuẩn bằng nƣớc muối sinh lý
Bất hoạt canh khuẩn bằng nhiệt (100oC/2 giờ) Hoàn nguyên với nƣớc muối sinh lý
Kiểm tra thuần khiết Kiểm tra vô trùng
Kháng nguyên
Shigella
Ly tâm bỏ nƣớc nổi 5000 vòng/30 phút Bất hoạt canh khuẩn bằng
Formol 5%
Rửa với nƣớc muối sinh lý
Rửa bằng cồn tuyệt đối 37oC/4 giờ
Rửa với nƣớc muối sinh lý
Rửa bằng Aceton (3 lần) 37oC/4 giờ
Sấy khô 37oC/24 giờ
Thu KN Shigella
Kiểm tra thuần khiết Kiểm tra vô trùng
Ly tâm bỏ nƣớc nổi 5000 vòng/30 phút Kiểm tra: Vô trùng, thuần khiết, tính đặc hiệu kháng nguyên
Mô tả quy trình sản xuất kháng nguyên:
- Nhân chủng: Chủng Shigella đƣợc hoàn nguyên với nƣớc muối sinh lý sau đó cấy vào môi trƣờng thạch LB trong ống nghiệm 22mm láng đều khắp bề mặt, ủ ở nhiệt độ 37o
C/18 giờ. Kiểm tra vô trùng chủng trên môi trƣờng thioglycolate và thạch 7,2. - Nuôi cấy vi khuẩn: Sau 18 giờ chọn những ống nghiệm có Shigella phát triển mạnh và khuẩn lạc điển hình trên thạch LB. Cho nƣớc muối sinh lý vào đánh tan và cấy chuyền dịch vi khuẩn vào các hộp Roux thạch dinh dƣỡng và láng đều khắp bề mặt môi trƣờng. Đặt vào tủ ấm 37o
C/48 giờ đồng thời kiểm tra độ thuần khiết, vô trùng. - Gặt và bất hoạt vi khuẩn:
+ Đọc kết qủa kiểm tra vô trùng và chọn những hộp Roux không bị tạp nhiễm, cho nƣớc muối sinh lý vào mỗi hộp Roux và lắc nhẹ làm bong hết các khuẩn lạc mọc trên bề mặt môi trƣờng tạo thành huyền dịch đồng nhất.
+ Bất hoạt huyền dịch thu đƣợc bằng formol 5% hay ở nhiệt độ 100oC/ 2 giờ. Ly tâm dịch vi khuẩn ở 5000 vòng/phút trong 30 phút để thu cặn tế bào.
+ Rửa lại cặn tế bào vi khuẩn với cồn tuyệt đối, ủ 37oC trong 4 giờ và sau đó ly tâm dịch vi khuẩn ở 5000 vòng/phút trong 30 phút để thu cặn tế bào.
+ Rửa 3 lần cặn tế bào vi khuẩn với acetone, ủ 37o
C trong 4 giờ và sau đó ly tâm dịch vi khuẩn ở 5000 vòng/phút trong 30 phút để thu cặn tế bào.
+ Sấy khô cặn tế bào ở 37oC trong 24 giờ, tán mịn ta thu đƣợc kháng nguyên
Shigella. Bảo quản kháng nguyên ở 2 – 8o
C.
+ Hoàn nguyên lƣợng nhỏ kháng nguyên trên với nƣớc muối sinh lý. Kiểm tra vô trùng, thuần khiết, đo độ đục và nhận dạng kháng nguyên bằng phản ứng ngƣng kết với kháng huyết thanh đặc hiệu nhóm.
+ Điều chế kháng nguyên miễn dịch: dựa vào độ đục đo đƣợc để pha loãng điều chế kháng nguyên miễn dịch.