III/ Quy trình sản xuất:
R-CO-NHR' R-CO-NHR'
2.1 Sản xuất penicilli nG từ nguyên liệu tự nhiên
Phương pháp sản xuất penicillin tự nhiên là sinh tổng hợp từ nấm mốc P. chrysogenum.
Quá trình sinh tổng hợp penicillin ở nấm mốc P. chrysogenum có thể tóm tắt như sau: từ ba tiền chất ban đầu là α -aminoadipic, cystein và valin sẽ ngưng tụ lại thành tripeptit δ -(α - aminoadipyl) - cysteinyl - valin; tiếp theo là quá trình khép mạch tạo vòng β -lactam và vòng thiazolidin để tạo thành izopenicillin-N; rồi trao đổi nhóm α -aminoadipyl với phenylacetic (hay phenooxyacetic) tạo thành sản phẩm penicillin G (hay penicillin V, xem sơ đồ tổng hợp penicillin G trong hình.
Hình: Sơ đồ cơ chế sinh tổng hợp penicillin từ axit L-α - aminoadipic, L-cystein và L-valin.
2.1.1 Điều kiện lên men:
Nhiệt độ: Thường tiến hành nhân giống ở 300C, lên men ở 23 –250C.
pH: pH thích hợp trong khoảng 6,0 – 6,5. Trong quá trình lên men
pH môi trường thay đổi tùy thuộc vào tốc độ sử dụng các chất cacbon và nitơ. Để ổn định pH người ta cho vào CaCO3 vào môi trường len men.
Thông khí: P. chrysogenum là chủng rất ưa khí nên trong quá trình
nuôi cấy cần thổi khí ( đối với lên men bề mặt), lắc hoặc khuấy kèm thèo sục khí ( lên men chìm). Nhu cầu cấp khí khi có khuấy trộn liên tục là 1.2 – 1.5 VVM.
2.1.2 Thành phần môi trường lên men:
2.1.3 Quy trình lên men:
Trong những năm 40 của thế kỷ XX việc sản xuất penicillin được thực hiện bằng phương pháp lên men bề mặt có thể là có chất rắn hoặc lỏng. Cơ chất rắn có thể là các loại hạt hoặc cám. Để lên men cơ chất lỏng người ta nuôi trong các chai lọ thủy tinh có chứa môi trường dinh dưỡng. Váng mốc sau khi lên men có thể dùng cho lên men lần thứ 2 bằng cách nuôi trong môi trường dinh dưỡng mới dưới lớp váng. Quá trình này tiến hành ở 240C trong 6-7 ngày. Trong quá trình lên men cần thổi khí vô trùng.
Hiện nay người ta sử dụng lên men chìm để sản xuất ra các penicilin. Penicillin G là kháng sinh đầu tiên được sản xuất bằng công nghệ lên men chìm vào năm 1947.Quá trình lên men tạo penicillin G có 2 pha: pha sinh trưởng sinh
kháng sinh. Ở pha lên men thứ nhất nấm phát triển hệ sợi mạnh, sinh khối tăng nhanh, chất dinh dưỡng đượ đồng hóa nhiều, cường độ hô hấp tăng dần đến cực đại, pH tăng dần và penicillin G được tạo thành ít. Ở pha lên men thứ hai hệ sợi phát triển chậm, lactose được đồng hóa, pH tăng đến khoảng 7 – 7.5 và penicillin G được tạo thành trong khoảng này. Hiệu suất sinh tổng hợp phụ thuộc nhiều vào lượng sinh khối trong môi trường.
2.1.4 Xử lý dịch lên men và tinh chế thu nhận penicillin tự nhiên:
Quá trình tinh chế và tinh chiết penicillin từ môi trường lên men Có 3 phương pháp thu nhận và tinh chế penicillin từ môi trường nuôi cấy:
Trích ly bằng dung môi hữu cơ.
Hấp phụ.
Trao đổi ion.
Phương pháp trích ly bằng dung môi hữu cơ được sử dụng nhiều nhất vì có những ưu điểm:
Acid penicillin rất đễ tan trong dung môi hữu cơ.
Chiết penicillin trên máy ly tâm siêu tốc bằng dung môi hữu cơ không trộn lẫn với nước ( thường dùng butyl acetat). Bốc hơi chân không đến nồng độ nhất định, thêm than hoạt tính ( 1%) vào để tẩy màu. Dịch lọc sau khi loại than được loại nước bằng cách hạ nhiệt độ xuống -200C.
Kết tinh penicillin G bằng cách bổ sung trực tiếp vào dung môi sau khi tẩy màu một lượng nhỏ kali acetat ( hay natri acetat ) hoặc ly trích sang dung dịch KOH loãng ( hay NaOH loãng), tiến hành cô chân không ở nhiệt độ thấp, sau đó bổ sung BuOH để penicillin tự kết tinh.