Quy trình sản xuất kháng huyết thanh chẩn đoán lỵ trực khuẩn

Vật liệu

- Nước muối sinh lý 8,5‰, nước thịt ẵ, nước bao tử thủy phõn, Cụng ty Vắc xin Pasteur Đà Lạt sản xuất. - Lam kính, đèn cồn, que cấy, kẹp inox, găng tay cao su, giấy thấm, gòn không thấm nước, gòn thấm nước.

Phương pháp

- Chọn khuẩn lạc điển hình của từng nhóm Shigella trên môi trường thạch dinh dưỡng cấy chuyền vào các ống môi trường canh thang 7,2 và ủ 37oC trong 18 giờ. - Từ canh khuẩn của từng nhóm Shigella, lấy 0,5ml canh khuẩn cho vào môi trường canh thang 7,2 đã bổ sung các loại đường, hai ống trên mỗi loại đường và để hai ống đối chứng (không cho canh khuẩn vào). Ủ các ống môi trường thạch kiểm tra ở nhiệt độ 35oC - 37oC để phát hiện vi khuẩn hiếu khí và vi khuẩn kỵ khí, hai ống môi trường thioglycolate ủ ở nhiệt độ 22oC - 25oC để phỏt hiện nấm mốc.

+ Đối với dung dịch kiểm tra là vi khuẩn sống: Trên môi trường thạch 7,2 vi khuẩn mọc đều, không phát hiện có sinh vật lạ mọc và trên môi trường thioglycolate môi trường đục đều, không phát hiện thấy nấm hay vi sinh vật lạ thì đạt vô trùng. + Đối với dung dịch kiểm tra là dịch vô khuẩn: Trên môi trường thạch 7,2 không phát hiện có sinh vật mọc và trên môi trường thioglycolate không bị vẩn đục hoặc đổi màu thì đạt vô trùng. + Kháng huyết thanh mẫu chỉ tạo ngƣng kết thành hạt với các ngƣng kết nguyên đặc hiệu tương ứng, còn lại chỉ tạo thành một hỗn dịch màu trắng đục.

- Nhân chủng: Chủng Shigella được hoàn nguyên với nước muối sinh lý sau đó cấy vào môi trường thạch LB trong ống nghiệm 22mm láng đều khắp bề mặt, ủ ở nhiệt độ 37oC/18 giờ. + Đọc kết qủa kiểm tra vô trùng và chọn những hộp Roux không bị tạp nhiễm, cho nước muối sinh lý vào mỗi hộp Roux và lắc nhẹ làm bong hết các khuẩn lạc mọc trên bề mặt môi trường tạo thành huyền dịch đồng nhất. - Dùng pippet hút 0,1ml kháng nguyên cho vào ống thủy tinh chuẩn, thêm từ từ nước muối sinh lý vào đồng thời lắc nhẹ cho đến khi độ đục của ống kiểm tra có cùng độ đục với ống chuẩn thì dừng lại.

+ Người thứ hai dùng cồn - iốt sát trùng mặt ngoài tai thỏ, sau đó đưa kim có chứa kháng nguyên chính xác vào tĩnh mạch, hút nhẹ cho máu vào kim tiêm, người thứ nhất thả tay ra và người thứ 2 từ từ bơm kháng nguyên vào. + Người thứ 2 dùng ngón tay trỏ nâng động mạch cảnh lên, còn tay kia nhanh chóng đƣa chính xác kim đã gắn với dây silicon đƣợc nối với hộp Roux vào động mạch cảnh, người thứ 3 thả dây giữ động mạch ở trên để máu chảy vào hộp theo áp lực. Để loại trừ kháng thể không đặc hiệu trong huyết thanh ta sử dụng một lƣợng kháng nguyên của những chủng không cùng nhóm huyết thanh cho vào huyết thanh thô với một lƣợng vừa đủ và lắc đều để đảm bảo cho sự tiếp xúc giữa kháng thể và kháng nguyên.

- Hiệu giá kháng thể đƣợc tính đến nồng độ kháng huyết thanh pha loãng nhiều nhất mà ở đú cũn thấy rừ kết tủa lắng tạo thành hỡnh dự ở đỏy ống nghiệm. Trung bình cộng (X ), trung bình nhân hiệu giá kháng thể (X Geo), độ lệch chuẩn, giá trị td theo các phương pháp thống kê trong nghiên cứu y học và phần mềm Microsoft Execel 7.0.

KẾT QỦA VÀ BÀN LUẬN

• Kết qủa khảo sát một số đặc tính sinh học của chủng Shigella 1. Kết quả khảo sát hình dạng khuẩn lạc và hình thái tế bào
• Nghiên cứu quy trình sản xuất kháng nguyên
• Nghiên cứu quy trình gây miễn dịch và tinh sạch huyết thanh 1. Ảnh hưởng của liều kháng nguyên đến đáp ứng miễn dịch

- Chủng Shigella flexneri HN1 tạo ngƣng kết nhiều (+++), rừ ràng và nhanh trong vòng 1 phút với kháng huyết thanh mẫu nhóm B, không tạo ngƣng kết với kháng huyết thanh mẫu nhóm A, C và D khi nhìn bằng mắt thường. - Chủng Shigella sonnei 285 tạo ngƣng kết nhiều (+++), rừ ràng và nhanh trong vòng 2 phút với kháng huyết thanh mẫu nhóm D, không tạo ngƣng kết với kháng huyết thanh mẫu nhóm A, B và C khi nhìn bằng mắt thường. Shigella dysenteriae SG, Shigella flexneri HN1, Shigella boydii 116 và Shigella sonnei 285 nhận từ viện Pasteur Paris – Pháp là các chủng tạo ngƣng kết đặc hiệu với kháng huyết thanh mẫu cùng nhóm, không gây phản ứng chéo với các nhóm huyết thanh khác.

Trong khi đó, bất hoạt kháng nguyên bằng nhiệt (100oC/2 giờ) thu khỏng nguyờn cú tớnh đặc hiệu cao, ngƣng kết nhiều và rừ ràng (+++) với khỏng huyết thanh mẫu Shigella dysenteriae, thời gian ngƣng kết chỉ có 1 phút. Trong khi đó, bất hoạt kháng nguyên bằng nhiệt (100oC/2 giờ) thu kháng nguyờn cú tớnh đặc hiệu cao, ngƣng kết nhiều và rừ ràng (+++) với khỏng huyết thanh mẫu Shigella flexneri, thời gian ngƣng kết chỉ có 1 phút. - Khi gây miễn dịch thỏ với kháng nguyên Shigella dysenteriae (nhóm A) liều 5.109 tbvk, trung bình nhân hiệu giá kháng thể khi phối hợp kháng nguyên với tá chất TiterMax đạt 1/4064 cao hơn so với tá chất Freund 1/2560.

- Khi gây miễn dịch thỏ với kháng nguyên Shigella boydii (nhóm C) liều 5.109 tbvk, trung bình nhân hiệu giá kháng thể khi phối hợp kháng nguyên với tá chất TiterMax đạt 1/5120 cao hơn so với tá chất Freund 1/3225. - Khi gây miễn dịch thỏ với kháng nguyên Shigella sonnei (nhóm D) liều 5.109 tbvk, trung bình nhân hiệu giá kháng thể khi phối hợp kháng nguyên với tá chất TiterMax đạt 1/5120 cao hơn so với tá chất Freund 1/3225. Chẳng hạn kháng nguyên não mô cầu khi đƣợc bổ sung tá chất Freund toàn phần đã làm tăng đáp ứng miễn dịch và kết qủa là hiệu giá kháng thể tăng lên 2 lần so với khi kháng nguyên không đƣợc phối hợp với Freund; đáp ứng miễn dịch của ho gà đã gia tăng khi phối hợp chúng với tá chất hydroxyt nhôm [9][16].

+ Khỏng huyết thanh Shigella dysenteriae tạo đƣợc ngƣng kết nhiều rừ ràng (+++) và nhanh với kháng nguyên của chủng Shigella nhóm A thấy đƣợc bằng mắt thường, nhưng vẫn còn tạo ngưng kết chéo (+) với các kháng nguyên của chủng Shigella thuộc nhóm B và D. + Khỏng huyết thanh Shigella flexneri tạo đƣợc ngƣng kết nhiều rừ ràng (+++) và nhanh với kháng nguyên của chủng Shigella nhóm B thấy được bằng mắt thường, nhƣng vẫn còn tạo ngƣng kết chéo (+) với các kháng nguyên của chủng Shigella thuộc nhóm A và C. + Khỏng huyết thanh Shigella boydii tạo đƣợc ngƣng kết nhiều rừ ràng (+++) và nhanh với kháng nguyên của chủng Shigella nhóm C thấy được bằng mắt thường, nhƣng vẫn còn tạo ngƣng kết chéo (+) với các kháng nguyên của chủng Shigella thuộc nhóm A, B và D.

+ Tương tự với khỏng huyết thanh Shigella sonnei tạo được ngưng kết nhiều rừ ràng (+++) và nhanh với kháng nguyên của chủng Shigella nhóm D thấy đƣợc bằng mắt thường, nhưng vẫn còn tạo ngưng kết chéo (+) với các kháng nguyên của chủng Shigella thuộc nhóm A, B và C. - Hoặc dùng kháng nguyên đậm độ 7.109 tbvk để hấp phụ kháng huyết thanh Shigella thu được tạo ngưng kết không nhiều (++) thấy được bằng mắt thường với kháng nguyên của chủng Shigella thuộc nhóm A hoặc nhóm C hoặc nhóm D và chúng không tạo ngƣng kết với các chủng thuộc nhóm khác. - Cũng với lƣợng kháng nguyên hấp phụ là 7.109 tbvk nhƣng với kháng huyết thanh Shigella flexneri, lƣợng kháng thể không bị loại bỏ nhiều và vẫn tạo đƣợc ngƣng kết nhiều rừ ràng đặc hiệu (+++) thấy được bằng mắt thường với khỏng nguyờn của chủng Shigella thuộc nhóm B.

Để thu đƣợc kháng huyết thanh đặc hiệu nên dùng đậm độ kháng nguyên 5.109 tbvk để hấp phụ loại bỏ kháng thể không đặc hiệu vừa đạt yêu cầu về chất lƣợng vừa có hiệu qủa kinh tế vì không sử dụng thừa kháng nguyên gây tốn kém cho nhà sản xuất.