NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT KHÁNG SINH PENICILLIN BẰNG ENZYME CỐ ĐỊNH PENICILLIN ACYLASE
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP.HCM KHOA MÔI TRƯỜNG & CÔNG NGHỆ SINH HỌC TIỂU LUẬN: NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT KHÁNG SINH PENICILLIN BẰNG ENZYME CỐ ĐỊNH PENICILLIN ACYLASE. Lớp: 06DSH Giáo viên hướng dẫn: Ths. Phan Văn Dân Nhóm 3: 1. Trần Đông Hạ 2. Trần Nhật Linh 3. Đặng Thị Lê Phương 4. Nguyễn Kiều Trang 5. Nguyễn Hoàng Mỹ Duyên MỤC LỤC PHẦN I: GIỚI THIỆU PHẦN II: NỘI DUNG I/ Giới thiệu về enzyme cố định 1. Ý nghĩa của enzyme cố định 2. Định nghĩa enzyme cố định 3. Các phương pháp điều chế enzyme cố định 3.1 Phương pháp gắn enzyme bằng liên kết cộng hoá trị 3.2 Phương pháp gói enzyme trong khuôn gel 3.3 Cố định enzyme bằng phương pháp hấp thụ trên các chất mang hoăc không có điện tích. 4 Một số đặc tính của enzyme cố định. 5 Một số ứng dụng của enzyme cố định trong sản xuất 5.1 Sử dụng aminoacylase cố định để sản xuất axitamin. 5.2 Sản xuất L-axit aspartic bằng enzyme asperza cố định. 5.3 Thuỷ phân lactoza bằng enzyme lactaza cố định. 5.4 Sản xuất nhóm penicilin-axit 6 amino penicillinic (6-APA) bằng enzyme cố định penicillin acylase. II/ Giới thiệu về kháng sinh 1. Lịch sử hình thành 2. Cấu tạo của penicillin 3. Tính chất hóa lý 4. Các yếu tố ảnh hưởng 4.1 Động học của enzyme penicillin acylase 4.2 Bản chất và tính chất hóa học của chất mang - -6 4.3 Sự khuếch tán của cơ chất, sản phẩm và các phân tử khác 4.4 Ảnh hưởng pH III/ Quy trình sản xuất 1. Kỷ thuật sản xuất enzyme penicillin acylase 2. Kỷ thuật sản xuất kháng sinh bán tổng hợp 2.1 Sản xuất penicillin G từ nguyên liệu tự nhiên 2.1.1 Điều kiện lên men: 2.1.2 Thành phần môi trường lên men 2.1.3 Quy trình lên men: 2.1.4 Xử lý dịch lên men và tinh chế thu nhận penicillin tự nhiên 2.2 Sản xuất penicillin bán tổng hợp từ penicillin G tự nhiên: 3. Các sản phẩm kháng sinh bán tổng hợp Phần III : KẾT LUẬN - -7 PHẦN I: MỞ ĐẦU Các kháng sinh là một nhóm thiết yếu trong y học hiện đại. Nhờ kháng sinh mà y học có thể chữa được các bệnh nguy hiểm như dịch hạch, tả, thương hàn, và điều trị hiệu quả nhiều loại bệnh do vi khuẩn gây ra. Đối với nước nghèo, Các thuốc kháng sinh giữ một vị trị quan trọng vì các nước này do vệ sinh yếu kém và mức sống còn thấp nên thường xảy ra các vụ dịch nhiễm khuẩn hô hấp, kiết lỵ . Hiện nay trên thế giới đã phát hiện trên 8000 kháng sinh và mỗi năm có vài trăm kháng sinh mới được phát hiện. Trong tương lai sẽ có nhiều kháng sinh mới được phát hiện từ quá trình bán tổng hợp bằng cách sử dụng enzyme cố định. Việc sử dụng enzyme cố định làm chất xúc tác sinh học cho quá sản xuất kháng sinh bán tổng hợp vừa có ý nghĩa về mặt kinh tế vừa giải quyết nhiều vấn đề xã hội, các vần đề môi trường. Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi đã thực hiện đề tài “ Nghiên cứu quá trình sản xuất kháng sinh bán tổng hợp bằng enzyme penicillin acylase”. - -8 PHẦN II: NỘI DUNG I/ Giới thiệu về enzyme cố định 1. Ý nghĩa của enzyme cố định Trong những năm cuối của thế kỷ 20 bắt đầu phổ biến kỹ thuật cố định enzyme. Enzyme hoà tan sau khi sử dụng thường lẩn vào cùng với sản phẩm không tách ra được. Nếu tách ra thì enzyme bị mất hoạt tính, vì vậy với một lượng enzyme nhất định chỉ có thể sử dụng được một lần. Sử dụng enzyme cố định có một số ưu điểm sau: Một lượng enzyme có thể sử dụng lặp đi lặp lại nhiều lần trong một thời gian dài. Enzyme không lẩn vào trong sản phẩm, do đó tránh được ảnh hưởng không tốt đến lượng sản phẩm; Dùng enzyme cố định có thể dừng nhanh chóng phản ứng khi cần thiết bằng cách tách nó ra khỏi cơ chất. 2. Định nghĩa enzyme cố định Enzyme cố định là enzyme được sử dụng nhiều lần lập lại. Đây là một hướng công nghệ rất triển vọng. Cho đến nay đã có 2 công nghệ sử dụng enzyme cố định trong sản xuất công nghiệp: glucose isomerase có định trong sản xuất siro frustose và penicillin acylase (amidase) cố định trong sản xuất penicillin. Là enzyme có sự tham gia hoạt động trong một không gian bị giớihạn. Sự giới hạn hoạt động vốn linh hoạt của enzyme bằng cách gắn nó vào một pha cách ly, tách nó khỏi pha lỏng tự do và ở đó nó vẫn có khả năng tiếp xúc được với các phần tử cơ chất. Pha gắn enzyme thường không tan trong nước nhưng cũng có thể là các polyme ưa nước. Trong triển khai công nghệ sử dụng enzyme cố định người ta quan tâm một số vấn đề: Tạo thiết bị hoạt động có hiệu suất hoạt động và mức độ hoạt động tự hóa cao, sử dụng nền chứa enzyme cố định hoạt động đậm đặc hơn. - -9 Tập trung triển khai hoàn thiện quá trình kiểm soát và công nghệ sản xuất liên tục. Do vậy không phải bất cứ enzyme nào cũng tìm cách sử dụng ở dạng cố định, chỉ nên sử dụng công nghệ enzyne một cách có hiệu quả nhất. Xu hướng hiện nay là tập trung triển khai công nghệ sử dụng enzyme cố định đắt tiền, có giá trị cao, xúc tác trên cơ chất có MW nhỏ, dễ kiểm soát sự lây nhiễm và sản phẩm không chứa enzyme. Enzyme không tan được nghiên cứu và ứng dụng từ những năm 1950. Để chế tạo enzyme cố định có thể dùng phương pháp hấp phụ, liên kết hoá trị để gắn kết enzyme gọi là chất mang (enzyme), hiện nay người ta dùng xenluloza, tinh bột, sephadex, agaroza, alghinat, canxi, gel polycylamit, bột thuỷ tinh, nilon… Chế phẩm enzyme không tan có thể ở dạng bột, hạt, phiến màng mỏng. Trong một số trường hợp không cần thiết phải gắn enzyme vào chất mang mà có thể giữ nó ở bên trong mạng lưới polyme bao quây lấy phần tử enzyme. Mạng lưới đó có mặt nhờ sự không cho phép enzyme thoát ra khỏi nhưng vẫn đủ lớn để sản phẩm và cơ chất tạo ra dễ dàng. 3. Các phương pháp điều chế enzyme cố định Theo kỹ thuật chế tạo enzyme cố định, enzyme được gắn vào một vật mang nào đó. Những vật mang như vậy có thể là cellulose và các dẫn xuất của nó, các hạt kính xốp, gel polyacrylamide, sephadex, collodium, tinh bột, các loại allumosilicate và oxide kim loại Về nguyên tắc, có 3 phương pháp điều chế các enzyme cố định : - Gắn bằng liên kết đồng hoá trị phân tử enzyme vào chất mang không hoà tan hoặc gắn các enzyme với nhau để tạo nên đại phân tử không hoà tan - -10 - Đính enzyme lên bề mặt chất mang hoặc vào trong lòng khuôn gel có kích thước lổ khá nhỏ đủ để giữ enzyme, còn để các chất khác qua lại tự do 0 - Hấp phụ enzyme lên trên các chất mang không hoà tan có mang hoặc không mang điện tích - -11 3.1 Phương pháp gắn enzyme bằng liên kết cộng hoá trị Đa số enzyme cố định thu được bằng phương pháp này. Với phương pháp này có thể thu enzyme cố định bằng hai cách Kết hợp phân tử protein enzyme vào chất mang không hoà tan Các chất mang để gắn enzyme phải thoả mãn những yêu cầu sau : - Có độ hoà tan thấp và bền vững đối với các tác động cơ học và hoá học. - Không gây tác động kìm hãm đến hoạt tính enzyme. - Không hấp phụ khi chọn lọc đối với các protein khác. - Chất mang tốt hơn cả là có tính háo nước, vì chất mang kỵ nước có thể gây tác dụng ức chế enzyme đã liên kết. - Việc gắn enzyme sẽ có hiệu quả hơn khi điện tích của enzyme và của chất mang có dấu ngược nhau. Các chất mang loại này thường là polypeptide,các dẫn xuất của cellulose và Dextran (DEAE-cellulose, CM-cellulose, DEAE-sephadex, CM,sephadex),agarose và các polimer tổng hợp khác như polyacrilamide, polysyrol, polystytol, polyamide và các chất vô cơ như silicagen, bentonit,.v v Chất mang phổ biến hơn cả là dextran có liên kết ngang (Sephadex ) và garose hạt (sepharose). Các hai loại chất này đều có cấu trúc lỗ xốp khiến cho các phân tử lớn có thể xâm nhập vào gel một cách dễ dàng. Poliacrylamide cũng là chất mang rất tiện lợi vi có độ bền vững cơ học và hoá học cao. Chất mang vô cơ thường rất bền với nhiệt, cơ học, với dung môi hữu cơ và các vi sinh vật, nhất là không bị biến đổi cấu hình của khuôn khi thay đổi tính chất của môi trường chung quanh. Nhiều dẫn liệu cho thấy rằng enzyme đính với khuôn vô cơ khi bảo quản thường bền vững hơn enzyme gắn với khuôn polymer hữu cơ. - -12 Tham gia tạo thành các liên kết dòng hoá trị có thể có các nhóm chức của phân tử protein enzyme như nhóm β- và γ- carboxyl – COOH của acid asparaginic và aid glutamic, nhóm ε-NH2 của lysine, nhóm β-SH của cysteine, vòng phenol của tyrosine, nhân imidasol của histidine, các nhóm OH của serine, threonine, nhóm guanidine của arginine và imidasol của tryptophan. Quá trình kết hợp enzyme sẽ xảy ra một cách trực tiếp khi chất mang có chứa các nhóm chức có khả năng liên kết trực tiếp nói trên trong phân tử protein enzyme. Ví dụ gốc anhydride maleic liên kết với nhóm ε-NH2 của lysine. Trong các trường hợp khác nhau sự liên kết giữa chất mang và protein enzyme chỉ xảy ra sau khi chất mang đã được hoạt hoá. Việc hoạt hoá sơ bộ chất mang có thể được thực hiện bằng nhiều cách. Ví dụ, các nhóm hydroxyl của dextran hoặc polyoside khác có thể được hoạt hoá bằng bromur cyan ( BrCN). Sau đó chất mang đã được hoạt hoá mới liên kết với enzyme Các chất mang có chứa nhóm amin như aminobenzoylcelluse, polyaminostyrol có thể được hoạt hoá bằng phản ứng diazo. - -13 Ví dụ, polyaminostyrol trước hết được diazo hoá bằng natri nitrit trong dung dịch môi trường acid thành muối diazo, sau đó mới kết hợp với enzyme: Phản ứng kết hợp enzyme được tiến hành nhanh chóng trong điều kiện nhiệt dộ thường và dung dịch nước trung tính. Nếu chất mang có chứa nhóm amin có thể hoạt hoá bằng cách cho tác dụng với phosgen hoặc tiophosgen để tạo thành dẫn xuất isosianat hoặc izothyosianat. Các nhóm isosianat hoặc izothyosianat ở pH trung tính sẽ liên kết dễ dàng với nhóm εNH2 của lyzine. Bằng phương pháp này người ta đã điều chế được các dẫn xuất enzyme cố định như trypsin, chimotrypsin, α-,β-amylase, glucoamylase. Nếu chất mang có chứa nhóm –COOH như CM-cellulose hoặc nhựa tổng hợp thì cần được hoạt hoá trước khi gắn kết với enzyme bằng các phương pháp axit, carbodiimit - -14 [...]... thu bán thành phẩm penicillin tự nhiên - 30 Sản xuất các penicillin bán tổng hợp (từ nguyên liệu penicillin tự nhiên) Pha chế các loại thuốc kháng sinh penicillin thương mại Qui trình sản xuất kháng sinh penicillin 2.1 Sản xuất penicillin G từ nguyên liệu tự nhiên Phương pháp sản xuất penicillin tự nhiên là sinh tổng hợp từ nấm mốc P chrysogenum - 31 Quá trình sinh tổng hợp penicillin ở nấm mốc... Trong quá trình nghiên cứu penicillin G, người ta đã tìm thấy được enzyme penicillin amidase có khả năng thủy phân penicillin G (hay V) thay thế các hóa chất đồng thời thúc đẩy phản ứng xảy ra nhanh hơn trong sản xuất kháng sinh penicillin bán tổng hợp Do vậy để tăng hiệu quả sản xuất cần nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến enzyme thủy phân 4.1 Động học của enzyme penicillin acylase: Quá trình cố định có... ưu của enzyme, pH tối ưu của penicillin acylase sau gắn lên chất mang pH thích hợp cho enzyme 7.5 - 8.0 III/ Quy trình sản xuất: 1 Kỷ thuật sản xuất enzyme penicillin acylase: Acylases Penicillin được tìm thấy trong các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm men, và nấm, được sử dụng để xúc tác các thủy phân tự nhiên của penicillin Penicillin ngoại bào được chiết xuất từ: xạ khuẩn, nấm men, nấm mốc Enzyme. .. vi sinh vật sử dụng khi lên men sữa (các sản phẩm sữa chua và phomat ) 5.4 Sản xuất nhóm penicilin-axit 6 amino penicillinic (6-APA) bằng enzyme cố định penicillinamidaza Penicillin là một nhóm chất có tính kháng sinh, cấu tạo chung là: Với R là gốc axyl thì ta có penicillin G- là penicillin thương mại và sinh hoạt phổ biến nhất hiện nay Enzyme penicillinamidaza xúc tác thuỷ phân benzyl penicillin (penicillin. .. thấy: Trong E.coli acylase penicillin có hai chuỗi monomer (A và B), trong đó bao gồm 209 và 557 axit amin.Hai chuỗi phân tử này cuộn vào nhau chặt chẽ tạo thành một hình chóp.Kết thúc quá trình nuôi cấy chiết xuất lấy penicillin acylase rồi cố định enzyme trên polyacrylamide 2 Kỷ thuật sản xuất kháng sinh: Công nghệ lên men sản xuất penicillin mang nét đặc thù riêng của từng cơ sở sản xuất và các thông... Progetti (Italia) với sản lượng khoảng 40 tấn/ năm Phương pháp enzyme cố định để sản xuất 6-APA cho hiệu quả tương đối cao (9095%) và đã được áp dụng rộng rải ở nhiều nước, mang lại hiệu quả kinh tế cao Hơn 50% 6_APA trên thế giới sản xuất theo phương pháp enzyme cố định Hiện nay một số nhà máy sản xuất penicillin chỉ cho xuất xưởng thành phẩm 6-APA - 37 3 Các sản phẩm kháng sinh bán tổng hợp: Tùy... lớp váng Quá trình này tiến hành ở 240C trong 6-7 ngày Trong quá trình lên men cần thổi khí vô trùng Hiện nay người ta sử dụng lên men chìm để sản xuất ra các penicilin Penicillin G là kháng sinh đầu tiên được sản xuất bằng công nghệ lên men chìm vào năm 1947.Quá trình lên men tạo penicillin G có 2 pha: pha sinh trưởng sinh - 34 kháng sinh Ở pha lên men thứ nhất nấm phát triển hệ sợi mạnh, sinh khối tăng... đường hướng quá trình lên men để lên men sản xuất penicillin G (bằng sử dụng tiền chất Phenylacetic) Năm 1943, penicillin được sản xuất ở qui mô công nghiệp ở Mỹ để phụ vụ các bệnh nhiễm trùng cho thương binh trong chiến tranh trong thế giới thứ II - 21 Penicillin cũng là chất kháng sinh đầu tiên được sản xuất lên men chìm ở qui mô công nghiệp (1947) Năm 1941, penicillin G là kháng sinh có hiệu quả... lỗ thì các phân tử enzyme sẽ xâm nhập vào trong các lỗ 4 Một số đặc tính của enzyme cố định Việc cố định làm thay đổi đáng kể nhiều tính chất của enzyme như độ bền, tính đặc hiệu, đặc điểm động học Thông thường việc cố định làm tắng đáng kể độ bền của enzyme Ví dụ , cố định protease làm tăng đọ bền với nhiệt gấp chục nghìn lần Sau khi được cố định không những độ bền với nhiệt của enzyme tăng lên mà... tác thuỷ phân benzyl penicillin (penicillin để tạo thành nhóm penicillin 6-APA và axit phenyl axetic 6-APA được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp dược phẩm để sản xuất các loại kháng sinh họ penicillin Hiện nay toàn bộ 6-APA của thế giới đều được sản xuất bằng phương pháp sử dụng enzyme penicillinamidaza cố định Đây là enzyme nội bào khi sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Esterichia – coli, bacterium faecalic,