2.2.7.1. Quy trình sản xuất kháng huyết thanh
Hình 2.2. Quy trình sản xuất kháng huyết thanh
Kiểm tra:
Vô trùng, thuần khiết, tính đặc hiệu kháng nguyên
Hấp phụ kháng huyết thanh
Kiểm tra vô trùng, đặc hiệu
Định lƣợng hiệu giá kháng thể Kháng huyết thanh đơn
giá, đặc hiệu
Pha kháng huyết thanh
Đóng ống, đóng gói Pha kháng nguyên
Sh. dysenteriae, Sh. flexneri,
Sh. boydii, Sh. sonnei
Gây miễn dịch trên thỏ khỏe mạnh
Lấy máu thỏ
Thu kháng huyết thanh Để lạnh 2 o
C – 8oC trong vòng 48 giờ
2.2.7.2. Phương pháp pha kháng nguyên gây miễn dịch
- Lắc đều ống kháng nguyên cần pha loãng để gây miễn dịch
- Lắc nhẹ ống so độ đục chuẩn dành để xác định đậm độ của trực khuẩn lỵ.
- Dùng pippet hút 0,1ml kháng nguyên cho vào ống thủy tinh chuẩn, thêm từ từ nƣớc muối sinh lý vào đồng thời lắc nhẹ cho đến khi độ đục của ống kiểm tra có cùng độ đục với ống chuẩn thì dừng lại. Tính đậm độ (tbvk/ml) của ống kháng nguyên và tiến hành pha loãng theo yêu cầu.
- Pha loãng kháng nguyên gây miễn dịch có đậm độ: 3.109 tbvk/ml, 4.109 tbvk/ml và 5.109 tbvk/ml. Bảo quản kháng nguyên gây miễn dịch ở 2 – 8o
C.
2.2.7.2. Phương pháp gây miễn dịch trên thỏ
- Phát đồ gây miễn dịch: gây miễn dịch thỏ theo phát đồ 5 mũi với liều lƣợng tăng dần từ 0,5ml – 1,0ml – 1,5ml – 2,0ml – 3,0ml, mỗi mũi cách nhau 5 ngày. Sau mũi cuối cùng 7 ngày lấy hết máu.
- Chọn thỏ khỏe mạnh, trƣớc khi gây miễn dịch lấy máu kiểm tra kháng thể nền kháng kháng nguyên chuẩn bị gây miễn dịch.
- Gây miễn dịch bằng đƣờng tiêm vào tĩnh mạch tai thỏ.
+ Đặt thỏ vào hộp gỗ chỉ ló phần đầu ra ngoài, tránh thỏ cử động làm sai lệch trong quá trình tiêm.
+ Ngƣời thứ nhất một tay giữ ở gốc tai, búng mạnh vào tĩnh mạch bên vành tai đễ tĩnh mạch to lên. Sau đó bóp chặt tĩnh mạch tai thỏ để tĩnh mạch nổi lên rõ ràng.
+ Ngƣời thứ hai dùng cồn - iốt sát trùng mặt ngoài tai thỏ, sau đó đƣa kim có chứa kháng nguyên chính xác vào tĩnh mạch, hút nhẹ cho máu vào kim tiêm, ngƣời thứ nhất thả tay ra và ngƣời thứ 2 từ từ bơm kháng nguyên vào.
+ Khi hết thúc rút kim tiêm ra khỏi tĩnh mạch và đặt bông sát có cồn lên vết tiêm giữ chặt trong khoảng 5 giây cho máu và kháng nguyên không bị chảy ngƣợc ra.
- Trong suốt quá trình gây miễn dịch thỏ đƣợc nuôi dƣỡng và chăm sóc tốt.
Hình 2.3. Tiêm tĩnh mạch thỏ gây miễn dịch
2.2.7.3. Phương pháp lấy máu và thu huyết thanh.
- Chuẩn bị hộp Roux có gắn kim, kéo inox, kẹp, dao và dây buột vô trùng. - Lấy máu thỏ
+ Cột chặt bốn chân thỏ vào bốn góc bàn lấy máu.
+ Ngƣời thứ nhất giữ chặt tai và đầu thỏ, giữ chặt không cho thỏ có thể vùng vẫy nhƣng cũng không làm cho thỏ bị chết ngạt trong suốt quá trình lấy máu.
+ Ngƣời thứ 2 sát trùng vùng cổ thỏ bằng cồn 70%, dùng kéo đã sát trùng cắt lớp da bên ngoài theo chiều dọc của cổ (dài khoảng 5cm), bóc lớp lông và da ngoài để tìm động mạch cảnh. Luồn ngón trỏ vào để kéo động mạch lộ ra bên ngoài.
+ Ngƣời thứ 3 lấy hai sợi dây tẩm cồn - Iốt, một sợi buộc chặt động mạch cảnh không cho máu lƣu thông lên phần đầu thỏ, sợi còn lại kéo căng để máu động mạch căng lên và máu từ tim không tống vào động mạch.
+ Ngƣời thứ 2 dùng ngón tay trỏ nâng động mạch cảnh lên, còn tay kia nhanh chóng đƣa chính xác kim đã gắn với dây silicon đƣợc nối với hộp Roux vào động mạch cảnh, ngƣời thứ 3 thả dây giữ động mạch ở trên để máu chảy vào hộp theo áp lực. Cột ống dẫn máu trƣớc rút kim ra khỏi động mạch để tránh gây nhiễm máu.
+ Đặt hộp Roux nằm ngang trên bề mặt phẵng để tạo diện tích bề mặt lớn và không lắc mạnh để tránh vỡ hồng cầu. Trên mỗi hộp Roux ghi rõ ký hiệu của từng thỏ.
+ Để máu đông và bảo quản ở 4oC trong 48 giờ. - Thu huyết thanh:
+ Đƣa hộp máu vào buồng vô trùng và dung pippet hút huyết thanh cho vào ống ly tâm. Ly tâm 5000 vòng/phút.
+ Hút huyết thanh đã ly tâm cho vào ống nghiệm 22mm, lấy máu kiểm tra vô trùng. Thêm 0,02% merthiolate vào để ngăn ngừa sự nhiễm nấm và vi sinh vật khác.
+ Bảo quản huyết thanh thu đƣợc ở 2 – 8o
C.
2.2.7.4. Phương pháp hấp phụ kháng thể không đặc hiệu
Sau khi kiểm tra tính đặc hiệu của kháng huyết thanh miễn dịch thu đƣợc bằng phản ứng ngƣng kết trên lam kính. Dựa vào kết quả thu đƣợc để tiến hành hấp phụ.
Để loại trừ kháng thể không đặc hiệu trong huyết thanh ta sử dụng một lƣợng kháng nguyên của những chủng không cùng nhóm huyết thanh cho vào huyết thanh thô với một lƣợng vừa đủ và lắc đều để đảm bảo cho sự tiếp xúc giữa kháng thể và kháng nguyên. Ủ ở 37o
C trong vòng 60 phút, 15 phút lắc nhẹ một lần.
Đặt hỗn hợp kháng nguyên và kháng thể ủ qua đêm rồi đem ly tâm 5000 vòng/ phút trong 30 phút, tách bỏ kết tủa và thu huyết thanh.
Kiểm tra vô trùng và tính đặc hiệu của kháng huyết thanh sau hấp phụ. Nếu không đạt thì tiến hành hấp phụ tiếp để thu kháng huyết thanh đặc hiệu.