NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT ALGINATE TỪ RONG NÂU ĐẠT TIÊU CHUẨN ỨNG DỤNG TRONG Y HỌC

Alginate là một copolyme loại block có cấu tạo từ các gốc β- D- manuronat và α- L- guluronat bằng liên kết 1,4 glucosid. Phân tử alginate được tạo thành bởi liên kết của 3 loại khác nhau là polyguluronat, polymanuronat và xen kẽ có độ dài, ngắn, trình tự sắp xếp khác nhau.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT

LÊ NHÃ UYÊN

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT ALGINATE TỪ RONG NÂU ĐẠT TIÊU CHUẨN ỨNG DỤNG TRONG Y HỌC

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Người hướng dẫn: PGS.TS LÊ VĂN HIỆP

ĐÀ LẠT -2008

Lời cảm ơn

Với lòng kính trọng và biết ơn chân thành, tôi xin gửi lời cảm ơn đến

PGS.TS Lê Văn Hiệp

Là người hướng dẫn khoa học đã định hướng nghiên cứu, là người Thầy đã hết lòng động viên, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học Cao học và hoàn thành luận văn này

Xin chân thành cảm ơn Quý Thầy Cô Trường Đại học Đà Lạt, đã tận tình dạy dỗ, truyền đạt kiến thức quý báu, hỗ trợ tôi từ khi tôi bắt đầu theo học cho tới hôm nay

Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến

TS Vũ Ngọc Bội, TS Lê Văn Bé- người thầy đã tạo mọi điều kiện thuận lợi , giúp đỡ và động viên tôi trong thòi gian thực hiện đề tài

Và các bạn bè đồng nghiệp của tôi trong Bộ môn Công nghệ Sinh học- Trường Đại học Nha Trang- những người đã hỗ trợ, sát cánh và động viên tôi trong suốt quá trình học, giúp đỡ tôi tận tình để có thể hoàn thành những thí nghiệm của luận văn này

Xin chân thành cảm ơn các bạn đồng nghiệp của Viện Công nghệ Sinh học

và Khoa Chế biến đã hỗ trợ nhiệt tình, cho nhiều ý kiến bổ ích và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này

Và tận đáy lòng, tôi muốn bày tỏ lòng tri ân sâu sắc đến gia đình, những người thân yêu đã luôn ủng hộ, luôn là điểm tựa để tôi thấy phải tự hoàn thiện mình

CÁC TỪ VIẾT TẮT

1 TPC: Total Plate count ( Tổng số vi khuẩn hiếu khí)

2 HL: Hàm lượng

3 TL: Trọng lượng

4 VIBRIO SPP:Vibrio spcice population

5 CFU/G: colony forming unit (đơn vị hình thành khuẩn lạc)

6 CSP: Centipoise( đơn vị đo độ nhớt)

12 SCFA: single chain fatty acid ( chuỗi đơn acid béo)

13.LV = low viscosity: alginate có độ nhớt thấp

14.HV = high viscosity Alginate có độ nhớt cao

15 ASTM : American standard test methods ( phương pháp kiểm tra theo tiêu chuẩn của Mỹ)

MỤC LỤC

Trang

1 Thành phần hóa học của rong 4

3 Công dụng trong y học của alginate 20

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

1.2 Nguồn rong sử dụng tách chiết acid alginic 30

2 Phương pháp nghiên cứu 31

2.1 Phương pháp thu hoạch và bảo quản nguyên liệu 31

2.2 Nghiên cứu tách chiết alginate 31

3 Loc- Tinh chế- Tách chiết aginate 31

8 Kiểm nghiệm các chỉ tiêu về hóa, lý, vi sinh… 36

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 37

MỞ ĐẦU

Alginate là một copolyme loại block có cấu tạo từ các gốc β- D- manuronat

và α- L- guluronat bằng liên kết 1,4 glucosid Phân tử alginate được tạo thành bởi liên kết của 3 loại khác nhau là polyguluronat, polymanuronat và xen kẽ có độ dài, ngắn, trình tự sắp xếp khác nhau Chính điều đó tạo nên tính chất đặc thù của alginate và làm cho nó được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực khác nhau từ thực phẩm, mỹ phẩm, in vải, giấy… cho đến dược phẩm và các nghiên cứu nuôi cấy

mô động vật có vú Ngày càng có nhiều phát hiện mới về khả năng ứng dụng của alginate và khó hình dung được hết các ứng dụng của nó

Alginate chủ yếu được tách chiết từ rong nâu ( Phaeophyta) một ngành có

phân bố rộng trên thế giới và cũng là ngành rong được tiêu thụ nhiều nhất với 2,5 triệu tấn trong năm 1988, chiếm 66,5% tổng sản lượng rong biển các loại Sản lượng alginate trên toàn thế giới là khoảng 29000 tấn/ năm, tương ứng với khoảng 170000[26] tấn rong khô Các loài rong được sư dụng phổ biến để sản xuất

alginate thuộc các chi: Laminaria, Ascophyllum, Macrocystis… riêng chi rong nâu

Sargassum thuộc họ Sargassaceae, bộ Fucales được phân bố dọc bờ biển nước ta,

chủ yếu ở các tỉnh miền Trung Từ rất lâu, người ta đã biết sử dụng loại rong này làm phân bón, thuốc ngâm để uống, hay làm thức ăn gia súc Từ thập niên 60, các nhà khoa học Việt Nam đã cố gắng tách chiết alginate và nghiên cứu một số ứng dụng của nó như hồ vải, in hoa, dùng trong y học…[6],[2],[1],[3].Các công trình này dựng nên tạo nền tảng ban đầu quan trọng cho việc nghiên cứu alginate từ rong nâu Việt Nam

Hiện nay, nước ta vẫn chưa có nghiên cứu hay công bố nào về alginate được tách chiết từ rong nâu đạt tiêu chuẩn để ứng dụng trong y học, hay trong các sản phẩm là thực phẩm chức năng trong khi tiềm năng về rong nâu ở nước ta không nghèo nàn Ở nhiều nước trên thế giới người ta đã chế tạo thành công nhiều loại sản phẩm từ alginate tách chiết từ rong nâu để ứng dụng rộng rãi trong nhiều

ngành nghề và lĩnh vực khác nhau, trong đó có nhiều ứng dụng ,trong y học như dùng làm chất điều trị phóng xạ, làm tăng hiệu quả chữa bệnh của penicillin vì khi

có mặt alginate natri sẽ làm cho penicillin tồn tại lâu hơn trong máu, hay trong công nghệ bào chế thuốc alginate natri được sử dụng làm chất ổn định, nhũ tương hóa hay chất tạo đặc cho dung dịch, làm vỏ bọc thuốc, làm chất phụ gia chế biến các loại thức ăn kiêng Trong đó, các nước đứng đầu về các lĩnh vực này là Ấn Độ, Trung Quốc, Nhật Bản…đã sử dụng làm thực phẩm chức năng hỗ trợ trong việc điều trị bệnh rất hiệu quả

Ở các nước chậm phát triển như Việt Nam hiện nay, người ta mới dần làm quen với thực phẩm chức năng, và đã có nhiều nơi sản xuất thành công các loại thực phẩm chức năng này như chế phẩm với tên gọi “ Chitosan” và “ Glucosamine”

là những loại thực phẩm chức năng quen thuộc được Viện Vacxin Nha Trang sản xuất

và hiện nay được dùng rất phổ biến để hỗ trợ điều trị các loại bệnh như thấp khớp, giảm béo phì…

“ Fucoidan” cũng là một loại thực phẩm chức năng được sản xuất từ rong nâu của Viện Khoa học và Vật liệu Khánh Hòa có thể hỗ trợ điều trị và ngăn ngừa hiệu quả một số bệnh trong đó có tiểu đường, một căn bệnh mà hiện nay đang còn là một vấn đề nan giải

Những vấn đề về “ Thực phẩm chức năng” có nguồn gốc từ rong mà cụ thể là rong Nâu nêu trên

đã đưa ra một hướng đi mới, điều tiên quyết là làm sao có được sản phẩm đạt các tiêu chuẩn để có thể ứng dụng trong y học và cũng là yêu cầu quan trọng đề tài này cần nghiên cứu

Với ý nghĩa nêu trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu tách chiết alginate

từ rong nâu đạt tiêu chuẩn ứng dụng trong y học”

Mục tiêu của đề tài này là:

1.Tách chiết alginate natri từ rong nâu đạt tiêu chuẩn ứng dụng trong y học

2.Xác định một số yếu tố quan trọng và đề xuất quy trình tách chiết alginate

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Trong thành phần của rong nâu có chứa các yếu tố cần thiết cho cơ thể sống như: Nước, protein, glucid, lipid, Vitamin, khoáng tổng số, độ nhớt, và khả năng kháng khuẩn…[3],[4],[6],[8],[9]

Các nghiên cứu gần đây cho thấy rằng alginate có khả năng tăng cường sửa

chữa các tổn thương màng nhầy trong hệ tiêu hóa in vivo và in vitro Chuột đực

Sprague Dawley cho ăn liều 8 mg alginate giàu M trước khi tổn thương ruột khi tiêm indomethacin (20 mg/ kg) và không điều trị cho tổn thương khoảng ½ mức

độ vĩ mô (Del Buono et al., 2001).)Tổn thương này giảm bằng với các chuột được điều trị bằng 50 μ g/kg một tác nhân bảo vệ tế bào (cytoprotective agent) và nhân

tố tăng sinh biểu bì (epidermal growth factor - EGF) Alginate giàu G không làm giảm tổn thương ở ruột Alginate giàu M cũng gây nên sự tăng sinh tế bào (tương

tự như EGF) ở các dòng tế bào ruột và thực quản trong khi alginate giàu G không

có khả năng này (Dunne et al., 2002) Loại alginate được biến đổi thành dạng blocks (> 95%) không có khả năng tăng sinh tế bào Do vậy, giả thuyết cho rằng loại alginate có khối M và G-block mới có khả năng chữa lành vết thương

M-Các loại băng gạc cầm máu có chứa alginate thường dung cho các tổn thương ở da Tác dụng của chúng là cầm máu giúp lành vết thương ở vùng màng nhầy của miệng và ruột Sự bám dính của các ion Ca trong alginate với Na trong huyết tương sẽ kích thích hoạt động của các tiểu cầu và đông máu tại vùng bị tổn thương, do đó giúp cho việc cầm máu (Matthew et al., 1994) Ảnh hưởng này cũng giảm sự hình thành mô hạt trong quá trình làm lành vết thương (Ingram et al.,

1998)

Các nghiên cứu về sự lành vết thương ở màng nhầy miệng trên chó, các băng gạt có chứa alginate làm tăng đáng kể việc cầm máu đối với các vết thương sâu 2mm (Matthew et al., 1994)

Những ảnh hưởng của alginate lên việc làm lành vết thương ở đường ruột đến nay vẫn chưa rõ ràng nhưng công trình của Del Buono và cs, 2001 cho thấy rằng alginate có tác động tốt đến dạ dày [32]

1 Thành phần hóa học của rong

Căn cứ vào thành phần sắc tố, các đặc điểm hình thái, cấu tạo và sinh sản rong được chia thành làm 9 ngành như sau:

1 Ngành rong lục ( Chlorophyta)

2 Ngành rong trần ( Euglenophyta)

3 Ngành rong giáp ( Pyrophyta)

4 Ngành rong khuê ( Bacilariophyta)

5 Ngành rong kim ( Chrysophyta)

6 Ngành rong vàng ( Xanthophyta)

7 Ngành rong nâu ( Phaeophyta)

8 Ngành rong đỏ (Rhodophyta)

9 Ngành rong lam ( Cyanophyta)

Ở các biển, nước lợ, nước ngọt, đều có đại diện của các ngành rong trên Trong 9 ngành rong trên, 3 ngành có giá trị kinh tế là rong lục, rong nâu và rong

đỏ Rong nâu và rong đỏ là 2 đối tượng quan trọng được khai thác với sản lượng lớn và được ứng dụng nhiều nhất

Vào nửa thế kỷ 19, người ta đã xác định giá trị dinh dưỡng của thực phẩm

là do hàm lượng các chất protein, lipid, glucid, khoáng và vitamin có trong thực phẩm quyết định Đối với rong biển, một nguồn thực phẩm của nhân loại trong tương lai cũng được các nhà khoa học nghiên cứu và đề cập đến

Rong được thu hái vào khoảng tháng 4-5, khi rong đã hình thành cơ quan sinh sản Đây cũng là lúc mà alginate trong rong đạt hàm lượng cao, với chất

lượng tốt nhất Nếu thu hoạch quá sớm, rong chưa phóng thích các bào tử, nguồn lợi sẽ bị ảnh hưởng Mặc khác rong non cho alginate có độ nhớt thấp và kích thước rong còn nhỏ, chưa đạt độ tăng trưởng lớn nhất Ngược lại, việc thu hoạch quá trễ lúc đó rong bắt đầu tàn lụi, alginate cũng không cho độ nhớt lớn

Rong sau khi thu hoạch cần rửa sạch nhanh bằng nước ngọt Khi rong đang phóng thích các giao tử, khi ta rửa nước ngọt sẽ thấy phần trên của rong, nơi chứa nhiều đế tiết nhiều chất nhầy, rong sau đó được phơi khô Nếu rong được phơi sớm, lá của nó sẽ giữ được màu xanh của diệp lục Nếu rong bị ẩm ướt, lâu khô, màu nâu tối sẽ lấn át

1.1 Nước

Chiếm tỉ lệ lớn trong cây rong, khoảng 65-90%, có trường hợp lớn hơn khoảng 75-85% Nhìn chung xu hướng biến động hàm lượng nước trong rong là giảm dần theo thời gian sinh trưởng vì với cơ thể còn non sức sống càng mạnh thì quá trình trao đổi chất xảy ra liên tục, hàm lượng nước tích lũy phải nhiều và tất nhiên cơ thể già thì hàm lượng đó giảm đi

1.2 Protein

Là thành phần không thể thiếu được của các cơ thể sống, nhưng lại có tính đặc thù cao cho từng loài, từng cá thể của cùng một loài, từng cơ quan, mô của từng loại cá thể Protein trong rong có một số đặc tính cơ bản sau:

- Hàm lượng protein biến động theo loài, thậm chí trong cùng một giống cũng có sự biến động Hàm lượng protein trong rong đỏ thường là 7,62-35,6% trọng lượng khô của rong, hàm lượng protein trong rong nâu là 5-20,5% trọng lượng khô của rong

- Hàm lượng rong biến động theo thời gian sinh trưởng: khi rong biển phát triển quá trình tích lũy các chất chưa nhiều hàm lượng protein còn thấp, sau đó tăng lên theo sự tăng thể tích và chiều dài của rong Trong thời kỳ phát triển mạnh

nhất protein được tổng hợp với lượng khá cao, sau đó giảm dần và đến khi tế bào

tàn lụi thì còn lại không đáng kể

- Hàm lượng protein biến đổi theo môi trường sống: điều kiện sống là yếu

tố quan trọng tác động đến quá trình tích lũy các chất trong rong Trong cùng một

ngành rong nếu điều kiện sống khác nhau thì hàm lượng protein trong cùng giai

đoạn sinh trưởng cũng khác nhau Môi trường giàu đạm tạo điều kiện cho rong có

khả năng hấp thu lớn và hàm lượng protein sẽ cao

1.3 Glucid

Là thành phần hóa học quan trọng bậc nhất mà các nhà khoa học rong biển

quan tâm xem xét Tỉ lệ thành phần glucid trong các ngành rong rất khác nhau

mang những đặc trưng rất riêng biệt Trong rong nâu, hàm lượng glucid đạt đến

73- 74% trọng lượng khô của rong Polysaccharit trong rong nâu có giá trị rất lớn đặc biệt là

alginic, hàm lượng glucid trong rong nâu cũng biến đổi theo thời gian sinh trưởng, trạng thái sinh lý và

môi trường sống của chúng Dưới đây là các bảng số liệu về hàm lượng acid alginic thu nhận được từ

các tài liệu trong nước có trong rong nâu tại vùng biển Nha Trang Khánh hòa

Bảng 1.2: Hàm lượng acid alginic của một số loài rong nâu ( Sargassum: S) ở Nha Trang ( mẫu thu

trước năm 1979) ( Theo Nguyễn Kim Đức, Viện Nghiên Cứu Biển Nha Trang)[9]

Loài rong Thời gian

thu mẫu ( tháng/năm)

Địa điểm thu mẫu

Hàm lượng dao động (%)

Hàm lượng trung bình (%)

S feidmanii 3-5/79 Sơn hải 36,41- 41,93 39,17

Bảng 2.2: Hàm lượng acid alginic so với hàm lượng rong khô tuyệt đối

( Theo số liệu điều tra của đề tài cấp bộ 1998 của các nhà khoa học Trường

Đại học Thủy Sản, trong quyển “ Chế Biến rong biển” do nhóm tác giả Trần Thị

Luyến, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn, Ngô Đăng Nghĩa viết, được Nhà Xuất

bản Nông nghiệp TpHCM năm 2004) [9]

Hàm lượng acid alginic(%) STT Loài rong Địa điểm

Hàm lượng lipid trong rong nâu không lớn lắm khoảng 1-3%, đặc điểm của

lipid trong rong phần lớn là những lipid chưa no, vô hại, có sterol mà các ngành

thực vật khác không thấy

1.7 Sắc tố

Sắc tố trong rong nâu là diệp lục tố, diệp hoàng tố, sắc tố nâu, sắc tố đỏ, tùy theo tỉ lệ các loại sắc tố này mà rong thường có màu từ nâu- vàng nâu- nâu đậm- vàng lục Nhìn chung sắc tố trong rong nâu khá bền

1.8 Một vài hình ảnh minh họa về rong nâu

Hình 1.1: Hình dạng của rong nâu lúc còn tươi

Hình 1.2:Thu hoạch rong nâu

2 Cấu trúc và tính chất hóa học của alginate

2.1Cấu trúc của alginate

Alginate là tên gọi chung của các muối của acid alginic, đó là một polymer

mạch thẳng được tạo thành từ hai gốc monomer là acid β- D- mannuronic và acid

α- L-gulunoric Cấu tạo của hai monome theo công thức cổ điển Haworth được chỉ

ra theo hình , theo công thức này, hai monome chỉ khác nhau ở chỗ nhóm carboxyl

nằm trên và dưới mặt phẳng của vòng pyranose Theo quan niệm hiện đại, hai gốc

unoric đó có cấu tạo dạng ghế nhưng cấu hình khác nhau, acid mannuronic có cấu

hình 4C1, còn acid guluronic có cấu hình 1C4 Như vậy trong cả hai nhóm cấu hình,

nhóm carboxyl đều gắn vào vòng pyranose ở vị trí xích đạo[26]

Hình 1.3: Cấu hình cổ điển của hai đơn vị phân tử acid alginic

Hình 1.4: là hình ảnh của hình 1 được diễn đạt dưới dạng ghế

Hình 1.5: hình ảnh của C1 và 1C của vòng tetrahydropyran

Cấu trúc phân tử

Hình 1.6

hình 1.7:chuỗi Calcium poly-α-L-guluronate nhìn theo chiều xoắn

ốc bàn tay trái

Hình 1.8: Hình ảnh trục dài biểu diễn liên kết giữa hydrogen và vị trí liên kết calcium

Hai monone này gắn với nhau bằng các liên kết 1-4 glucosid Nhưng sự kết hợp này không phải ngẫu nhiên mà thành 3 loại block như sau: (hình 4)

- Block homopolyguluronic: gồm các gốc acid guluronic nối tiếp nhau, GGGGG

- Block homopolymanuronic: gồm các gốc mannuronic, MMMM

- Block luân hợp: hai gốc luân phiên nối với nhau MGMGMG Như vậy, alginate được xem nhu là một copolymer block Độ dài trung bình của mạch phân tử , độ dài của mỗi block, tỷ lệ và trình tự kết hợp của chúng với nhau theo nguồn gốc của alginate Điều này làm cho alginate có tính chất biến đổi trong một dải rộng Nếu chiết cẩn thận có thể thu được alginate có độ polymer hóa đến 10.000 đơn vị

2.2 Một số tính chất quan trọng của alginate

a Khối lượng phân tử và tính nhớt của dung dịch alginate

Hầu hết các loại alginate thương mại có khối lượng phân tử trung bình trên

150.000 tương ứng với độ polymer hóa dP khoảng 750 alginate , giống như các

polysaccharide khác là một polyme đa phân tán theo khối lượng phân tử của nó

Về mặt này, nó giống một polyme tổng hợp hơn là một polyme sinh học như protein hay acid nucleic Do tính chất đa phân tán, khối lượng phân tử của alginate được tính bằng giá trị trung bình của phân bố khối lượng phân tử

Nếu gọi Ni là số phân tử, wi là khối lượng của các phân tử có cùng khối lượng phân tử Mi, thì giá trị trung bình sô và giá trị trung bình khối của khối lượng phân tử alginate được tính như sau:

Mn =

∑

∑

Ni NiMi

Tỷ số Mw / Mn được gọi là chỉ số đa phân tán PI Đối với alginate, chỉ số

PI nằm trong khoảng từ 1,4 đến 6 tùy theo loài rong và phương pháp tách chiết Sự phân bố khối lượng phân tử cũng như cấu trúc phân tử có liên quan đến tính chất

và ứng dụng của alginate Các đoạn mạch ngắn giàu M sẽ không tham gia quá trình tạo gel và do đó dễ thất thoát ra khỏi hạt gel và do đó dễ thất thoát ra khỏi hạt gel Chính vì vậy, sự phân bố khối lượng phân tử trong một dải hẹp sẽ thuận tiện hơn trong cố định tế bào.[7],[9],[14],[15],[17],[20]

Acid alginic không tan trong nước nhưng có khả năng hấp thụ một lượng nước rất lớn, trương nở và tạo thành dạng bột nhão Ngược lại, alginate natri và các muối K+, NH4+, (CH2OH)3NH+, cuả alginate tan trong nước và tao thành dung dịch có độ nhớt cao Alginate có khối lượng phân tử trung bình càng lớn thì độ nhớt dung dịch càng cao Trong sản xuất người ta có thể khống chế điều kiện rút chiết để sản xuất ra alginate có độ nhớt theo yêu cầu và nó có thể biến thiên trong

một dải rộng từ 10- 1000mPas ( dung dịch 1%) tương ứng với dP từ 100-1000 đơn

vị Alginate natri với độ nhớt từ 200-400mPas là loại được sử dụng rộng rãi nhất Nồng độ alginate càng lớn thì độ nhớt của nó càng cao.[2]

Bảng 4: Cho thấy sự biến thiên độ nhớt của các loại alginate khác nhau theo nồng độ

Nồng độ alginate Nồng độ alginate Loại alginate

Độ nhớt dung dịch alginate còn phụ thuộc vào nhiệt độ Khi nhiệt độ tăng,

độ nhớt giảm khoảng 2,5% cho 1oC Khi làm nguội, độ nhớt quay về giá trị thấp hơn ban đầu một tí Tuy nhiên nếu duy trì nhiệt độ 50oC trong nhieuf giò thì sẽ làm alginate cắt mạch và độ nhớt giảm Trái lại khi hạ độ nhớt đến điểm đông đặc

và sau đó rã băng sẽ không làm độ nhớt giảm.[24],[25],[26]

Độ nhớt của dung dịch alginate không bị giảm trong khoảng pH từ 5-11, ở

pH dưới 5, các ion -COO- bắt đầu bị proton hóa thành –COOH, do đó lực đẩy tĩnh điện giữa các chuỗi bị giảm, chúng trở nên gần nhau hơn và tạo liên kết hydro, làm tăng độ nhớt Khi pH bị giảm sâu sa hơn, khoảng từ 3-4 sẽ tạo thành gel Nếu alginate có chứa một ít ion Ca2+, sự tạo gel còn sớm hơn nữa, khoảng pH = 5 Nếu

pH giảm nhanh từ 6 xuống 2, sẽ tạo thành kết tủa của acid alginic Khi pH trên 11, alginate sẽ bị depolyme hóa từ từ và giảm độ nhớt Liên kết glycoside rất nhạy cảm với cả acid và kiềm, do đó dưới các điều kiện thuận tiện cho việc thủy phân,

alginate sẽ bị cắt mạch rất nhanh chóng Ngoài ra, tác dụng oxy hóa bởi các gốc tự

do cũng làm cho dung dịch alginate giảm độ nhớt

Một vấn đề cần lưu ý là bột alginate natri khô, ở nhiệt độ thường sẽ bị cắt mạch và giảm khối lượng phân tử chỉ trong vài tháng Nếu hạ nhiệt độ và bảo quản nơi tối, sẽ duy trì được lâu hơn Nếu đông sâu có thể bảo quản được vài năm mà không giảm đáng kể khối lượng phân tử Nếu hạ nhiệt độ và bảo quản nơi tối sẽ duy trì được lâu hơn Ngược lại, acid alginic khô rất kem ổn định ở nhiệt độ thường do nó bị thủy phân dưới tác động của sự thủy phân nội phân tử do acid xúc tác.[27]

Alginate là một sản phẩm tự nhiên nên nó có thể bị tiêu hóa bởi một số loại

vi sinh vật Enzyme thủy phân ngoại bào được phân lập từ đất, biển, các loài nhuyễn thể có thể cắt mạch liên kết glycoside do phản ứng β- elimination

Dung dịch alginate là dung dịch phi Newton, độ nhớt của nó biến thiên theo tốc độ trượt Tốc độ trượt càng cao thì độ nhớt của nó càng giảm Do đó khi đo độ nhớt của alginate bằng nhớt kế rotor, cần phải ghi chú tốc độ quay của rotor Thường người ta đo độ nhớt alginate 1% ở 20oC hay 25oC với tốc độ quay của rotor là 60rpm.[14]

b Tính chất tạo gel của alginate

Một tính chất quan trọng nữa của alginate là khả năng tạo gel dưới những điều kiện nhất định Khi phản ứng với những ion hóa trị 2 và 3 dung dịch alginate

sẽ tạo gel Các gel này được tạo ở nhiệt độ phòng hay bất cứ nhiệt độ nào cho đến

100oC và chúng không tan chảy khi nung nóng Gel của alginate có ứng dụng nhiều ngành công nghiệp khác nhau, cả trong thực phẩm và lĩnh vực y học

2.3 Các phương pháp tách chiết Alginate

Alginate được Standford tách chiết ra lần đầu tiên trên thế giới vào năm

1881 từ rong nâu Laminaria stenophyllum Năm 1927 Thornley thành lập một công ty để sản xuất cho Alginate cho ngành đồ hộp tại San Diego Hoa Kỳ Vào

năm 1929, công ty được tổ chức lại thành Kelco Company Ở Anh sản xuất Alginate lần đầu bởi công ty Alginate Industries Ltd vào năm 1934 Đến năm

1979, công ty Alginate Industries Ltd sáp nhập vào chi nhánh Kelco Division của công ty Merck ở Hoa Kỳ và trở thành công ty hàng đầu, chiếm 70% sản lượng Alginate trên thế giới Năm 1995, công ty Merck bán toàn bộ công ty Kelco cho Monsanto, công ty lớn tiếp theo là Protan A/S của Nauy, rồi đến Pháp, Nhật Bản

và Trung Quốc Tổng cộng có 17 nhà máy của 9 quốc gia trên thế giới sản xuất alginate.[9],[14],[31]

Mặc dù việc sản xuất alginate tại các nhà máy là khác nhau và công nghệ được giữ bí mật, nhưng tựu chung có hai quy trình chính để sản xuất Alginate là quy trình acid hóa và canxi hóa được minh họa theo sơ đồ dưới đây, tùy điều kiện sản xuất cụ thể mà từng nhà máy chọn quy trình phù hợp cho mình

Rong nâu

Xử lý sơ bộ

Rửa

Nấu chiết trong kiềm

Dịch chiết alginate Natri

Pha loãng

Lọc thô

Sục bọt

Lọc tinh

A Quy trình canxi hóa B Quy trình acid hóa

Gel alginate canxi Gel alginic acid

( Ethanol + NaOH + NaOCl)

1 Nguyên liệu: rong Sargassum sạch, không nước, không thối, không giòn gãy

2 Ngâm rửa: rửa sạch bằng nước ngọt, ngâm trong nước ngọt từ 2h - 2,5h

sau đó lại tiếp tục rửa sạch các chất muối, sắc tố hòa tan…

3 Xử lý hóa chất: xử lý theo chế độ acid, dùng HCl 0,33%, lượng dung

dịch gấp 20 lần so với trọng lượng khô của rong, ngâm trong 6-12h, sau đó vớt ra rửa kỹ đến trung tính để ráo chuẩn bị nấu chiết

4 Nấu chiết, tách lọc:

- Nấu chiết: cho lượng nước gấp 20 lần so với trọng lượng khô của rong Dùng kiềm hóa trị I để nấu chiết alginate, và thường dùng là Na2CO3, phản ứng xảy ra trong quá trình nấu chiết :

2nC5H7O4COOH + nNa2CO3→2nC5H7O4COONa + nH2O + nCO2

Nguyên tắc chung của cả hai quy trình là: alginate trong rong nâu phần lớn dưới dạng muối của ion hóa trị hai không hòa tan như : Ca2+, Mg2+ Cần phải xử lý acid để chuyển alginate sang dạng alginic, sau đó nấu chiết trong dung dịch kiềm

Na2CO3, acid alginic sẽ trao đổi ion và trở thành dạng alginate hòa tan vào trong dung dịch Sau đó lọc sạch cặn bả rong không tan, ta sẽ thu được phần dịch chứa alginate natri, vấn đề còn lại là tách nước ra khỏi dung dịch để thu được bột alginate natri Chính trong quá trình tách nước này mà chúng ta có hai quy trình khác nhau: một quy trình tách alginate ở dạng muối alginate canxi không tan và tách ra khỏi nước, một quy trình tách alginate ở dạng gel acid alginic kết tủa Nhưng sau đó, quy trình canxi hóa vẫn chuyển sang dạng acid alginic Như vậy hai quy trình chỉ khác nhau căn bản có một khâu canxi hóa Sở dĩ người ta dùng thêm khâu canxi hóa là vì alginate canxi dễ ép tách nước hơn acid alginic

Các khâu lọc, tách nước, sấy nghiền chủ yếu phụ thuộc vào các thiết bị và trình độ chế tạo các thiết bị Như đã nói trên, số nước sản xuất alginate không nhiều do đó các máy móc dùng trong ngành công nghiệp này mang tính đặc thù cao, không phổ biến và được giữ bí mật

Các công trình công bố trong lĩnh vực nấu chiết không nhiều, đa số được các công ty nghiên cứu và bảo mật Mặc khác, các thông số nấu chiết phụ thuộc vào loại rong và mục đích sử dụng Người ta điều chỉnh các thông số trong công đoạn nấu chiết để thu được các sản phẩm alginate theo ý muốn

Ba thông số quan trọng ở đây là nồng độ kiềm, nhiệt độ nấu chiết, và thời gian nấu chiết

Việc nghiên cứu tách chiết alginate ở nước ta thực hiện lần đầu tiên vào năm 1961 dùng để hồ sợi Năm 1966, bộ môn Chế Biến Trường Đại học Nha Trang đã tách chiết alginate từ rong mơ vùng biển Hải Phòng và đã ứng dụng vào việc in hoa trên vải Sau nhiều công trình nghiên cứu, vào năm 1978, thạc sỹ Nguyễn Huy Thục đã nghiên cứu xây dựng phương pháp sản xuất alginate natri bán cơ giới năng suất 10 tấn/ năm tại xí ngiệp chế biến Hạ Long, Hải Phòng Đây

là nơi có cơ sở sản xuất alginate natri lớn nhất nước ta Tiếc rằng sau đó với nhiều

lý do, phân xưởng phải ngừng sản xuất Quy trình sản xuất alginate natri đã được đúc kết trong hội nghị alginate natri tại Ủy ban Khoa Học Kỹ thuật Nhà nước vào tháng 11 năm 1981 Trong báo cáo này, quy trình sản xuất với các thông số kỹ thuật cũng như định mức tiêu hao nguyên liệu đã được đúc kết sau đó vào năm

1982, Trần Văn Ân, trong luận án PTS đã đẩy việc nghiên cứu sâu hơn trong việc cải tiến các các quy trình tách chiết alginate.[1] [7][17]

Trong các công trình này, các tác giả chỉ đánh giá riêng lẽ tác dụng của từng nhân tố, mặc khác với các loại rong khác nhau, đòi hỏi chế độ nấu chiết khác nhau

3.Công dụng trong y học của alginate

Alginate là chất xơ thực phẩm dạng nhầy, có khả năng làm giảm tốc độ hấp thu thức ăn qua thành ruột, giảm chỉ số đường huyết và giảm rủi ro về bệnh tim mạch.[33]

1.Tác động làm giảm tốc độ hấp thu qua thành ruột (giảm tốc độ tiêu hóa thức ăn) từ đó giảm béo phì cho người sử dụng

Các nghiên cứu trước đây cho thấy rằng các alginate làm giảm hoạt tính của men tiêu hóa (enzyme tiêu hóa) ở phần trên của ống tiêu hóa (miệng, hầu, thực quản, dạ dày) (Upper GI tract) Các nghiên cứu in vitro về hoạt tính của các protease dưới các điều kiện sinh lý cho thấy rằng nồng độ alginate thấp (<0.1%) làm giảm hoạt tính của pepsin lên đến 80% (Sunderland và cộng sự, 2000), ức chế một phần hoạt tính của tripsin (Hart J.L., Brownlee I.A., Dettmar, P.W and Pearson J.P, nghiên cứu chưa công bố) Với nồng độ cao hơn, alginate có khả năng làm giảm sự phân hủy casein khi ủ với pesin và/ hoặc dịch enzyme của tuyến tụy (Manchon và Desaintblandquat, 1986; El Kossori và cộng sự) So sánh với các chất xơ khác (cùng điều kiện invitro), 33 mg alginate trong dung dịch chứa 330mg casein làm giảm khả năng tiêu hóa casein (51.1±1.3% casein không được phân hủy) tương đương với tác dụng của gum Arabic (loại nhựa cây của Ả rập) (52.5±2.1), carrageenan (57.3±2.6) và pectin (52.3±4.5), locust bean gum (47.2

±2.3) và ruột quả prickly pear (62.0±2.5) (El Kossori và công sự, 2000) Khi tăng nồng độ của alginate (ví dụ 66 mg hoặc 82.5 mg trong dung dịch casein) thì khả năng ức chế phân giải protein cũng không tăng thêm

Tác động ức chế hoạt tính của protease của alginate có lợi trong việc làm giảm chỉ số đường máu tăng lên sau bữa ăn chứa hỗn hợp nhiều chất béo, protein, carbonhydrate

2.Tác động làm giảm lượng cholesterol máu

Một phân tích tổng hợp 67 thử ngiệm đã đưa ra giả thuyết rằng pectin có ảnh hưởng lớn đến việc giảm cholesterol và chúng tác động nhiều lên LDL cholesterol hơn là tác động lên HDL cholesterol (Brown và cộng sự, 1999)

Bổ sung alginate (7.5 g/d, M/G 1.5) vào các sản phẩm thực phẩm ít chất xơ

sẽ làm tăng 140% khả năng bài tiết acid béo ở các bệnh nhân đang thông ruột

(Sandberg và cộng sự, 1994) 4 người trong 6 đối tượng nghiên cứu bài tiết ≤ 50% lượng acid béo, 2 bệnh nhân còn lại đào thải một lượng rất lớn các acid béo

Các nghiên cứu trên động vật cũng cho thấy rằng sự hiện diện của alginate làm giảm hấp thụ các chất béo và giảm lượng cholesterol trong máu (Seal và Mathers, 1996 và 2001) Tác động này có khả năng là do alginate là tăng bài tiết

và đào thải cholesterol

Trong các thí nghiệm cho chuột ăn thức ăn có chứa 1% cholesterol, nếu khẩu phần ăn có bổ sung thêm 1% Na-alginate thì cholesterol giảm 8.5% và nếu

bổ sung 3% Na-alginate thì lượng cholesterol giảm 20.5% so với mẫu đối chứng Tương tự, nếu bổ sung 1% và 3% polysaccharide funoran thì lượng cholesterol giảm lần lượt 7.3% và 20.9% (Ito và Tsuchiya,1972; Jimenez-Escrig và Sanchez-Muniz, 2000) Trong các polysaccharide thì agar cho kết quả hạ cholesterol thấp nhất (3% agar bổ sung vào bữa ăn chỉ làm giảm 1.8% cholesterol máu) Các thí nghiệm cũng cho thấy rằng alginate Mr thấp không có tác động đến việc giảm cholesterol Trên chuột có lượng mỡ và cholesterol cao, Na-alginate có khả năng

hạ cholesterol ngang với các polyssacharide khác (furonan, sulfateed glucoronoxylohamman, porphyrin) và khả năng này cao hơn hẳn agar và fucoidan (Ren và cộng sự, 1994; Jimenez-Escrig và Sanchez-Muniz, 2000)

Tuy nhiên, alginic acid sẽ làm giảm cholesterol máu không ổn định (rõ rệt hoặc không giảm) khi so sánh với Na hoặc Ca –Alginate (Kiriyama và cộng sự, 1969; Nishide và cộng sự, 1993)

Tăng alginate loại G dẫn đến tăng khả năng tạo gel của alginate, làm giảm khả năng hấp thu cảu ruột Tác động của alginate lên sự hấp thu cholesterol vào dòng máu tăng khi tỷ lệ M/G thấp (Suzuki và cộng sự, 1993) Tuy nhiên độ nhớt cao có thể làm giảm sự ngon miệng của người dùng

3.Tác động làm giảm lượng đường huyết (glucose máu)

Sự hiện diện của alginate có khả năng làm giảm tốc độ hấp thụ glucose Khảo sát một nhóm người bệnh tiểu đường type II có sử dụng bổ sung 5g Na-alginate vào các khẩu phần ăn, kết quả lượng đường huyết sau bữa ăn giảm (31%)

và lượng insulin trong máu sau bữa ăn tăng (42%) (Torsdottir và cộng sự, 1991) Với người khỏe mạnh, không mắc bệnh tiểu đường thì liều alginate thấp (1.5g) bổ sung vào khẩu phần ăn cũng cho kết quả tương tự : lượng đường huyết giảm và insulin tăng (Woft và cộng sự) Các nghiên cứu gần đây trên chuột (Kimura và cộng sự, 1996) và heo (Vaugelade và cộng sự, 2000) cho thấy các polyssacride không tinh bột từ các loài tảo cũng cho kết quả tương tự

Khi so sánh với các nguồn chất xơ khác, chó thí nghiệm được thông ruột ăn khẩn phần ăn có bổ sung alginate (3% alginate theo trọng lượng) giảm nồng độ đường huyết tương đương với khẩu phần ăn có 6.8% đậu nành hoặc 3% hỗn hợp

xơ đậu nành và yến mạch tỷ lệ 1:1 (Murray và cộng sự, 1999)

4.Tác động làm giảm độc tố đường ruột

Các phương pháp nghiên cứu cho thấy alginate có khả năng giảm độc tố trong ruột kết Bổ sung 1/175-200 mg alginate so với trọng lượng cơ thể vào khẩu phần ăn của các tình nguyện viên nang đã làm tăng lượng phân nhưng không tăng

số lần đi tiêu (Anderson và cộng sự, 1991) Kết quả tương tự đối với lợb có khẩu phần ăn bổ sung 5% alginate, và đối với lợn, cùng một nồng độ bổ sung vào thức

ăn thì alginate có tác dụng lên ruột kết cao hơn các sợi xơ rong biển khác gồm xylan, cellulose, carrageenan (Hoebler và cộng sự, 2000)

Các nghiên cứu cho thấy rằng alginate có khả năng hút bám nhiều các chất gây đột biến có trong thực phẩm, do vậy, alginate không chỉ giảm độc tố trong ruột kết mà còn đào thải chúng ra khỏi cơ thể (Nishiyama và cộng sự, 1991; Nishiyama và cộng sự, 1992; Maruyama và Yamamoto, 1993; Ikegami và cộng

sự, 1994; Sugiyama và cộng sự, 1999; Aozasa và cộng sự, 2001)

Các thí nghiệm invitro cho phép đo được lượng độc tố, chất gây đột biến, chất gây ung thư bám vào chất xơ trong dung dịch Trong dung dịch đệm pH 7.6, 5mg/mL alginic acid hút các dioxin isomer (độc tố trong thực phẩm và nước) tố hơn các loại xơ khác (glucomanna, gum karaya, lignin, chitin, cellulose, mannan

và xylan), nhưng không tốt bằng pectin khi có cùng một nồng độ (Aozasa và cộng

sự, 2001)

Các thí nghiệm trên động vật cho thấy thức ăn có chứa 5% Na-alginate giảm sự tích lũy pentachlorobenzenes ở chuột kết quả tương đương với λ-carrageenan trong thời gian 7 ngày (Ikegami và cộng sự,1994) Lượng alginate tương tự trong khẩu phần ăn cũng làm giảm D-galactosamine (chất gây ra các tổn thương gan) ở chuột tuy rằng hiệu qủa khiêm tốn hơn so với một số chất khác (glucomannan, chitin, chitosan, hemicellulose, cellulose) (Sugiyama và cộng sự, 1999)

Các nhà khoa học tin rằng một trong các nhân tố quan trọng trong cơ chế gây ra ung thư đại tràng và trực tràng là acid mật (Owen, 1997; Ochsenkuhn và cộng sự, 1999; Debruyne và cộng sự., 2001) Do vậy, tăng sự bài tiết acid mật (ở động vật thí nghiệm) là một trong những nhân tố đầu tiên được xem là bảo vệ nguy cơ ung thư ruột (Kimura và cs, 1996; Seal và MAther, 2001)

Các nghiên cứu cho thấy rằng các acid mật thứ cấp có khả năng phá hủy

ruột kết hơn là acid mật sơ cấp (những axit mật tổng hợp trong gan người được gọi acid mật sơ cấp, và những acid mật được làm bởi vi khuẩn được gọi những

acid mật thứ cấp) Vì vậy, tăng khả năng đào thải acid mật thứ cấp sẽ làm giảm

tổn thương ở ruột

Bảng 2: Khả năng bám của acid mật vào các chất xơ thực phẩm khác nhau

Binding of bile acid (μ mol/g)Chất xơ Cholate Chenodeoxycholate Deoxycholate Reference

(Camire et al., 1993)

5.Thay đổi hệ vi sinh đường ruột

Khoảng 1013 – 1014 vi sinh vật cư trú ở ruột người (Roberton, 1993; Topping và Clifton, 2001) Hệ vi sinh vật đường ruột có thể bị thay đội bởi các chất xơ thực phẩm Sự phân hủy thức ăn trong đường ruột bởi các vi sinh vật kỵ khí sẽ tạo ra các acid béo mạch ngắn Các nghiên cứu gần đây tập trung vào ảnh hưởng của các acid béo mạch ngắn lên ruột kết Các acid béo mạch ngắn (đặc biệt

là butyrate) được xem là các tác nhân bảo vệ và chữa các bệnh về đường ruột kể

cả ung thư ruột

Thực phẩm chức năng và dinh dưỡng

Bột khó tiêu lên men, biến thành acid béo chuỗi ngắn (SCFA), chủ yếu là acetate, propionate và butyrate Việc sản sinh SCFA giúp hạ thấp độ pH trong ruột

và giảm lượng ammoniac độc hại trong ruột và trong máu Các nghiên cứu trên người và trên chuột được cấy hệ vi khuẩn người chứng minh rằng sự lên men của tinh bột khó tiêu sản sinh ra hàm lượng butyrate cao đáng kể so với acetate và propionate

Ruột kết nhận được 60 -70 % năng lượng từ các chế phẩm lên men bởi vi khuẩn như butyrate để sản sinh những tế bào đặc trưng của bộ phận này Nhờ đó, tiến sĩ John Cumming, nhà tiên phong về tinh bột khó tiêu phát hiện: ai ăn nhiều tinh bột khó tiêu dường như được bảo vệ chống lại ung thư ruột kết

Một vài nghiên cứu gần đây tập trung vào ảnh hưởng của alginate lên hệ vi sinh đường ruột và ảnh hưởng của tác động này lên cơ thể vật chủ cũng như nghiên cứu sâu về cấu trúc của alginate ảnh hưởng như thế nào đến khả năng phân hủy của chúng

Ủ alginate với vi sinh vật đường ruột (vi sinh vật trong phân), sau 6h alginate được phân hủy thành các acid béo mạch ngắn và sinh hơi (Michel et al.,

1996) Sau 24h, hơn 80% alginate được phân hủy (Michel et al., 1996)

Bảng 3 : Các acid béo mạch ngắn xuất hiện sau quá trình phân giải alginates bởi các vi sinh vật đường ruột

đổi, các oligo alginate (Mr=1000 – 5000, do xử lý alginate bằng enzyme hoặc acid) sinh nhiều gas và nhiều SCFA hơn khi ủ với vi sinh vật đường ruột (Michel

et al., 1996; Michel et al., 1999) Các kết quả này đưa ra giả thuyết rằng chiều dài của chuỗi alginate đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men chúng Tuy vậy, hiện vẫn chưa có dữ liệu nào so sánh các alginate tự nhiên có Mr khác nhau thì có khả năng lên men khác nhau

Trong các thí nghiêm của Michel et al (1996), mannuronate lên men chậm, giả thuyết đưa ra vi sinh vật đường ruột ít có khả năng chuyển hóa loại đường này Trong các thí nghiệm trên chuột của Suzuki et al (1993a), lên men alginate tăng

khi tỷ lệ M:G giảm Điều này đưa đến giả thuyết rằng: mặc dù ban đầu mannuronic acid không được lên men tốt bởi hệ vi sinh đường ruột, nhưng tiếp tục

bổ sung alginate vào khẩu phần ăn thì giai đoạn sau chúng được lên men

Các nghiên cứu sâu hơn về alginate với các chủng vi sinh vật đường ruột

(gồm 435 thí nghiệm) cho thấy rằng có 3 chủng Bacteroides có khả năng chuyển

hóa alginate.Trong số khoảng 21 chủng vi sinh đường ruột đáng tin cậy, chỉ có

Bacteroides ovatus là có khả năng phát triển trên môi trường nuôi cấy có alginate,

trong khi sự phát triển của Peptostreptococcus productus và Pseudomonas

aeruginosa bị ức chế (Fujii et al., 1992) Điều này cho thấy rằng alginate có khả năng thay đổi hệ si sinh vật đường ruột, tùy thuộc vào thời gian và nồng độ alginate

Một thí nghiệm in vivo nghiên cứu về ảnh hưởng của việc tiêu thụ alginate

(10 g/ngày trong suốt 2 tuần) đối với vi sinh vật đường ruột của người (thông qua

vi sinh vật trong phân) cho thấy mật độ vi khuẩn chỉ thị trong phân tăng, trong khi

một vài vi khuẩn có khả năng gây bệnh (ví dụ: Enterobacteriaceae và

Clostridium) giảm trong suốt quá trình sử dụng alginate Đồng thời, mức độ

sulphide, ammonia, độc tố phenol do vi sinh vật sinh ra trong các mẫu phân giảm

rõ rệt (Terada et al., 1995) Công trình nghiên cứu này, một lần nữa khẳng định

rằng alginate có thể thay đổi hệ vi sinh đường ruột ở người Tuy vậy duy chỉ có thí nghiệm này cho thấy sự thay đổi trên là có lợi cho cơ thể vật chủ

Từ những bằng chứng trên, đã có cơ sở khi cho rằng alginate có ảnh hưởng

có lợi lên hệ vi sinh vật đường ruột và số lượng các acid béo ngắn mạch

6.Chữa lành vết thương

Các nghiên cứu gần đây cho thấy rằng alginate có khả năng tăng cường sữa

chữa các tổn thương màng nhầy trong hệ tiêu hóa in vivo và in vitro Chuột đực

Sprague Dawley cho ăn liều 8 mg alginate giàu M trước khi tổn thương ruột bởi tiêm indomethacin (20 mg/ kg) và giữa không điều trị cho tổn thương khoảng ½ mức độ vĩ mô (Del Buono et al., 2001) Tổn thương này giảm bằng với các chuột được điều trị bằng 50 μ g/kg một tác nhân bảo vệ tế bào (cytoprotective agent) và nhân tố tăng sinh biểu bì (epidermal growth factor - EGF) Alginate giàu G không làm giảm tổn thương ở ruột Alginate giàu M cũng gây nên sự tăng sinh tế bào (tương tự như EGF) ở các dòng tế bào ruột và thực quản trong khi alginate giàu G không có khả năng này (Dunne et al., 2002) Loại alginate được biến đổi thành dạng M-blocks (> 95%) không có khả năng tăng sinh tế bào Do vậy, giả thuyết cho rằng loại alginate có khối M và G-block mới có khả năng chữa lành vết thương

Các loại băng gạc cầm máu có chứa alginate thường dung cho các tổn thương ở da Tác dụng của chúng là cầm máu giúp lành vết thương ở vùng màng nhầy của miệng và ruột Sự bám dính của các ion Ca trong alginate với Na trong huyết tương sẽ kích thích hoạt động của các tiểu cầu và đông máu tại vùng bị tổn thương, do đó giúp cho việc cầm máu (Matthew et al., 1994) Ảnh hưởng này cũng giảm sự hình thành mô hạt trong quá trình làm lành vết thương (Ingram et al.,

1998)

Các nghiên cứu về sự lành vết thương ở màng nhầy miệng trên chó, các băng gạt có chứa alginate làm tăng đáng kể việc cầm máu đối với các vết thương sâu 2mm (Matthew et al., 1994)

Những ảnh hưởng của alginate lên việc làm lành vết thương ở đường ruột đến nay vẫn chưa rõ ràng nhưng công trình của Del Buono và cs, 2001 cho thấy rằng alginate có tác động tốt đến dạ dày

7.Kích thích hệ miễn dịch

Alginates có khả năng kích thích các dòng tế bào bạch cầu đơn nhân sản

suất interleukin and TNF- in vitro (Otterlei et al., 1991) Alginate làm tăng sự hiện diện của các thụ thể CD14 gắn màng trên các đại thực bào và khả năng phát hiện lipopolysaccharides của vi khuẩn (Espevik et al., 1993) Tiêm alginate vào cơ bụng làm tăng đáp ứng miễn dịch ở cá (Peddie et al., 2002) và chuột (Son et al.,

2001) Khả năng kích thích miễn dịch tăng khi mannuronate trong alginate tăng (Otterlei et al., 1993) Các β –glucan cũng có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch (Roubroeks et al., 2000; Son et al., 2001)

Theo giả thuyết, khả năng kích thích hệ miễn dịch có thể gây hại khi ở nồng

độ alginate tiêu thụ cao Không nên sử dụng alginate với mức độ cao trong thực phẩm và giải khát

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

1 Đối tượng nghiên cứu

1.1 Các loài rong nghiên cứu

Alginate được tách chiết từ các loài rong nâu phân bố dọc theo ven biển miền Trung Việt Nam, từ Đà nẵng, Quy Nhơn, đến Khánh Hòa, Phan Rang Trong

đề tài này chọn 4 loại rong để nghiên cứu là Sargassum polycystum, S.mucclurei,

S swartzii, S.olygocystum

Qua sơ lược nghiên cứu và thử nghiệm, tác giả nhận thấy rằng loại rong

S.mcclurei là phù hợp nhất với điều kiện thí nghiệm vì nhiều lý do sau đây:

- Là loại rong cho độ nhớt tương đối cao so với các loại rong cùng nghiên cứu khác

- Nguồn nguyên liệu dễ tìm trong khu vực biển Khánh Hòa

- Hiệu suất chiết cao hơn so với các loại rong cùng nghiên cứu khác

- Đánh giá cảm quan sơ bộ sản phẩm cho kết quả tốt hơn các loại rong cùng nghiên cứu khác

1.2 Nguồn rong sử dụng tách chiết acid alginic

Để tránh ảnh hưởng của việc bảo quản nguyên liệu không tốt do chuyên chở từ xa gây ảnh hưởng xấu đến độ nhớt của alginate, trong phần thí nghiệm này, dùng rong nâu thu hái ngay tại vùng biển Nha Trang , Khánh Hòa, tại Hòn Chồng, chỉ cách phòng thí nghiệm ít phút đi bộ

2 Phương pháp nghiên cứu

2.1 Phương pháp thu hoạch và bảo quản nguyên liệu

Rong được thu hái vào khoảng tháng 4-5, khi rong đã hình thành cơ quan sinh sản Sau khi phơi khô, rong được xay nhỏ thành bột

Rong dùng trong nghiên cứu thí nghiệm tách chiết được xử lý rất cẩn thận

để cố gắng duy trì chất lượng của alginate Do đó chỉ nghiên cứu các loài rong thu hái tại khu vực Nha Trang, tránh vận chuyển đi xa làm ảnh hưởng đến chất lượng.Sau khi phơi và xay, rong được cho vào bao PE, gói kín và cho vào bao bảo quản

2.2 Nghiên cứu tách chiết alginate [14] [15] [17] [20]

Thực hiện theo quy trình acid hóa Công đoạn nấu chiết có 3 yếu tố ảnh hưởng chính, đó là nồng độ soda, nhiệt độ nấu chiết và thời gian nấu chiết

Sơ đồ mô tả các nhân tố ảnh hưởng trong quá trình nấu chiết

Nồng độ soda Vi sinh

Nhiệt độ công đoạn nấu chiết Độ nhớt

Thời gian Màu sắc

a Hàm lượng và nồng độ kiềm trong dung dịch nấu chiết

Nồng độ kiềm và hàm lượng kiềm trong dung dịch nấu chiết cần đạt mức hợp lý để đạt mục đích là vừa nhanh chóng phá vỡ cấu trúc vừa tác dụng triệt để

để tạo alginate natri, ít làm ảnh hưởng đến liên kết glucosid trong phân tử Nếu liên kết glucosid bị phá vỡ, sẽ làm cho tính keo nhớt của alginate giảm đi, chất lượng kém, công dụng giảm.Trong thí nghiệm chúng tôi chọn dãi nồng độ Na2CO3(soda) từ 20%- 40%

b Thời gian nấu chiết

Cần phải xác định thời gian nấu chiết thích hợp để vừa chiết nhiều alginate

mà vẫn đảm bảo chất lượng Thời gian ngắn quá thì hiệu suất quy trình giảm, độ nhớt của alginate cũng giảm, thời gian dài quá cũng thế Thời gian nấu chiết khoảng từ 2-3h là thích hợp

c Lượng dung dịch nấu

Lượng dung dịch nấu cần hợp lý, nếu lượng kiềm quá thấp, làm cho nồng

độ chất keo cao, dẫn đến khả năng hòa tan keo rong từ nguyên liệu ra dung dịch giảm, độ nhớt của dịch nấu tăng, cản trở quá trình khuấy đảo, cản trở khâu lọc, làm cho hiệu suất chiết giảm Nếu lượng dung dịch kiềm quá cao, thì gây cồng kềnh cho quy trình sản xuất, giảm năng suất dây chuyền, khả năng cắt mạch glucosid lớn làm giảm chất lượng alginate

d Nhiệt độ nấu

Đặc điểm của dung dịch keo rong là có độ nhớt cao Do vậy cần phải nấu ở nhiệt độ cao tăng cường cho quá trình hòa tan, nhiệt độ cao còn thúc đẩy phản ứng nhanh, rong nhanh nát, thời gian nấu chiết rút ngắn, nhiệt độ nấu chiết nằm trong khoảng 65 oC -80oC

Cách xác định hiệu suất : hiệu suất tách chiết được quy theo phần trăm khối lượng alginate trên khối lượng rong khô đem tách chiết

Cách xác định độ nhớt: xác định trên máy đo độ nhớt Brookfield

3 Lọc- tinh chế- tách alginate không tan

a Lọc tách bã rong

Hỗn hợp sau khi tách chiết bao gồm algnate natri, và các tạp chất cơ học như bã rong và các hợp chất hòa tan: khoáng, chất màu, protein và các chất hòa tan khác Sử dụng các biện pháp lọc, ly tâm, lắng đọng, lọc ép, để lọc thô và lọc

tinh dung dịch Để tăng cường tốc độ lọc cần duy trì nhiệt độ hỗn hợp ở khoảng 65-70oC mục đích làm giảm độ nhớt và dễ lọc hơn Nếu dịch lọc quá đặc hì có thể pha loãng bằng nước nóng để dễ lọc Lượng nước nóng điều chỉnh không vượt quá tổng thể tích dịch lọc là 40l/kg rong khô

b Tinh chế và tách alginic không hòa tan

Thực hiện việc tinh chế dung dịch alginate Natri sau khi lọc thực chất là tẩy màu dung dịch Các chất được dùng để tẩy màu dung dịch thường dùng là: oxi già, thuốc tím, javen Tỷ lệ dung dịch và chất tẩy màu cũng như thời gian tẩy cần phải nghiên cứu chích xác để không làm giảm chất lượng và không ảnh hưởng dến các thông số cần thiết: độ nhớt, cảm quan, khối lượng phân tử, chiều dài mạch…

Trong đề tài này, tôi sử dụng NaClO ( nước javen) để tẩy, vì nhiều nghiên cứu cho thấy:

- NaClO tẩy màu mạnh hơn thuốc tím và chi phí lại thấp, hơn nữa thuốc tím còn dư phải dùng thuốc khử để loại bỏ

- NaClO ít ảnh hưởng đến độ nhớt của alginate

- Phản ứng tách alginic không hòa tan như sau:

2nC5H7O4COONa + nH2SO4 2nC5H7O4COOH + nNa2HPO4

2nC5H7O4COONa + nHCl 2nC5H7O4COOH+ nNaCl

Lượng acid tiêu hao khi kết tủa được xác định qua thực nghiệm Khi pH 2-3 thì quá trình kết tủa alginic thực hiện hoàn toàn Trong thực tế sản xuất, người ta pha acid sunfuric công nghiệp thành 10%, sau đó rót từ từ vào dịch lọc và khuấy đảo đều Kết tủa alginate dạng bọt biển nổi lên trên được vớt ra và tiếp tục thêm một lượng acid thừa vào cho kết tủa hết