NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT KHÁNG SINH PENICILLIN BẰNG ENZYME CỐ ĐỊNH PENICILLIN ACYLASE

Các kháng sinh là một nhóm thiết yếu trong y học hiện đại. Nhờ kháng sinh mà y học có thể chữa được các bệnh nguy hiểm như dịch hạch, tả, thương hàn, và điều trị hiệu quả nhiều loại bệnh do vi khuẩn gây ra.

KHÁNG SINH PENICILLIN BẰNG ENZYME CỐ ĐỊNH PENICILLIN ACYLASE.

Lớp: 06DSH Giáo viên hướng dẫn: Ths Phan Văn Dân Nhóm 3:

1 Trần Đông Hạ

2 Trần Nhật Linh

3 Đặng Thị Lê Phương

4 Nguyễn Kiều Trang

5 Nguyễn Hoàng Mỹ Duyên

MỤC LỤCPHẦN I: GIỚI THIỆU

PHẦN II: NỘI DUNG

I/ Giới thiệu về enzyme cố định

1 Ý nghĩa của enzyme cố định

2 Định nghĩa enzyme cố định

3 Các phương pháp điều chế enzyme cố định

3.1 Phương pháp gắn enzyme bằng liên kết cộng hoá trị

3.2 Phương pháp gói enzyme trong khuôn gel

3.3 Cố định enzyme bằng phương pháp hấp thụ trên các chất mang hoăc không có điện tích

4 Một số đặc tính của enzyme cố định

5 Một số ứng dụng của enzyme cố định trong sản xuất

5.1 Sử dụng aminoacylase cố định để sản xuất axitamin

5.2 Sản xuất L-axit aspartic bằng enzyme asperza cố định

5.3 Thuỷ phân lactoza bằng enzyme lactaza cố định

5.4 Sản xuất nhóm penicilin-axit 6 amino penicillinic (6-APA)

bằng enzyme cố định penicillin acylase

II/ Giới thiệu về kháng sinh

1 Lịch sử hình thành

2 Cấu tạo của penicillin

3. Tính chất hóa lý

4 Các yếu tố ảnh hưởng

4.1 Động học của enzyme penicillin acylase

4.2 Bản chất và tính chất hóa học của chất mang4.3 Sự khuếch tán của cơ chất, sản phẩm và các phân tử khác

4.4 Ảnh hưởng pH

III/ Quy trình sản xuất

1. Kỷ thuật sản xuất enzyme penicillin acylase

2. Kỷ thuật sản xuất kháng sinh bán tổng hợp

2.1 Sản xuất penicillin G từ nguyên liệu tự nhiên

2.1.1 Điều kiện lên men:

2.1.2 Thành phần môi trường lên men 2.1.3 Quy trình lên men:

2.1.4 Xử lý dịch lên men và tinh chế thu nhận penicillin tự nhiên 2.2 Sản xuất penicillin bán tổng hợp từ penicillin G tự nhiên:

3 Các sản phẩm kháng sinh bán tổng hợp

Phần III : KẾT LUẬN

PHẦN I: MỞ ĐẦU

Các kháng sinh là một nhóm thiết yếu trong y học hiện đại Nhờ kháng sinh mà y học có thể chữa được các bệnh nguy hiểm như dịch hạch, tả, thương hàn, và điều trị hiệu quả nhiều loại bệnh do vi khuẩn gây ra Đối với nước nghèo, Các thuốc kháng sinh giữ một vị trị quan trọng vì các nước này do vệ sinh yếu kém và mức sống còn thấp nên thường xảy ra các vụ dịch nhiễm khuẩn hô hấp, kiết lỵ

Hiện nay trên thế giới đã phát hiện trên 8000 kháng sinh và mỗi năm có vài trăm kháng sinh mới được phát hiện Trong tương lai sẽ có nhiều kháng sinh mới được phát hiện từ quá trình bán tổng hợp bằng cách sử dụng enzyme cố định Việc sử dụng enzyme cố định làm chất xúc tác sinh học cho quá sản xuất kháng sinh bán tổng hợp vừa có ý nghĩa về mặt kinh tế vừa giải quyết nhiều vấn đề xã hội, các vần

đề môi trường

Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi đã thực hiện đề tài “ Nghiên cứu quá trình sản

xuất kháng sinh bán tổng hợp bằng enzyme penicillin acylase”.

PHẦN II: NỘI DUNG

I/ Giới thiệu về enzyme cố định

1 Ý nghĩa của enzyme cố định

Trong những năm cuối của thế kỷ 20 bắt đầu phổ biến kỹ thuật cố định enzyme

Enzyme hoà tan sau khi sử dụng thường lẩn vào cùng với sản phẩm không tách ra được Nếu tách ra thì enzyme bị mất hoạt tính, vì vậy với một lượng enzyme nhất định chỉ có thể sử dụng được một lần

Sử dụng enzyme cố định có một số ưu điểm sau:

 Một lượng enzyme có thể sử dụng lặp đi lặp lại nhiều lần trong một thời gian dài

 Enzyme không lẩn vào trong sản phẩm, do đó tránh được ảnh hưởng không tốt đến lượng sản phẩm;

 Dùng enzyme cố định có thể dừng nhanh chóng phản ứng khi cần thiết bằng cách tách nó ra khỏi cơ chất

2 Định nghĩa enzyme cố định

Enzyme cố định là enzyme được sử dụng nhiều lần lập lại Đây là một hướng công nghệ rất triển vọng Cho đến nay đã có 2 công nghệ sử dụng enzyme cố định

trong sản xuất công nghiệp: glucose isomerase có định trong sản xuất siro frustose

và penicillin acylase (amidase) cố định trong sản xuất penicillin Là enzyme có sự

tham gia hoạt động trong một không gian bị giớihạn

Sự giới hạn hoạt động vốn linh hoạt của enzyme bằng cách gắn nó vào một pha cách ly, tách nó khỏi pha lỏng tự do và ở đó nó vẫn có khả năng tiếp xúc được với các phần tử cơ chất Pha gắn enzyme thường không tan trong nước nhưng cũng có thể là các polyme ưa nước

Trong triển khai công nghệ sử dụng enzyme cố định người ta quan tâm một số vấn đề:

 Tạo thiết bị hoạt động có hiệu suất hoạt động và mức độ hoạt động tự hóacao, sử dụng nền chứa enzyme cố định hoạt động đậm đặc hơn

 Tập trung triển khai hoàn thiện quá trình kiểm soát và công nghệ sản xuất liên tục

Do vậy không phải bất cứ enzyme nào cũng tìm cách sử dụng ở dạng cố định, chỉ nên sử dụng công nghệ enzyne một cách có hiệu quả nhất Xu hướng hiện nay là tập trung triển khai công nghệ sử dụng enzyme cố định đắt tiền, có giá trị cao, xúc tác trên cơ chất có MW nhỏ, dễ kiểm soát sự lây nhiễm và sản phẩm không chứa enzyme.

Enzyme không tan được nghiên cứu và ứng dụng từ những năm 1950 Để chế tạo enzyme cố định có thể dùng phương pháp hấp phụ, liên kết hoá trị để gắn kết enzyme gọi là chất mang (enzyme), hiện nay người ta dùng xenluloza, tinh bột, sephadex, agaroza, alghinat, canxi, gel polycylamit, bột thuỷ tinh, nilon… Chế phẩm enzyme không tan có thể ở dạng bột, hạt, phiến màng mỏng

Trong một số trường hợp không cần thiết phải gắn enzyme vào chất mang mà có thể giữ nó ở bên trong mạng lưới polyme bao quây lấy phần tử enzyme Mạng lưới

đó có mặt nhờ sự không cho phép enzyme thoát ra khỏi nhưng vẫn đủ lớn để sản phẩm và cơ chất tạo ra dễ dàng

3 Các phương pháp điều chế enzyme cố định

Theo kỹ thuật chế tạo enzyme cố định, enzyme được gắn vào một vật mang nào

đó Những vật mang như vậy có thể là cellulose và các dẫn xuất của nó, các hạt kính xốp, gel polyacrylamide, sephadex, collodium, tinh bột, các loại allumosilicate và oxide kim loại

Về nguyên tắc, có 3 phương pháp điều chế các enzyme cố định :

- Gắn bằng liên kết đồng hoá trị phân tử enzyme vào chất mang không hoà tan hoặc gắn các enzyme với nhau để tạo nên đại phân tử không hoà tan

- Đính enzyme lên bề mặt chất mang hoặc vào trong lòng khuôn gel

có kích thước lổ khá nhỏ đủ để giữ enzyme, còn để các chất khác qua lại tự do

0- Hấp phụ enzyme lên trên các chất mang không hoà tan có mang hoặc không mang điện tích

3.1 Phương pháp gắn enzyme bằng liên kết cộng hoá trị

Đa số enzyme cố định thu được bằng phương pháp này Với phương pháp này có thể thu enzyme cố định bằng hai cách

 Kết hợp phân tử protein enzyme vào chất mang không hoà tan

Các chất mang để gắn enzyme phải thoả mãn những yêu cầu sau :

- Có độ hoà tan thấp và bền vững đối với các tác động cơ học và hoá học

- Không gây tác động kìm hãm đến hoạt tính enzyme

- Không hấp phụ khi chọn lọc đối với các protein khác

- Chất mang tốt hơn cả là có tính háo nước, vì chất mang kỵ nước có thể gây tác dụng ức chế enzyme đã liên kết

- Việc gắn enzyme sẽ có hiệu quả hơn khi điện tích của enzyme và của chất mang có dấu ngược nhau

Các chất mang loại này thường là polypeptide,các dẫn xuất của cellulose vàDextran (DEAE-cellulose, CM-cellulose, DEAE-sephadex, CM,sephadex),agarose

và các polimer tổng hợp khác như polyacrilamide, polysyrol, polystytol, polyamide

và các chất vô cơ như silicagen, bentonit,.v v

Chất mang phổ biến hơn cả là dextran có liên kết ngang (Sephadex ) và garose hạt (sepharose) Các hai loại chất này đều có cấu trúc lỗ xốp khiến cho các phân tử lớn có thể xâm nhập vào gel một cách dễ dàng

Poliacrylamide cũng là chất mang rất tiện lợi vi có độ bền vững cơ học và hoá học cao

Chất mang vô cơ thường rất bền với nhiệt, cơ học, với dung môi hữu cơ và các vi sinh vật, nhất là không bị biến đổi cấu hình của khuôn khi thay đổi tính chất của môi trường chung quanh Nhiều dẫn liệu cho thấy rằng enzyme đính với khuôn vô

cơ khi bảo quản thường bền vững hơn enzyme gắn với khuôn polymer hữu cơ

Tham gia tạo thành các liên kết dòng hoá trị có thể có các nhóm chức của phân

tử protein enzyme như nhóm β- và γ- carboxyl – COOH của acid asparaginic và aid glutamic, nhóm ε-NH2 của lysine, nhóm β-SH của cysteine, vòng phenol của tyrosine, nhân imidasol của histidine, các nhóm OH của serine, threonine, nhóm guanidine của arginine và imidasol của tryptophan

Quá trình kết hợp enzyme sẽ xảy ra một cách trực tiếp khi chất mang có chứa các nhóm chức có khả năng liên kết trực tiếp nói trên trong phân tử protein enzyme

Ví dụ gốc anhydride maleic liên kết với nhóm ε-NH2 của lysine

Trong các trường hợp khác nhau sự liên kết giữa chất mang và protein enzyme chỉ xảy ra sau khi chất mang đã được hoạt hoá

Việc hoạt hoá sơ bộ chất mang có thể được thực hiện bằng nhiều cách Ví dụ, các nhóm hydroxyl của dextran hoặc polyoside khác có thể được hoạt hoá bằng bromur cyan ( BrCN) Sau đó chất mang đã được hoạt hoá mới liên kết với enzyme

Các chất mang có chứa nhóm amin như aminobenzoylcelluse, polyaminostyrol có thể được hoạt hoá bằng phản ứng diazo

Ví dụ, polyaminostyrol trước hết được diazo hoá bằng natri nitrit trong dung dịch môi trường acid thành muối diazo, sau đó mới kết hợp với enzyme:

Phản ứng kết hợp enzyme được tiến hành nhanh chóng trong điều kiện nhiệt

dộ thường và dung dịch nước trung tính

Nếu chất mang có chứa nhóm amin có thể hoạt hoá bằng cách cho tác dụng với phosgen hoặc tiophosgen để tạo thành dẫn xuất isosianat hoặc izothyosianat Các nhóm isosianat hoặc izothyosianat ở pH trung tính sẽ liên kết dễ dàng với nhóm εNH2 của lyzine

Bằng phương pháp này người ta đã điều chế được các dẫn xuất enzyme cố định như trypsin, chimotrypsin, α-,β-amylase, glucoamylase

Nếu chất mang có chứa nhóm –COOH như CM-cellulose hoặc nhựa tổng hợp thì cần được hoạt hoá trước khi gắn kết với enzyme bằng các phương pháp axit, carbodiimit

Vì phản ứng xảy ra trong môi trường acid yếu (pH=5) nên

phương pháp này đặc biệt thuận lợi với các enzyme có tính acid như pepsin

 Kết hợp đồng hoá trị giữa các phân tử enzyme với chất mang

Cố định enzyme bằng cách liên kết đồng hoá trị được thực hiện bằng cách khác nhau :

1/ Liên kết đồng hoa trị được tạo ra giữa các nhóm phản ứng của vật mang

và enzyme; trong một số trường hợp vật mang cần được hoạt hoá sơ bộ;

2/ Các phân tử enzyme sau khi được hấp thụ trên chất mang hoặc nằm trong lòng phân tử chất mang liên kết với nhau nhờ tính lưỡng chức hoặc đa chức của chất phản ứng Người ta thường dùng aldehyde glutaric để găn các nhóm amin của

lysine ở các phân tử enzyme Ví dụ,trypsine cố định trysin được điều chế bằng cách dùng aldehyde glutaric 2! Để liên kết các phân tử enzyme và gắn chúng vào aminoethylcelluse.

3.2 Phương pháp gói enzyme trong khuôn gel

Để gói enzyme vào khuôn gel người ta tiến hành trùng hợp hoá học các gel khi

có mặt đồng thời enzyme Sau khi hoàn thành quá trình trùng hợp enzyme bị giữ chắc trong gel Gel đã có enzyme có thể nghiền nhỏ bằng cách ép qua rây có lỗ nhỏ

và sấy khô ở nhiệt độ thấp.Dẩn xuất enzyme loại này lần đầu tiên do Bernfeld (1993)thu được bằng cách trùng hợp acrylamide với N,N’-methylenbisacrylamide Phương pháp này thường dùng do chất trùng hợp thu được dể tạo thành dạng hạt và tuỳ thuộc vào điều kiện tiến hành mà gel có thể có độ xốp khác nhau Sau đây là một số phương pháp “gói”enzyme Các gel có thể được hình thành từ các polymer tổng hợp như acrylamide, hydroxyethyl-2-metacrylate, tạo phức càng cua bằng ethyleneglycol-dimetacrylate, polyvinyl, polyuretan Enzyme được hoà tan hoặc phân tán trong một dung dịch monomer và sau đó trùng hợp trong sự có mặt của một hay nhiều tác nhân tạo phức càng cua Gel có thể cắt thành màng đặt trên một giá thể rắn, hoặc cũng có thể nghiền thành bột sau khi loại trừ nước Alginate và caraghenan lấy từ rong biển thường có khả năng tao gel rất tốt và thuận lợi để bao gói các enzyme hoặc tế bào nguyên vẹn

Các enzyme cũng có thể bị “nhốt” trong các lỗ nhỏ của các sợi tổng hợp.

Với cách này người ta cho dịch lỏng chảy bên trong sợi , do đó hạn chế được sự phân cực bề mặt và sự bịt lấp thường gặp với lớp màng

Một nhũ tương của cellulose triacetate trong methylene chlorua và enzyme trong dung dịch đệm có chứa glycerol được ép qua một khuôn lọc dưới áp suất nito Các sợi đi ra khỏi khuôn được nhúng vào một cái bể đông tụ có chứa toluel, sau đó được làm khô trong chân không

Các sợi này bền với acid yếu hoặc kiềm yếu, lực ion cao và chịu được một số dung môi hữu cơ Tuy nhiên phương pháp này chỉ thích hợp đối với những enzyme khó bị mất hoạt tính trong các dung môi không hoà lẫn với nước

Phương pháp gói enzyme trong các bao vi thể (microcapsul)

Enzyme được gói trong các bao vi thể có màng bán thấm được tạo ra từ các polymer có kích thước lỗ đủ nhỏ đẻ ngăn cản sự khuếch tán của enzyme ra ngoài và

đủ lớn đẻ cơ chất đi vào và sản phẩm phản ứng đi ra dễ dàng Có nhiều phương pháp gói enzyme trong microcapsul Sau đây là một trong các phương pháp đó Cho một dung dịch loãng chứa enzyme và monomer ưa nước trong một dung môi hữu cơ không hoà lẫn trong nước đễ tạo nhũ tương , sau đó thêm một monomer kỵ nước để gây phản ứng trùng hợp tạo ra một màng bao quanh những giọt lỏng nhỏ Thường phải thêm vào một tác nhân hoạt động bề mặt để làm bền nhũ tương cũng như để điều chỉnh các capsul có khích thước mong muốn từ 1 đến 100 μm

Phương pháp tiền polymer để gói các chất xúc tác sinh học Cố định enzyme bằng phương pháp này có những ưu điểm như sau:

 Quá trình gói rất đơn giản trong những điều kiện nhẹ nhàng

 Các chất tiền trùng hợp không chứa các monomer vốn có thể gây ảnh hưởng xấu đến enzyme đã được gói

 Cấu trúc lưới của gel có thể được điều chỉnh bằng cách dùng các tiền polymer có chiều dài chuổi bất kỳ

 Các tính chất hoá chất lý hoá của gel có thể dịnh hướng trước bằng cách chọn các tiền chất polymer thích hợp vốn đã được tổng hợp hoá học trong điều kiện vắng mặt enzyme Dưới đây là một ví dụ về phương pháp tiền polymer Đó là phương pháp tạo enzyme liên kết chéo giữa các tiền polymer bằng cách chiếu tia cực tím để gói enzyme

Khi chiếu tia cực tím gần lên dung dịch có chứa chất tiền polymer và enzyme thì

sẽ tạo ra các liên kết chéo giữa các gốc của tiền polymer và một gel được hình thành bao lấy enzyme Sự gói enzyme bằng phương pháp này có thể tiến hành ở điều kiện nhẹ nhàng, tránh được các thay đổi pH quá kiềm hoặc quá acid, thời gian lại rất nhanh, chỉ trong vòng từ 3-5 phút Với phương pháp này có thể gói enzyme, tế bào

vi sinh vật hoặc các bào quan

3.3 Cố định enzyme bằng phương pháp hấp thụ trên các chất mang

hoăc không có điện tích.

Với phương pháp này enzyme được hấp thụ trên các chất co hoạt tính bề mặt như than hoạt tính, cellulose, tinh bột ,dextran, collagen,…và một số nhựa trao đổi ion, silicagen, thuỷ tinh Trong trường hợp chất mang không có lổ enzyme được đính vào chất mang thành từng lớp trên bề mặt, khi chất mang có lỗ thì các phân tử enzyme sẽ xâm nhập vào trong các lỗ

4 Một số đặc tính của enzyme cố định

Việc cố định làm thay đổi đáng kể nhiều tính chất của enzyme như độ bền, tính đặc hiệu, đặc điểm động học Thông thường việc cố định làm tắng đáng kể độ bền của enzyme Ví dụ , cố định protease làm tăng đọ bền với nhiệt gấp chục nghìn lần Sau khi được cố định không những độ bền với nhiệt của enzyme tăng lên mà phạm vi nhiệt độ tối thích của enzyme cũng được mở rộng Nhiệt độ cao làm cho enzyme bị biến tính, cấu trúc bậc ba của enzyme bị phá vỡ và enzyme bị mất hoạt tính Khi enzyme được cố định nhờ nhiều liên kết gắn với chất mang quá trình biến tính sẽ bị ngăn cản, làm cho enzyem chịu được nhiệt độ cao

Trong trường hợp đối với các enzyme thuỷ phân protein, ví dụ papain và trysin

sự cố định làm ngăn cản một phần hoặc hoàn toàn hiện tượng tự phân Điều này rất

có ý nghĩa thực tế vì nó giúp làm tăng thời gian làm việc của enzyme

Một trong các nguyên nhân làm biến đổi tính chất của enzyme khi chúng được

cố định trên các chất mang có điện tích Ví dụ một chất trao đổi anion mang điện tích âm được bao quanh bởi một môi trường giàu proton, và vì thế pH trong các lớp nằm kế sát với cho đường cong phụ thuộc pH của hoạt tính enzyme cố định trên các chất mang anionit,cationit và trung tính sẽ khác nhau

5 Một số ứng dụng của enzyme trong sản xuất

5.1 Sử dụng aminoacylase cố định để sản xuất axitamin

Trong quá trình tổng hợp hoá học hay lên men ( sinh tổng hợp) để sản xuất các axit amin nhưng nhược điểm lớn nhất của phương pháp này cho ra các sản phẩm raxemic, tức là hổn hợp của 2 dạng đồng phân quang học D và L trong đó chỉ có

dạng L mới có hoạt tính sinh học cao ,có ý nghĩa trong khoa học hoá sinh Nếu sử dụng phương pháp hoá học hay kết hợp với sinh tổng hợp ( lên men 2 pha ) sẽ tốn kém, không khả thi.

Từ năm 1969 hãng tanabe Seizaku ( Nhật Bản ) sử dụng enzyme cố định amino acylaza ( AACD: enzyme đồng phân hoá chuyển từ dạng D sang dạng L của axit amin ) để chuyển hoá hổn hợp D,L axit amin Trong đó enzyme aminoacylase được

cố định trên DEAE Sephadex bằng liên kết ion với thời gian bán huỷ là 65 ngày ở

50oC

5.2 Sản xuất L-axit aspartic bằng enzyme asperza cố định

Là cơ chất trung gian của rất nhiều quá trình chuyển hoá hoá sinh tổng hợp các axit amin khác nhau rất quan trọng trong dinh dưỡng động vật và chế biến thực phẩm (sản xuất axit l-vacin, tổng hợp axit α-xetoglutamic( tiền chất để chuyển hoá thành axit l-glutamic )) Cơ chế hoá sinh của sự tạo thành axut aspartic là quá trình tạo liên kết đồng hoá trị giửa NH3 với axit fumaric bởi enzyme aspartic

Từ năm 1973, hãng TANABE SEIZAKY đã sử dụng tế bào có chứa enzyme

aspartaza (nòi vi khuẩn Brevibacterium flavum nuôi cấy trên môi trường rỉ đường

giàu biotin ) và gói nó trong gel polyacrylamit với bán chu kỳ hoạt động là 120 ngày

ở 37C

5.3 Thuỷ phân lactoza bằng enzyme lactaza cố định:

Lactoza là disaccarit có trong sữa nên được gọi là đường sữa Loại đường này có

độ ngọt ngào thấp ( bằng 30% với đường saccaroza ở cùng nồng độ),độ hoà tan kém ( gây nên hiện tượng sạn đường trong sữa), một bộ phận người sử dụng sữa không

có khả năng tiêu hoá hấp thụ được sữa này Mặt khác đường sữa hầu như được thải cùng với sữa nếu thuỷ phân lactoza để tạo thành 2 monosaccarit cấu thành nó là glucoza và galactose sẽ mang lại hiệu quả cao Lúc này sữa sẽ có chất lượng cao hơn, loại bỏ hiện tượng sạn sữa, nâng cao độ tiêu hoá, các monosaccarit sẽ được vi sinh vật sử dụng khi lên men sữa (các sản phẩm sữa chua và phomat ).

5.4 Sản xuất nhóm penicilin-axit 6 amino penicillinic (6-APA) bằng

enzyme cố định penicillinamidaza

Penicillin là một nhóm chất có tính kháng sinh, cấu tạo chung là: Với R là gốc axyl thì ta có penicillin G- là penicillin thương mại và sinh hoạt phổ biến nhất hiện nay

Enzyme penicillinamidaza xúc tác thuỷ phân benzyl penicillin (penicillin để tạo thành nhóm penicillin 6-APA và axit phenyl axetic

6-APA được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp dược phẩm để sản xuất các loại kháng sinh họ penicillin Hiện nay toàn bộ 6-APA của thế giới đều được sản xuất bằng phương pháp sử dụng enzyme penicillinamidaza cố định Đây là enzyme nội

bào khi sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Esterichia – coli, bacterium faecalic, alacaligus

với moi trường cazein thuỷ phân, cao ngô, glucoza, axit phelnylaxetic làm chất cảm ứng

Phương pháp gói enzyme của hãng SNAM Progetti (Italy) như sau :10 lít dung dịch penicillinamidaza pH=8 trộn với 5kg triaxetic xenlulose trong 71.4 kg clorimetylin ở 4C, lắc kỹ cho đến khi tạo gel cả các sợi mỗi kg sợi thành phẩm được nhồi trong các cột kích thước 43 x 14 cm 26 lit penicillin G( muối kali ) cho chảy liên tục qua cột ở pH=8.2 cho đến khi đạt mức chuyền hoá 97% 6 APA

Công nghệ của hãng TANABE SEIZAKU : sử dụng bioreactor tế bào cố định chứa penicillinamidaza trong gel polyacriamit như sau : dung dịch penicillin G 0.65M ở

pH = 8.5 cho chảy qua cột với tốc độ 0.12-0.14 thể tích cột/h Hiệu suất phản ứng đạt 80%

II/ Chất kháng sinh penicillin bán tổng hợp:

1 Lịch sử hình thành:

Các penicillin là đại diện tiêu biểu cho các kháng sinh có nguồn gốc từ nấm

mốc Ngoài ra còn có một vài kháng sinh khác như griseofulvin, trichotrxin, fumagillin… cũng được sinh ra từ các chủng nấm mốc khác nhau

Penicillin G là chất kháng sinh tiêu biểu được Alexander Flemming tìm ra đầu

tiên vào năm 1928 trong quá trình nghiên cứu về tụ cầu khuẩn Ông nhận thấy trên

hộp petri nuôi cấy tụ cầu khuẩn có nhiễm nấm mốc Pinicillin notatum và tạo vòng

vô khuẩn Flemming gọi chất ức chế tạo vòng vô khuẩn này là penicillin.

Sau đó, Mỹ đã triển khai lên men thành công penicillin theo phương pháp lên

men bề mặt (1931) Tuy nhiên, cũng trong khoảng thời gian đó mọi nỗ lực nhằm tách và tinh chế penicillin từ dịch lên men đều thất bại do không bảo vệ được hoạt tính kháng sinh của chế phẩm tinh chế và do đó vấn đề penicillin tạm thời bị lãng quên

Năm 1938 ở Oxford, khi tìm lại các tài liệu khoa học đã công bố, Ernst Boris Chain quan tâm đến phát minh của Fleming và ông đã đề nghị Howara Walter Florey cho tiếp tục triển khai nghiên cứu này

Ngày 25/05/1940 penicillin đã được thử nghiệm rất thành công trên chuột

Năm 1942, đã tuyển chọn được chủng công nghiệp Penicillium chrysogenum

NRRL 1951 (1943) và sau đó đã được biến chủng P Chrysogenum Wis Q - 176

(chủng này được xem là chủng gốc của hầu hết các chủng công nghiệp đang sử dụng hiện nay trên toàn thế giới ); đã thành công trong việc điều chỉnh đường hướng quá trình lên men để lên men sản xuất penicillin G (bằng sử dụng tiền chất Phenylacetic)

Năm 1943, penicillin được sản xuất ở qui mô công nghiệp ở Mỹ để phụ vụ các

bệnh nhiễm trùng cho thương binh trong chiến tranh trong thế giới thứ II

Penicillin cũng là chất kháng sinh đầu tiên được sản xuất lên men chìm ở qui mô

công nghiệp (1947)

Năm 1941, penicillin G là kháng sinh có hiệu quả cao chống lại hầu hết các

chủng Staphylococcus aureus Tuy nhiên đến đầu năm 1947 phần lớn các vi khuẩn

phân lập trong bệnh viện đều kháng lại penicillin Để giải quyết vấn đề này người ta

đã nổ lực tìm ra các penicillin mới có tác dụng đều trị tốt hơn Công nghệ sản xuất

penicillin bán tổng hợp bắt đầu được nghiên cứu.

2 Cấu tạo của penicillin:

Penicillin gồm nhiều loại, chúng có cấu tạo gần giống nhau, bao gồm một vòng thiazolidine, một vòng β-lactam, một nhóm amino gắn với CO2 và một mạch bên

( R) Tất cả các penicillin đều là dẫn suất của acid 6-aminopenicillanic Sự thay thế

R tạo nhiều acid amin khác nhau Hầu hết các peniciliin đều được phân phối dưới

dạng muối natri hoặc muối kali và có ý nghĩa trong điều trị cũng như trong thương

mại như penicillin G, penicillin V…

Cấu tạo chung của phân tử penicillin

 Nhóm lactam ở giữa 1760 và 1730 cm-1.

 Chức carboxyl ở khoảng giữa 1600 cm-1

 Nhóm chức amid ngoại vòng ở giữa 1700 và 1650 cm-1

Tính chất hóa học:

Các penicillin có khả năng tạo muối natri và kali tan trong nước, trong khi đó các muối kim loại nặng ( vi dụ muối Cu2+) thì không tan hoặc kích thích sự phân hủy Các penicillin cũng có khả năng tạo muối với các amin:

 Tạo các penicillin thủy giải chậm ( tác động trễ) như procain penicillin ( tác động kéo dài từ 24 – 48h), benethamin penicillin ( tác động kéo dài thừ 3 – 7 ngày), benzathin penicillin ( tác động kéo dài 2 – 4 tuần)

 Một số có tính base ví dụ các aminosid, các alkaloid khi trộn chung với penicillin trong cùng một ống tiêm sẽ gây ra kết tủa

 Các penicillin cũng có khả năng tạo ra các este, sẽ là những tiền chất có khả năng phóng thích các kháng sinh này trong invivo

Tính không bền của vòng beta lactam:

Sự phân hủy trong môi trường kiềm: ở pH = 8 sẽ có sự tần công của ion OH- trên carbonyl lactam gây ra sự mở vòng theo qui luật chung, cuối cùng sẽ có sự tạo thành acid penicilloic, nhưng sự decarboxyl có thể xảy ra tiếp theo để tạo acid peniloic

Nếu trong môi trường có sự hiện diện của những muối kim loại nặng ( Zn2+,

Cd2+, Pb2+ hoặc Hg2+) sẽ làm cho acid peniciloic bị phân hủy thành carbinolamin không bền, chất này sẽ tiếp tục bị phân hủy tạo D-penicillamin và acid penaldic Acid penaloic đền lượt nó có thể bị decarboxyl hóa để trở thành penicillo-aldehyd

Sự alcol phân và amino phân: vòng beta lactam nhạy với một số tác nhân ái nhân khác với xúc tác của các ion kim loại nặng: Cu2+, Zn2+, Sn2+.

Sự phân hủy trong môi trường acid: dưới sự hiện diện của ion H+, sự tần công ái điện tử trên nguyện tử S, kích thích sự mở vòng lactam và vòng thiazolidin, tiếp theo là sự tái sắp xếp để tạo thành cấu trúc oxazolic cua acid penicillenic Cuối cùng, nếu môi trường quá acid có thể tạo thành acid penillic